Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist. Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung. Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben. IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben. Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt. / Infertility treatments by assisted reproductive technologies (ARTs) are associated with an increased incidence of epigenetic aberrations during gametogenesis and early embryo-genesis, specifically in imprinted genes. In vitro-maturation (IVM) of oocytes is an ART which is routinely applied for reproduction of agriculturally and economically important species like cattle (Bos taurus). However, IVM oocytes exhibit a reduced developmental competence to the blastocyst stage which may be caused by an impaired epigenetic regulation. Of all known epigenetic mechanisms DNA-methylation is the most studied DNA-modification. In this thesis, bovine oocytes have been analyzed in order to investigate the impact of IVM on the DNA-methylation of imprinted and non-imprinted genes. Because this species exhibits a similar preimplantation development and gestation length as humans, it is increasingly being used as a model for human germ-cell and embryo development. In contrast to humans and mice, only little information on bovine imprinted genes is available. Thus, the first attempt of the research presented here was to identify and characterize the bovine differentially methylated regions (DMRs) of the three imprinted loci, namely IGF2/H19, SNRPN and PEG3 which are each associated with imprinting defects in humans and/or the mouse model. The first description of several intergenic DMRs by bisulfite sequencing and pyrosequencing proved the existence of an intergenic IGF2/H19 imprinting control region (ICR) in the bovine. The imprinted status of the IGF2/H19-ICR as well as the bovine genes SNRPN and PEG3 was confirmed by differential methylation consistent with genomic imprinting in placental and somatic bovine tissues, in sperm and parthenogenetic embryos. Limiting Dilution (LD) Bisulfite Sequencing (El Hajj et al., 2011) followed by direct bisulfite sequencing allows the analysis of methylation profiles of individual alleles (DNA molecules) from only a few or even single cells. In a first approach using LD, the three characterized imprinted regions were analyzed to determine putative epigenetic alterations in bovine oocytes cultured with different types of IVM conditions and media (TCM and mSOF). The total rate of individual CpG and entire allele methylation errors did not differ significantly between the two IVM and the in vivo group, indicating that current IVM protocols have no or only marginal effects on these critical epigenetic marks. The developmental capacity of IVM oocytes from prepubertal calves is reduced compared with their IVM oocyte counterparts from adult animals. Therefore, in a second LD approach, the promoter methylation of three developmentally important, non-imprinted genes (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) has been studied in IVM oocytes from prepubertal cattle after ovarial stimulation with FSH and/or IGF1. Both immature and in vitro matured prepubertal and adult oocytes showed unimpaired hypomethylation of the three gene promoters without differences between the different ages of donors and treatments. Thus, neither age nor hormonal treatment or IVM seem to influence the methylation status of these three genes. In conclusion, the reduced developmental capacity of IVM oocytes from adult and prepubertal cattle were not associated with aberrant methylation patterns of the investigated imprinted and non-imprinted genes suggesting a general stability of established DNA-methylation marks in oocytes. Therefore, epigenetic mechanisms other than DNA-methylation such as ncRNAs or histone modifications might confer to the reduced developmental competence of prepubertal and IVM oocytes. These factors are supposed to interfere with cytoplasmic maturation of the oocyte leading to an impaired development of the zygote and embryo rather than to influence nuclear maturation of the oocyte.

Endotoxin-tolerante Zellen zeigen über mehrere Tage eine verminderte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine, sodass epigenetische Veränderungen ein Grund für die Endotoxintoleranz sein könnte. Im 1. Teil wurden epigenetische Veränderungen an gezielten LPS-tolerisierbaren Genen mithilfe eines in-vitro-Modells mit humanen Monozyten untersucht. Die Gene kodierend für TNF und CXCL10 zeigten eine Reduktion der transkriptionsaktivierenden Histonmarker H3K27ac und H4ac, die durch eine stark reduzierte Genexpression in toleranten Monozyten begleitet wurde. Demgegenüber wiesen Gene wie IL6 und IL1B eine Zunahme an H4ac und H3K27ac auf, während ihre Genexpression in widersprüchlicher Weise reduziert war. Repressive epigenetische Marker (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA-Methylierung) konnten in den untersuchten Genen nicht nachgewiesen werden. Zudem war die IL6-Genexpression verstärkt abhängig von der Signaltransduktion toleranter Monozyten, was auf unterschiedliche Repressionsmechanismen schließen lässt. Im 2. Teil konnte gezeigt werden, dass die genomweite transkriptionelle Reprogrammierung durch eine globale Verschiebung von aktiven H3K27ac und H4ac in naiven Monozyten zu repressiven H3K9me2, H3K27me3 und H4K20me3 in toleranten, restimulierten Zellen einherging. Mehr als 10000 Genombereiche wiesen Veränderungen an Histonmarkern auf, obwohl nur 3638 Gene unterschiedlich exprimiert waren. Circa 27% der differentiell exprimierten Gene zeigten ein Expressionsmuster, welches mit Veränderungen an aktiven und/oder repressiven Markern innerhalb der Promoterregion korrelierte. Zudem zeigten intergenische Regionen einen verstärkten Anstieg an repressiven Histonmarkern, was auf eine mögliche regulatorische Funktion dieser Bereiche in der Endotoxintoleranz schließen lässt. Die Studie zeigt, dass die Epigenetik der Monozyten stark von der Endotoxintoleranzinduktion betroffen ist, wenn auch nicht alle Veränderungen dem beobachteten Genexpressionsmuster zugeordnet werden konnten. / Endotoxin-tolerant cells show a reduced ability to produce pro-inflammatory cytokines for several days, which assumes an impact of epigenetic changes in endotoxin tolerance induction. Using an in vitro model with human monocytes, the first part focused on the analysis of epigenetic changes in specific LPS-tolerizable genes. The genes encoding for TNF and CXCL10 showed a reduction in the transcription-activating histone marks H3K27ac and H4ac in tolerant monocytes, which was accompanied by a strongly reduced gene expression. In contrast, the IL6 and IL1B genes showed an increase in activating histone modifications, while their gene expressions were moderately reduced. Repressive epigenetic marks (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA methylation) were not specifically enhanced in the genes studied. Particularly the IL6 gene expression was more susceptible to the signaling strength in tolerant monocytes implying distinct mechanisms in the repression of the genes analyzed. Within the second part, genome-wide reprogramming of tolerant monocytes was accompanied by a global shift from activating H3K27ac and H4ac in naive monocytes to repressive H3K9me2, H3K27me3 and H4K20me3 in tolerant cells treated with LPS. More than 10000 genomic regions were distinctly regulated by histone marks, though only 3638 genes were differentially expressed. Correlation analyses identified 27 % of the differentially expressed genes that showed a transcriptional level consistent with changes in activating and/or repressive histone marks within their promoter regions. Intergenic regions were highly enriched for repressive histone marks in LPS-tolerant monocytes implying a regulatory function in endotoxin tolerance. The data indicate that the epigenetic environment of monocytes is highly affected by endotoxin tolerance induction, though not all changes are directly linked to the gene expression pattern observed.

DNA Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, welcher entscheidend an der Organisation von Genregulation beteiligt ist. Dieser Vorgang ist wichtig für die Funktion sowohl von embryonalen als auch von Gewebs-Stammzellen. Krebszellen weisen häufig veränderte DNA Methylierungsmuster auf, was auf eine ähnlich wesentliche Rolle der DNA Methylierung in Krebsstammzellen (KSZ) hindeutet. Diese These wurde hier mit Hilfe eines Mausmodells mit verringerter Expression der DNA Methyltransferase Dnmt1 anhand verschiedener Leukämiemodelle untersucht. In einem bi-linearen B-lymphatischen/myeloischen Leukämiemodell konnte gezeigt werden, dass hypomethylierte leukämieinitiierende (Stamm-)zellen (LSZ) myeloische Krebszellen hervorbringen, allerdings nicht zur Bildung von B-lymphatischen Leukämiezellen befähigt sind. Darüber hinaus konnte in einem T-Zell-spezifischen Leukämiemodell gezeigt werden, dass reduzierte Dnmt1 Expression nicht mit der Bildung von T-Zelllymphomen vereinbar ist. Detaillierte Analysen eines myeloischen Leukämiemodells ergaben, dass hypomethylierte LSZs ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial aufweisen. Im Gegensatz zu den starken Funktionseinschränkungen hypomethylierter LSZs, hatten hypomethylierte Knochenmarks-Stromazellen keinen Effekt auf die Entwicklung von Leukämien. Außerdem führte die Behandlung leukämischer Zellen mit demethylierenden Agenzien zu einer teilweisen Aufhebung methylierungsvermittelter Genrepression. Die dadurch verstärkte Expression von Differenzierungsfaktoren verminderte das Leukämiewachstum, was einen möglichen Erklärungsansatz für das eingeschränkte Potenzial hypomethylierter Leukämien darstellt. Diese Ergebnisse demonstrieren eine zentrale Rolle der DNA Methylierung für die Selbsterneuerung und Linienwahl von LSZs, und erlauben somit neue Einblicke in die epigenetische Regulation von KSZs. Diese Erkenntnisse implizieren, dass KSZs möglicherweise ein geeignetes Ziel für epigenetische Therapieansätze darstellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic processes which is crucially involved in orchestrating gene regulation primarily by repression of gene expression. DNA methylation plays an important role in controlling functional programs of embryonic and tissue stem cells. As altered DNA methylation patterns are a hallmark of cancer, we hypothesized that DNA methylation might be equally important for cell fate determinations of cancer stem/initiating cells (CSC). To test this, I analyzed a genetic knockdown mouse model of the main somatic DNA methyltransferase Dnmt1 in the context of three different leukemia models. In a bilinear B-lymphoid/myeloid leukemia model hypomethylated bi-potential leukemia stem/initiating cells (LSCs) were shown to be capable of forming a myeloid leukemia, whereas the generation of B-lymphoid blasts was almost entirely abrogated. Moreover, failure of hypomethylated cells to develop T-cell lymphomas in a Notch1-based leukemia model demonstrated their profound lack of T-lineage commitment capacities. Furthermore, detailed analyses of a myeloid leukemia model revealed a severely impaired self-renewal potential in LSCs with reduced Dnmt1 expression. However, contrasting the drastic cell-intrinsic impairments of LSC function by reduced DNA methylation, leukemia development was found to be unaffected by hypomethylated bone marrow stroma. Mechanistically, treatment of cell lines with a demethylating drug led to enhanced expression of differentiation factors due to loss of methylation mediated gene silencing. This was followed by inhibition of leukemia cell growth, thus providing a potential mechanism for impaired functions of hypomethylated leukemias. Collectively, this thesis revealed a critical role for DNA methylation levels in malignant self-renewal and lineage fate choices. These new insights into epigenetic regulation of CSCs suggest that epigenetic therapy displays a potential treatment concept specifically targeting CSCs.

Das Prostatakarzinom (PCa) ist die häufigste Krebsneuerkrankung und die zweithäufigste Krebstodesursache des Mannes in Deutschland. Die etablierten Tumormarker führen aufgrund ihrer unzureichenden diagnostischen Sensitivität und Spezifität zu Überdiagnosen mit folglich unnötigen Prostatabiopsien und den damit verbundenen klinischen Komplikationen. Darüber hinaus kann die derzeitige PSA-basierte Screeningpraxis nicht zuverlässig zwischen indolenter Erkrankung und therapienotwendigem Krebs unterscheiden. Auf DNA-Methylierung basierende Biomarker haben ein erhebliches Potenzial für die klinisch-chemische Labordiagnostik sowohl als tumorspezifische Biomarker für die Früherkennung oder posttherapeutische Überwachung von Krebs als auch als prognostische und prädiktive Biomarker für die therapeutische Stratifizierung. In dieser Arbeit erfolgte die Entwicklung neuer krebsspezifischer Methylierungs-Biomarker unter Anwendung OBBPA-ddPCR-basierter Assays. Diese neue Methode ermöglicht die Identifizierung geringster Mengen methylierter zellfreier-Tumor-DNA vor einem hohen Hintergrund von unmethylierter Wildtyp-DNA in Form einer minimal invasiven Blutprobenentnahme (liquid biopsy). Die Methylierungs-Biomarker beruhen auf Gensequenzen, welche zwischen gesunden Probanden und Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und PCa signifikante Methylierungsunterschiede aufweisen. Die Methylierungs-Biomarker RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1 und NRIP3, welche eine hohe diagnostische Sensitivität bei hoher diagnostischer Spezifität aufweisen, wurden zu einem Marker-Panel kombiniert. Anschließend wurde die Eignung dieses Panels als diagnostische Tumormarker in einer weiteren Probenserie validiert. Die Proben der Optimierungs- und Validierungsprobenserie beruhten auf Serumproben von 52 gesunden Probanden, sechs BPH-Patienten und 43 PCa-Patienten. Dabei erreichte das Biomarker-Panel eine diagnostische Sensitivität von 81,40 % bei einer diagnostischen Spezifität von 100 %. Die Methylierungsanalyse der cfDNA könnte deshalb als sinnvolles Hilfsmittel, ergänzend zur PSA-Bestimmung im Serum, bei der PCa-Frühdiagnose eingesetzt werden. Außerdem legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass die Anzahl der methyliert vorliegenden epigenetischen Biomarker des Panels als prognostischer Parameter sowie zur Verlaufskontrolle und Risiko-Stratifizierung der Tumorerkrankung dienen könnte. Um diese Daten zu bestätigen und das Potenzial der cfDNA-Methylierungsanalyse weiter einschätzen zu können, bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen mit größerer Stichprobenanzahl, verbesserter Präanalytik und größeren Probenvolumen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben / Prostate cancer (PCa) is the most common newly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer-related deaths among men in Germany. The insufficient diagnostic sensitivity and specificity of established tumor markers, lead to overdiagnosis, resulting in unnecessary prostate biopsies and associated clinical complications. Furthermore, the current PSA-based screening practice cannot reliably distinguish between indolent disease and clinically significant cancer. DNA methylation-based biomarkers have significant potential for clinical laboratory diagnostics, both as tumor-specific biomarkers for early detection or post-therapeutic monitoring of cancer, and as prognostic and predictive biomarkers for therapeutic stratification. This study aimed to develop novel cancer-specific methylation biomarkers using OBBPA-ddPCR-based assays. This new method enables the identification of minute amounts of methylated cell-free tumor DNA amidst a high background of unmethylated wild-type DNA, using a minimally invasive blood sample collection (liquid biopsy). The methylation biomarkers are based on gene sequences that exhibit significant methylation differences between healthy individuals and patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) and PCa. The methylation biomarkers RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1, and NRIP3, which demonstrate high diagnostic sensitivity with high diagnostic specificity, were combined into a marker panel. Subsequently, the suitability of this panel as diagnostic tumor marker was validated in an additional series of samples. The optimization and validation sample series consisted of serum samples from 52 healthy individuals, six BPH patients, and 43 PCa patients. The biomarker panel achieved a diagnostic sensitivity of 81.40% with a diagnostic specificity of 100%. Therefore, the methylation analysis of cfDNA could serve as a valuable addition to serum PSA determination in the early diagnosis of prostate cancer. Additionally, the results of this study suggest that the number of hypermethylated epigenetic biomarkers of the selected panel could serve as a prognostic parameter, as well as for disease monitoring and risk stratification. However, further investigation with larger sample sizes, improved pre-analytical procedures, and larger sample volumes is needed to confirm these findings and assess the potential of cfDNA methylation analysis.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben

DNA methylation is an essential epigenetic feature for the regulation and maintenance of heterochromatin. Satellite DNA is a repetitive sequence component that often occurs in large arrays in heterochromatin of subtelomeric, intercalary and centromeric regions. Knowledge about the methylation status of satellite DNA is important for understanding the role of repetitive DNA in heterochromatization. In this study, we investigated the cytosine methylation of the ancient satellite family pEV in the wild beet Beta procumbens. The pEV satellite is widespread in species-specific pEV subfamilies in the genus Beta and most likely originated before the radiation of the Betoideae and Chenopodioideae. In B. procumbens , the pEV subfamily occurs abundantly and spans intercalary and centromeric regions. To uncover its cytosine methylation, we performed chromosome-wide immunostaining and bisulfite sequencing of pEV satellite repeats. We found that CG and CHG sites are highly methylated while CHH sites show only low levels of methylation. As a consequence of the low frequency of CG and CHG sites and the preferential occurrence of most cytosines in the CHH motif in pEV monomers, this satellite family displays only low levels of total cytosine methylation.

AREG und EREG sind Liganden des EGFR, deren Expression mit einem positiven EGFR-zielgerichtetem Therapieansprechen in Darmkrebs korreliert. Ziel dieser Arbeit war es, einen epigenetischen Einfluss auf die AREG und EREG Expression zu klären. Es wurde gezeigt, dass AREG und EREG in verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien differenziell exprimiert sind, und dass die Expression beider Gene durch epigenetische Inhibitoren erhöht werden kann. Eine Analyse in fünf Zelllinien zeigte jedoch, dass die Promotoren beider Gene hauptsächlich unmethyliert vorlagen. Hingegen wurden kurze Regionen im Gen als differentiell methyliert identifiziert. Im AREG Gen liegt diese Region im Exon 2, was auf einen ungewöhnlichen Regulationsmechanismus hindeutet. Promotorfunktionsanalysen zeigten dann, dass diese Region eine methylierungs- und orientierungsabhängige Promotorfunktion hat, in die das MDB-Protein CTCF involviert sein könnte. Expressionsanalysen wiesen darauf hin, dass auch ZBTB33, ein anderes MDB-Protein, in die AREG Regulation involviert sein könnte. Die ZBTB33 Expression korrelierte negativ mit der AREG Expression in den Zelllinien. Eine ZBTB33-Bindungsstelle konnte ausserdem bioinformatorisch im AREG Exon 2 identifiziert werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass die Behandlung der Zelllinie LIM1215 mit HDAC Inhibitoren in vitro zu einer Erhöhung der Sensitivität gegenüber EGFR-zielgerichteten Medikamenten führt, begleitet von einer Erhöhung der AREG und EREG Expression. Im in vivo Versuch konnte die Sensitivität von LIM1215 Zellen durch die Behandlung mit DNMT Inhibitoren erhöht werden. Begleitet wurde dies hier mit einer Verringerung der Methylierung der AREG und EREG intragenischen CpGs. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass Patienten, die resistent gegenüber EGFR-zielgerichteten Therapien sind, möglicherweise sensitiv gemacht werden können. In dem Fall könnten AREG und EREG als prädiktive Marker eingesetzt werden, um den Effekt der epigenetischen Inhibitoren zu evaluieren. / AREG and EREG are ligands of the EGFR whose expression correlates with a positive EGFR-targeted therapy response in colorectal cancer. Aim of this work was to define the influence of epigenetic mechanisms on AREG and EREG gene expression. It could be shown that AREG and EREG are differentially expressed in a set of colorectal cancer cell lines and that the expression of both genes increases after treatment with epigenetically interfering compounds such as DNMT inhibitors and HDAC inhibitors. Methylation analysis showed that the promoters of both genes were mainly unmethylated. Nevertheless, short intragenic regions were identified to be differentially methylated. For AREG, this region is located within exon 2, indicating an uncommon epigenetic regulatory mechanism. Promoter function analyses showed that the AREG exon 2 region harbor methylation- and orientation dependent promoter function and they suggested CTCF, an MDB-protein, to be involved in this mechanism. Expression analysis experiments suggested also ZBTB33, another MDB-protein, to be involved in AREG regulation. ZBTB33 was differentially expressed in the cells and it correlated inversely with the AREG expression. Additionally, bioinformatic analyses identified a ZBTB33 binding site within AREG exon 2. It was also shown in this work that LIM1215 cells treated with HDACis were more sensitive towards EGFR inhibitors in vitro. This effect was accompanied by an increased AREG and EREG expression. In vivo, an increased sensitivity towards EGFR inhibitors was achieved in LIM1215 cells by treatment with a DNMT inhibitor. Here the effect was accompanied by a reduced methylation within the AREG and EREG intragenic CpGs. Together, the results suggested a new possibility to potentially make EGFR-targeted therapy resistant patients suitable for this therapy by epigenetic compound treatment. In that case AREG as well as EREG might be predictive markers to evaluate the effect of the epigenetic compounds during therapy.

Adipositas ist eine polymorphe chronische Erkrankung mit epidemischer Prävalenz. Im katabolen Leptin-Melanocortin-Signalweg ist das Proopiomelanocortin Gen (POMC) ein zentrales Element, das bei Dysfunktion massive Adipositas bewirken kann. Auch eine kürzlich identifizierte intragenische Methylierungsvariante des POMC wurde mit Adipositas assoziiert und deutet somit auf eine mögliche epigenetische Modulation des Gewichtsphänotyps hin. Zur Aufklärung der Relevanz, Stabilität und Entwicklung dieser epigenetischen Modifikation wurden die Funktionalität, Ontogenese und Phylogenese der POMC DNA-Methylierung untersucht. In vitro Analysen zeigten DNA-Methylierungsabhängige Promoteraktivität beider CpG-Inseln (CGIs) des POMC. Diese hier erstmals beschriebene Transkriptionsaktivität der intragenischen CGI weist auf einen alternativen Promoter des POMC hin. Hinsichtlich der Ontogenese konnten in Mensch und Maus postnatal stabile DNA-Methylierungsmuster mit interindividueller Konservierung für beide CGIs des POMC identifiziert werden. Zusätzlich erwiesen sich Gewebeunabhängigkeit der DNA-Methylierungsmuster und ihre pränatale Ausbildung zwischen dem Blastocystenstadium und der frühen Organogenese in der Maus. Die POMC DNA-Methylierungsmuster upstream des Exon3 unterscheiden sich in Mensch und Maus. Der mögliche Einfluss von primatenspezifischen Alu-Elementen im Intron2 des POMC hierauf wurde in verschiedenen Primatenfamilien analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine bedingte Assoziation der Alu-Elemente mit der DNA-Methylierung in der entsprechenden Region, lassen jedoch auch weitere Einflussfaktoren vermuten. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass die POMC DNA-Methylierung artspezifisch konserviert ist und in der frühen Embryogenese, vermutlich Alu-abhängig, ausgebildet wird. Dabei könnten stochastische Variationen der DNA-Methylierung die POMC-Aktivität beeinflussen und somit das Risiko für Adipositas erhöhen. / Obesity is a polymorphic chronic disease with epidemic prevalence. Within the catabolic leptin-melanocortin signaling pathway pre-proopiomelanocortin (POMC) is a pivotal element. Dysfunction of POMC, e.g. due to mutations, can cause severe obesity. Moreover, a recently identified intragenic methylation variant of POMC was found to be associated with obesity. Therefore, this indicates potential epigenetic modulation of the weight phenotype. To gain further insight into the relevance, stability, and origin of this epigenetic modification, the functionality, ontogenesis, and phylogenesis of the POMC DNA methylation patterns were analyzed. In vitro analyses revealed DNA methylation-dependent promoter activity of both CpG islands (CGIs) of POMC. Thereby, the intragenic CGI was identified as a potential alternative promoter of POMC, which has not been described before. Regarding the ontogenesis, postnatally stable POMC DNA methylation patterns with interindividual conservation were detected for both CGIs in humans and mice. In addition, it was observed that the POMC DNA methylation patterns are non-tissue-specific, stable upon long time administration of a high fat diet, and develop prenatally between the blastocystal stage and the early organogenesis. The POMC DNA methylation pattern upstream of exon3 differs in humans and mice. A possible influence of primate-specific Alu elements within the intron2 region of POMC was analyzed in various primate families. Results evince a partial association of the Alu elements with the DNA methylation pattern in this particular region, but also suggest an influence of additional factors. Overall, this work demonstrates that DNA methylation of the POMC locus is species-specific highly conserved, and that it is established during early embryogenesis, possibly Alu-triggered. In the course of this, stochastic variances of the POMC DNA methylation might influence the POMC activity and consequently alter the risk to develop obesity.

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Chromatinorganisation und Genregulation in höheren Eukaryoten und muss zusammen mit der genetischen Information in jedem Zellzyklus dupliziert werden. Bei Mammalia wird DNA durch die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) methyliert, die dabei mit nuklearen Replikationsstellen (RF) assoziiert und so die Erhaltung des Methylierungsmusters mit der Duplikation der DNA verbindet. In dieser Arbeit wurden die Funktion der regulatorischen Sequenzen in der N-terminalen Domäne von DNMT1 bei der Kontrolle ihrer subnuklearen Lokalisierung während des Zellzyklus und die evolutionäre Konservierung dieser Sequenzen, sowie die Mechanismen die eine Assoziation von Proteinen mit RF vermitteln, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass DNMT1 eine dynamische Verteilung im Kern aufweist, die durch regulatorische Sequenzen zellzyklusabhängig gesteuert wird. Um die subnukleare Verteilung von DNMT1 während des Zellzyklus zu untersuchen, wurden RFP-Ligase Fusionsproteine hergestellt, die als Marker für die Identifikation von Zellzyklusstadien in lebenden Zellen dienen. Verschiedene, mit GFP fusionierte DNMT1 Mutanten wurden zusammen mit RFP-Ligase exprimiert und über einen ganzen Zellzyklus hinweg mit 4-dimensionaler Lebendzellmikroskopie verfolgt. Die PBD (PCNA-Bindungsdomäne) bewirkt die Lokalisierung von DNMT1 an RF während der S-Phase, und die TS (targeting sequence) vermittelt die Retention von DNMT1 an spät replizierendem Heterochromatin von der späten S- bis zur frühen G1-Phase. Im Gegensatz dazu scheint die PBHD (Polybromohomologiedomäne) für die Freisetzung von DNMT1 von perizentrischen Regionen während der G1-Phase notwendig zu sein. Eine Überexpression der TS zu Störung dieser Assoziation, senkt die Überlebensrate der Zellen und fördert die Bildung von Mikronuklei sowie die Verschmelzung von zentromerem Heterochromatin. Diese Ergebnisse zeigen eine neue Funktion für die TS bei der Assoziation von DNMT1 mit perizentrischem Heterochromatin von der später S- über die G2-Phase bis hin zur Mitose, die eine wichtige Voraussetzung für die Erhaltung der DNA-Methylierung und Heterochromatinstruktur und -funktion ist. Datenbankanalysen zeigten, dass es sich bei der TS um eine einzigartige Domäne innerhalb der DNMT1 Proteinfamilie handelt. Innerhalb der DNMT1 Familie besitzen nur die DNMT1 Proteine der Metazoen die PBD. Das lässt vermuten, dass die Verknüpfung von Beibehaltung der DNA Methylierung mit der DNA Replikation nur in Metazoen auftritt, während in Pflanzen und Pilzen alternative Mechanismen zur Aufrechterhaltung des Methylierungsmusters, wahrscheinlich vermittelt durch die TS, zur Anwendung kommen. Die evolutionäre Konservierung von Mechanismen, zur Assoziation von Proteine mit RF in Säugerzellen, wurde durch die Analyse der Säugerproteine PCNA, DNA Ligase I und DNMT1 in Drosophila-zellen direkt getestet. Von allen untersuchten Proteinen assoziiert nur PCNA mit RF, während die anderen nur eine diffuse Verteilung innerhalb des Kerns zeigten, obwohl sie eine funktionale PBD enthalten. Überraschenderweise assoziierte auch die Drosophila DNA Ligase I in Säugerzellen nicht aber in Drosophila-zellen mit RF. Diese Ergebnisse weisen auf Unterschiede in der Dynamik und dem Aufbau der Replikationsmaschinerie in diesen entfernt verwandten Organismen hin, was mit der Vergrösserung und höheren Komplexität des Säugergenoms korreliert. / DNA methylation constitutes an essential epigenetic mark controlling chromatin organization and gene regulation in higher eucaryotes, which has to be duplicated together with the genetic information at every cell division cycle. In mammals duplication of DNA methylation is mediated by DNA methyltransferase-1 (DNMT1). It associates with sites of nuclear DNA replication, called replication foci (RF), and thereby couples maintenance of DNA methylation to DNA duplication. In this work, we have analyzed the role of regulatory sequences in the N-terminal domain of DNMT1 in controlling its subnuclear localization throughout the cell cycle, and the evolutionary conservation of these sequences and of the mechanisms that mediate association of proteins with RF. We provide evidence that DNMT1 shows dynamic subnuclear distribution that is controlled by the regulatory sequences depending on the cell cycle stage. To determine the subnuclear distribution of DNMT1 throughout the cell cycle, an RFP-Ligase fusion protein was developed as a marker that allows identification of the cell cycle stage in live cells. Various DNMT1 mutants fused to GFP were coexpressed with RFP-Ligase and imaged by 4-dimensional live cell microscopy during an entire cell cycle. The PBD (PCNA binding domain) drives the localization of DNMT1 at RF throughout S phase and the TS (targeting sequence) mediates retention of DNMT1 only at the late replicating pericentric heterochromatin from late-S phase until early-G1. In contrast, the PBHD (polybromo homology domain) seems to be required for unloading DNMT1 from the pericentric regions in G1. Overexpression of the TS to interfere with this association lowers cell viability and induces the formation of micronuclei and coalescence of centromeric heterochromatin. These results bring forth a novel function of the TS in mediating association of DNMT1 with pericentric heterochromatin from late-S phase through G2 until mitosis, which is important for maintenance of DNA methylation, and heterochromatin structure and function. Database searches indicate that the TS is a domain unique to the DNMT1 family of proteins. Amongst the DNMT1 family, only the metazoan DNMT1 proteins have the PBD. This suggests that coupling of maintenance of DNA methylation with DNA replication occurs only in metazoans, while plants and fungi have alternative mechanisms that maintain DNA methylation patterns, probably mediated by the TS. The evolutionary conservation of the mechanisms by which proteins associate with RF in mammalian cells was directly tested by analyzing the ability of mammalian replication proteins PCNA and DNA Ligase I as well as DNMT1 to associate with RF in Drosophila cells. Of all the proteins tested, only PCNA associated with RF while the others showed diffused nuclear distribution although they contain a functional PBD. Surprisingly, Drosophila DNA Ligase I associates with RF in mammalian but not in Drosophila cells. These results suggest differences in the dynamics and organization of the replication machinery in these distantly related organisms, which correlates with the increased size and complexity of mammalian genomes.