Die DNA Methyltransferasen sind verantwortlich für die spezifische Methylierung von DNA-Basen. Mehrere DNA Methyltransferasen sind bekannt, wobei die Dnmt1 das hauptsächlich vorkommende Enzym ist. Bei Säugetieren korreliert die DNA-Methylierung mit der Genaktivität und ist essentiell für die Embryonalentwicklung. Eine beeinträchtigte Funktion oder Verfügbarkeit des Enzyms kann zu pathologisch veränderten Zuständen führen. Die Regulation der Dnmt1 und die damit verbundene Bedeutung bei der Entstehung von Krankheiten ist bisher nur unvollständig untersucht. In der Frühphase der Embryonalentwicklung von Säugetieren ändert sich das Methylierungsmuster des Genoms dramatisch. In zeitlich aufeinander folgenden Phasen wird die DNA demethyliert (Verlust der Methylgruppen) und neu methyliert (De-Novo Methylierung). Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass verschiedene Isoformen der Dnmt1 in spezifischen Entwicklungsstadien exprimiert werden und zu Veränderungen des Methylierungsmusters der DNA beitragen. Um diese Regulation zu untersuchen, wurde die Struktur der Maus Dnmt1-Gens bestimmt. Außerdem wurde in verschiedenen Gewebetypen die Transkriptionsgröße und die Transkriptionsintensität der mRNA mit Hilfe von Northern-Blots quantifiziert. Mit diesen Experimenten konnte im Hoden- und Skelettmuskelgewebe ein längeres Dnmt1-Transkript als in anderen Geweben identifiziert werden. Dieses neue Dnmt1-Transkript wurde mit Hilfe von RT-PCR und RACE-Techniken kloniert und ist in beiden Geweben identisch. Es unterscheidet sich auf DNA-Ebene in der Sequenz des 5'-Endes von der bisher bekannten Form der Dnmt1 und besitzt einen anderen Startpunkt für die Transkription. Darüber hinaus besitzt das neue Dnmt1-Transkript ein 800 Basenpaar großes erstes Exon, welches sich von dem des bekannten Dnmt1-Transkripts unterscheidet. Die spezifische zelluläre Lokalisation des neuen Transkripts wurde mit Hilfe der In-Situ-Hybridisierung analysiert. Mit dieser Technik wurde das alternative Transkript in stärker spezialisierten, haploiden spermatogenen Zellen (Spermatiden) und zu einem geringen Maß im Skelettmuskel nachgewiesen. Während der Differenzierung von Muskelzellen wurde eine verminderte Expression des bereits bekannten mRNA-Transkripts und eine verstärkte Expression des neu identifizierten mRNA-Transkripts festgestellt. Obwohl die mRNA der alternativen Isoform verschiedene, kurze offene Leserahmen enthält, welche die Translation eines spezifischen Dnmt1 Proteins verhindern könnten, wurde durch Immunofluoreszenz- und Western-Blot Analysen ein Translationsprodukt nachgewiesen. Nach den hier aufgezeigten Ergebnissen werden alternative Dnmt1 Isoformen in vivo exprimiert, welche eine aktive Rolle bei der Regulation der DNA-Methylierung spielen könnten. / DNA methyltransferases (DNA MTases) are enzymes responsible for DNA methylation (transfer of methyl groups to a base in the DNA) and are vital for the development of mammals. Several MTases have been identified in eukaryotes but the most abundant is Dnmt1. Furthermore, many pathological conditions are often attributed to an altered availability or function of this enzyme, however the understanding of the regulation of Dnmt1 and the concomitant relationship to diseases is far from being complete. In mammals the methylation of DNA correlates with gene activity, and methylation patterns change dramatically during early development when the genome of the mammalian embryo undergoes consecutive waves of demethylation (loss of methylation) and de novo methylation (methylation of DNA sites that have not been previously methylated). The hypothesis of this study was that alternative Dnmt1 isoforms are expressed at specific developmental stages and thus contribute to changes in the DNA methylation pattern. To study this regulation the structure of the Dnmt1 gene was determined. In this work, the tissue distribution and abundance of Dnmt1 mRNA was analyzed by Northern blot and a new, longer transcript was identified that is present in testis and skeletal muscle tissue. The novel isoform was cloned by a combination of RT-PCR and RACE techniques and found to be identical in both tissues. This new isoform differs from the ubiquitous cDNA in the 5' end, utilizing a new transcriptional start site and an 800 bp long alternative first exon. The cellular localization of this new transcript was determined by in situ hybridization and found to be present in the more specialized haploid spermatogenic cells, spermatids and at lower level in skeletal muscle. During muscle differentiation, the ubiquitous isoform is downregulated while the alternative isoform is upregulated. Although this mRNA codes for several short upstream ORFs which could prevent translation of the Dnmt1-specific ORF, it was found by immunofluorescence and Western blot analyses that this transcript can be translated in vivo producing a shorter Dnmt1 protein. The results shown here indicate that alternative Dnmt1 isoforms are expressed in vivo and might play an active role in the regulation of DNA methylation.

Diese Arbeit ermöglicht ein detailliertes Verständnis der Schwingungsdynamik und Kupplungen in einem Basenpaar-Modellsystem und in künstlichen DNA-Oligomeren bei verschiedenen Hydratationsgraden. Durch die Verwendung von nichtlinearer ultraschneller IR Pump-Probe Spektroskopie sind die Schwingungsbewegungen hydratisierter DNA und die schnellsten Veränderungen in den DNA-Wasser-Wechselwirkungen und Hydrationsgeometrien direkt zugänglich. 2-pyridone/2-hydroxypyridine ist ein Modellsystem für die gekoppelte intermolekularen Wasserstoffbrücken, deren Struktur der von DNA-Basenpaaren ähnelt. In Dichlormethan existiert das Molekül als ein zyklischer 2-Pyridon-Dimer, deren Vorkommern durch NMR-und 2D-FTIR Spektroskopie verifiziert wurde. Die beobachteten kohärente Oszillationen aufgrund niederfrequenter Wellenpaketbewegungen der Dimere können für die Dynamik und räumliche Geometrie der Basenpaare in den DNA-Molekül relevant sein. Transiente Schwingungsspektren eines poly[d(A-T)]:poly[d(A-T)] Film erlauben die Zuordnung von verschiedenen NH-Streckbanden zu einer bestimmten Schwingung der Nukleinbasen und ermöglichen deren Abgrenzung zu den Beiträgen von OH-Streckschwingungen des umgebenden Wassers. Bei einem niedrigen Hydratisierungsgrad verändern die restlichen, an die Phosphatgruppen gebundenen Wassermoleküle, ihre Ausrichtung auf ultraschnellen Zeitskalen nicht. Im Fall vollständig hydratisierter DNA ist die Dynamik der Wasserhülle dem Verhalten des reinen Wassers ähnlicher und man beobachtet spektrale Diffusion der OH-Streckschwingung im Subpikosekundenbereich sowie einen Zerfall der Schwingungsanisotropie durch Molekülrotation und/oder Energietransfer. Die Wassermoleküle der Phosphat-Hydratationshülle dienen als effiziente Wärmesenke für Überschussenergie aus der DNA, wobei die Energietransferzeiten im fs-bereich liegen. Im Gegensatz dazu erfolgt Energietransport innerhalb der DNA auf einer langsameren Zeitskala von 20 ps. / This thesis provides a detailed understanding of vibrational dynamics and couplings in a base pair model system and artificial DNA oligomers at different levels of hydration. By using nonlinear ultrafast infrared pump-probe spectroscopy, the basic vibrational motions of hydrated DNA and the fastest changes in the DNA–water interactions and hydration geometries are directly accessed. 2-pyridone/2-hydroxypyridine is used as a model molecule for coupled intermolecular hydrogen bonds with a structure resembling a DNA base pair. In dichloromethane the molecule predominantly exists as a cyclic 2-pyridone dimer as determined using a combined NMR and 2D FTIR approach. The observed coherent oscillations due to low-frequency hydrogen bond wavepacket motions of the dimers are expected to be relevant for the dynamics and spatial geometry of base pairs in DNA molecule. Transient vibrational spectra of a poly[d(A-T)]:poly[d(A-T)] film enabled the assignment of different NH stretching bands to particular nucleobase vibrations, also discerning them from the OH stretching contributions of the surrounding water. At a low hydration level, residual water molecules, bound to the phosphate groups, do not alter their orientation on ultrafast time scales. In the case of fully hydrated DNA, the dynamics of the water shell are closer to those of bulk liquid water with a sub-picosecond spectral diffusion and a loss of vibrational anisotropy as a result of molecular rotation and/or energy transfer. The water shell around the phosphates serves as a efficient heat sink accepting excess energy from DNA in a femtosecond time domain, whereas the energy transfer within DNA occurs on the time scale of 20 ps.

Die Struktur von DNS Molekülen und ihre Wechselwirkung mit Wasser werden seit langer Zeit heiß diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wird nichtlineare Spektroskopie zur Untersuchung dieser Systeme angewendet. Oligomere, die aus 23 alternierenden Adenin-Thymin-Basenpaaren bestehen und eine Doppelhelix bilden, wurden mit Hilfe von 2D IR Spektroskopie für verschiedene Hydratisierungsgrade untersucht. Für DNS-Filme bei 0% relativer Feuchte (r.F.) erlauben die transienten Spektren eine Unterscheidung der NH Streckschwingung von Thymin ((NH)), der symmetrischen und asymmetrischen NH2 Streckschwingung von Adenin (s(NH2) and a(NH2)) sowie die Bestimmung der jeweiligen Linienprofile. Die Spektren zeigen eine homogene Verbreiterung für die (NHT) wohingegen die s(NH2) and a(NH2) eine ausgeprägte und zeitunabhängige inhomogene Verbreiterung zeigen, welche auf Unordnungen in der DNS-Struktur hinweisen. Außerdem kann Energietransfer von der a(NH2) zur (NH) beobachtet werden. Bei Erhöhung der r.F. hat die erhöhte Anzahl von Wassermolekülen nur einen geringen Einfluss auf die Positionen und Linienprofile der NH Streckschwingungen. Dadurch wird nahegelegt, dass die spektrale Dynamik vom DNS Molekül selbst und nicht vom umgebenen Wasser bestimmt ist. Im Gegensatz dazu zeigt die OH Streckmode der Wasserhülle um die DNS spektrale Diffusion auf einer 500 fs Zeitskala. Guanosin-Cytidin(GC)-Basenpaare wurden in Chloroformlösung untersucht, um die Wechselwirkung zwischen Basenpaaren zu verstehen. Dabei wurden die NH Schwingungen in einer local mode Darstellung betrachtet, die zwei freie NH Gruppen von G und C und drei wasserstoffverbrückte NH Gruppen beeinhaltet. Die Kopplungen und Relaxationsdynamik der NH Streckanregungen wurden mit Femtosekunden-Pump-Probe und 2D IR Experimenten studiert. Die Ergebnisse zeigen eine Verringerung der Lebensdauer mit der Bildung von Wasserstoffbrücken sowie Energietransfer zwischen zwei wasserstoffverbrückten NH Streckschwingungen. / The structure of DNA molecule and the interactions with its surrounding water is a hot topic for long time. In this thesis, we employ the nonlinear spectroscopy, including femtosecond pump-probe and two-dimensional infrared (2D IR) experiment, to study the vibrational dynamics of the systems. Double-stranded DNA short oligomers containing 23 alternating adenine-thymine base pairs were studied at different hydration levels by femtosecond 2D IR spectroscopy. For a DNA film at 0% relative humidity, the transient spectra enable a separation of the NH stretching mode of thymine from the symmetric and asymmetric NH2 stretching modes of adenine and determine the individual line shapes. For the NH stretch of thymine, the spectra demonstrate an essential homogeneous broadening, whereas for the symmetric and asymmetric NH2 stretches a pronounced and time-independent inhomogeneous broadening suggests a disorder in DNA structure. An energy transfer from the asymmetric NH2 stretch of adenine to the NH stretch of thymine is also observed. When the relative humidity increases, the increased water molecules have limited influence on the positions and line shapes of NH stretching frequencies, suggesting the spectral dynamics governed by DNA rather than water fluctuations. In contrast, the OH stretching mode of water shell around hydrated DNA undergoes a spectral diffusion on a 500 fs time scale, which is slower than the neat water. The guanosine-cytidine (GC) base pairs in chloroform solution were investigated to understand the interactions within base pairs. A local mode representationof NH stretching mode is adopted, consisting two free NH groups of G and C and three hydrogen bonded NH groups. The coupling and relaxation dynamics of the NH stretching excitations are studied by femtosecond pump-probe and 2D IR experiments. The results demonstrate a lifetime shortening upon the formation of hydrogen bonds, and an energy transfer between two hydrogen-bonded NH stretches.

Die Energierelaxationsdynamik und strukturelle Dynamik der DNA spielen eine entscheidende Rolle für das Verständnis der photochemischen Eigenschaften und biologischen Funktion von DNA. Die schnellsten Prozesse geschehen dabei auf Zeitskalen im Femto- bis Pikosekundenbereich und können durch zeitaufgelöste (ultraschnelle) Messungen an molekularen Schwingungsanregungen in Echtzeit beobachtet werden. In dieser Arbeit werden NH-Streck Schwingungsmoden der Nukleobasen sowie OH-Streckmoden der Hydrathülle mittels linearer infrarot (IR) Spektroskopie sowie ultraschneller Pump-Probe und zweidimensionaler IR Spektroskopie untersucht. Messungen an monomerartigen Nukleobasen, wasserstoffverbrückten Nukleobasenpaaren und kurzen DNA Fragmenten in Doppelhelixstruktur ermöglichen es, die Effekte der verschiedenen Wasserstoffbrücken und Schwingungskopplungen separat voneinander zu untersuchen. Im Zusammenspiel mit exzitonischen und quantenchemischen Rechnungen werden so weitreichende Einsichten in die spektroskopischen Eigenschaften und die Relaxationsdynamik von Schwingungsanregungen in DNA gewonnen. Es wird u.a. gezeigt, dass Wasserstoffbrücken zwischen Nukleobasen eine Lebensdauer größer 1 ps besitzen und eine beschleunigte Energierelaxation durch Fermiresonanzen mit niederfrequenten Schwingungsmoden des Fingerprintbereichs bewirken. Die DNA-Hydrathülle zeigt eine ultraschnelle strukturelle Dynamik unabhängig von der Basenpaarzusammensetzung und fungiert als effiziente Wärmesenke für hochfrequente Schwingungsanregungen. / Energy relaxation and structural dynamics in DNA play a crucial role for the understanding of the photochemical properties and biological function of DNA. The fastest of such processes occur on the femto- to picosecond time scale and can be followed in real time through time-resolved (ultrafast) measurements on molecular vibrations. In this work, NH stretching excitations of nucleobases and OH stretching modes of the hydration shell are analyzed through linear infrared (IR) spectroscopy as well as ultrafast pump-probe and two-dimensional IR spectroscopy. Measurements on monomeric nucleobases, hydrogen-bonded nucleobase pairs, and short DNA fragments in double helix structure allow one to examine the effects of the different hydrogen bonds and vibrational couplings separately from each other. The combination with excitonic and quantum chemical calculations provides profound new insights into the spectroscopic properties and relaxation dynamics of vibrational excitations in DNA. This work shows that hydrogen bonds between nucleobases have a lifetime greater than 1 ps and lead to an accelerated dissipation of energy due to Fermi resonances with vibrational modes in the fingerprint range. The hydration shell of DNA exhibits ultrafast structural dynamics independent of the base pair composition and serves as an efficient heat sink for high-energy vibrational excitations.

Drei ausgewählt makromolekulare Systeme: DNA, amphiphile Block-Bürstenpolymere, und amphiphile, hyperverzweigte Polyglycerine wurden untersucht, um die Zusammenhang zwischen Struktur, Eigenschaften, und potentiellen Anwendung auf der Ebene einzelner Moleküle zu widmen. Unterschiedliche DNA Konformationen: (i) supercoiled DNA, (ii) gestreckte doppelsträngige DNA, die teilweise in zwei Einzelstränge aufgeschmolzen ist, (iii) DNA mit einem überdehnten Rückgrat, (iv) entspannter, ungedehnter Ring und (v) kompaktes Knäuel wurden untersucht, um direkt DNA Konformationen mit mechanischen Eigenschaften, wie der Kopplung von Streckung und Verdrillung zu korrelieren. Mit Hilfe eines Kraftmikroskops, mit dem man eine Kraft parallel zur Oberfläche anlegen kann, wurden die plasmidischen DNA Moleküle auf bis zum 2.1-fachen der ursprünglichen B-Form Länge gestreckt und dann gerissen. Die Strukturen einzelner Amphiphilen Block-Bürstenpolymere auf unterschiedlichen Oberflächen wurden investigiert. Aus Chloroform-Lösung auf Glimmer abgeschiedene Polymere wiesen wurmartige Konformationen auf. Wegen der unterschiedlichen Oberflächenaffinitäten der Seitenketten sind diese zu einem Teil kollabiert, während sich ein anderer Teil ausstreckt. Das an Kaulquappen erinnernde Ergebnis ist eine Struktur mit rückgefalteten Kettenteilen. Aus wässriger Lösung abgeschieden bilden diese amphiphilen Block-Bürstenpolymere supramolekulare Aggregate auf der Oberfläche. Die amphiphile Kern-Schale-Strukturen der hyperverzweigten Polyglycerinen und ihre Verkapselungs- und Transportkapazität für typische Gastmoleküle wie Nil Rot und Pyren wurden mit Hilfe von SFM, Lichtstreu-, und Spektroskopie-Methoden examiniert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Polymere verschiedene Gastmoleküle sowohl in unimolekulan Mizellen wie auch in polymeren Mizellen verkapseln und transportieren. Das Polymer ist ein vielversprechender Kandidat für die gleichzeitige Bereitstellung von zwei hydrophoben Pharmaka. / Three macromolecular systems: DNA, amphiphilic cylindrical polymer brushes, and amphiphilic core-shell structured hyperbranched polyglycerol (hPG) were investigated in order to investigate correlations between structure, properties and potential applications at the single molecule level. Different single DNA conformations: (i) supercoiled DNA, (ii) stretched DNA, partially melted into two single strands, (iii) DNA with an overstretched backbone, (iv) relaxed circles without stretching, and (v) compact coils were studied on the surface to directly correlate DNA conformations to mechanical properties such as twist-stretch coupling. The plasmid DNA molecules were stretched further, up to 2.1 times their original length and ruptured with a Scanning Force Microscope (SFM), exerting a force parallel to the surface. The structures of single cylindrical polymer brushes adsorbed on different surfaces were explored. The brush polymers reveal worm-like chain conformations on mica, after being deposited from a chloroform solution. Due to different affinities of the side chains to the surface, parts of the side chains collapsed, while others fully extended on the surface, resulting in a “tadpole like” or a back-folding structure. Deposited from an aqueous solution, the dual cylindrical polymer brushes form supramolecular aggregates on the surface. The supramolecular structure of hyperbranded polyglycerol and its encapsulation and transportation capacities for typical guest molecules, such as nile red and pyrene were examined by SFM, light scattering and spectroscopy methods. The polymer showed bi-functional carrier properties: it encapsulates and transports guest molecules in both, a “unimolecular micelle” and polymeric micelle type mechanism. The capacity of co-loading of two drugs and controlled release makes it a promising candidate for simultaneous delivery of two hydrophobic drugs in cancer combination therapy.

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Chromatinorganisation und Genregulation in höheren Eukaryoten und muss zusammen mit der genetischen Information in jedem Zellzyklus dupliziert werden. Bei Mammalia wird DNA durch die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) methyliert, die dabei mit nuklearen Replikationsstellen (RF) assoziiert und so die Erhaltung des Methylierungsmusters mit der Duplikation der DNA verbindet. In dieser Arbeit wurden die Funktion der regulatorischen Sequenzen in der N-terminalen Domäne von DNMT1 bei der Kontrolle ihrer subnuklearen Lokalisierung während des Zellzyklus und die evolutionäre Konservierung dieser Sequenzen, sowie die Mechanismen die eine Assoziation von Proteinen mit RF vermitteln, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass DNMT1 eine dynamische Verteilung im Kern aufweist, die durch regulatorische Sequenzen zellzyklusabhängig gesteuert wird. Um die subnukleare Verteilung von DNMT1 während des Zellzyklus zu untersuchen, wurden RFP-Ligase Fusionsproteine hergestellt, die als Marker für die Identifikation von Zellzyklusstadien in lebenden Zellen dienen. Verschiedene, mit GFP fusionierte DNMT1 Mutanten wurden zusammen mit RFP-Ligase exprimiert und über einen ganzen Zellzyklus hinweg mit 4-dimensionaler Lebendzellmikroskopie verfolgt. Die PBD (PCNA-Bindungsdomäne) bewirkt die Lokalisierung von DNMT1 an RF während der S-Phase, und die TS (targeting sequence) vermittelt die Retention von DNMT1 an spät replizierendem Heterochromatin von der späten S- bis zur frühen G1-Phase. Im Gegensatz dazu scheint die PBHD (Polybromohomologiedomäne) für die Freisetzung von DNMT1 von perizentrischen Regionen während der G1-Phase notwendig zu sein. Eine Überexpression der TS zu Störung dieser Assoziation, senkt die Überlebensrate der Zellen und fördert die Bildung von Mikronuklei sowie die Verschmelzung von zentromerem Heterochromatin. Diese Ergebnisse zeigen eine neue Funktion für die TS bei der Assoziation von DNMT1 mit perizentrischem Heterochromatin von der später S- über die G2-Phase bis hin zur Mitose, die eine wichtige Voraussetzung für die Erhaltung der DNA-Methylierung und Heterochromatinstruktur und -funktion ist. Datenbankanalysen zeigten, dass es sich bei der TS um eine einzigartige Domäne innerhalb der DNMT1 Proteinfamilie handelt. Innerhalb der DNMT1 Familie besitzen nur die DNMT1 Proteine der Metazoen die PBD. Das lässt vermuten, dass die Verknüpfung von Beibehaltung der DNA Methylierung mit der DNA Replikation nur in Metazoen auftritt, während in Pflanzen und Pilzen alternative Mechanismen zur Aufrechterhaltung des Methylierungsmusters, wahrscheinlich vermittelt durch die TS, zur Anwendung kommen. Die evolutionäre Konservierung von Mechanismen, zur Assoziation von Proteine mit RF in Säugerzellen, wurde durch die Analyse der Säugerproteine PCNA, DNA Ligase I und DNMT1 in Drosophila-zellen direkt getestet. Von allen untersuchten Proteinen assoziiert nur PCNA mit RF, während die anderen nur eine diffuse Verteilung innerhalb des Kerns zeigten, obwohl sie eine funktionale PBD enthalten. Überraschenderweise assoziierte auch die Drosophila DNA Ligase I in Säugerzellen nicht aber in Drosophila-zellen mit RF. Diese Ergebnisse weisen auf Unterschiede in der Dynamik und dem Aufbau der Replikationsmaschinerie in diesen entfernt verwandten Organismen hin, was mit der Vergrösserung und höheren Komplexität des Säugergenoms korreliert. / DNA methylation constitutes an essential epigenetic mark controlling chromatin organization and gene regulation in higher eucaryotes, which has to be duplicated together with the genetic information at every cell division cycle. In mammals duplication of DNA methylation is mediated by DNA methyltransferase-1 (DNMT1). It associates with sites of nuclear DNA replication, called replication foci (RF), and thereby couples maintenance of DNA methylation to DNA duplication. In this work, we have analyzed the role of regulatory sequences in the N-terminal domain of DNMT1 in controlling its subnuclear localization throughout the cell cycle, and the evolutionary conservation of these sequences and of the mechanisms that mediate association of proteins with RF. We provide evidence that DNMT1 shows dynamic subnuclear distribution that is controlled by the regulatory sequences depending on the cell cycle stage. To determine the subnuclear distribution of DNMT1 throughout the cell cycle, an RFP-Ligase fusion protein was developed as a marker that allows identification of the cell cycle stage in live cells. Various DNMT1 mutants fused to GFP were coexpressed with RFP-Ligase and imaged by 4-dimensional live cell microscopy during an entire cell cycle. The PBD (PCNA binding domain) drives the localization of DNMT1 at RF throughout S phase and the TS (targeting sequence) mediates retention of DNMT1 only at the late replicating pericentric heterochromatin from late-S phase until early-G1. In contrast, the PBHD (polybromo homology domain) seems to be required for unloading DNMT1 from the pericentric regions in G1. Overexpression of the TS to interfere with this association lowers cell viability and induces the formation of micronuclei and coalescence of centromeric heterochromatin. These results bring forth a novel function of the TS in mediating association of DNMT1 with pericentric heterochromatin from late-S phase through G2 until mitosis, which is important for maintenance of DNA methylation, and heterochromatin structure and function. Database searches indicate that the TS is a domain unique to the DNMT1 family of proteins. Amongst the DNMT1 family, only the metazoan DNMT1 proteins have the PBD. This suggests that coupling of maintenance of DNA methylation with DNA replication occurs only in metazoans, while plants and fungi have alternative mechanisms that maintain DNA methylation patterns, probably mediated by the TS. The evolutionary conservation of the mechanisms by which proteins associate with RF in mammalian cells was directly tested by analyzing the ability of mammalian replication proteins PCNA and DNA Ligase I as well as DNMT1 to associate with RF in Drosophila cells. Of all the proteins tested, only PCNA associated with RF while the others showed diffused nuclear distribution although they contain a functional PBD. Surprisingly, Drosophila DNA Ligase I associates with RF in mammalian but not in Drosophila cells. These results suggest differences in the dynamics and organization of the replication machinery in these distantly related organisms, which correlates with the increased size and complexity of mammalian genomes.

Die Strukturen in Lösung dreier unterschiedlich modifizierter DNA Doppelstränge wurden mittels NMR Spektroskopie gelöst. Sie alle besitzen polare Sonden im Zentrum der Helix, welche sensitiv für die nähere Umgebung sind. Ihr Schmelzverhalten wurde mit Hilfe einer neuen Methode charakterisiert, welche komplette Absorptionsspektren in Kombination mit Singularwertzerlegung (SVD) nutzt. Letztere erlaubt die Analyse der Spektren als Ganzes, die notwendig ist um der Blauverschiebung des Sondensignals zu folgen, welche durch die zuvor genannte Sensitivität zur Umgebung verursacht wird. Auf diese Weise kann der Schmelzprozess des Duplex lokal und global beschrieben werden. Die erste Modifikation, 2-Hydroxy-7-Carboxyfluoren (HCF), wurde gegenüber einer abasischen Seite platziert, um sterische Spannungen zu vermeiden. Die NMR Spektroskopie deckte zwei gleichverteilte Konformationen auf, da die Rotation des HCF Chromophors nur durch die Stapelwechselwirkung innerhalb der Helix unterbunden wird. Der zweite Doppelstrang enthält ein über R-Glycerol gebundenes 6-Hydroxychinolinium (6HQ) gegenüber Cytosin. Der Einbau von 6HQ als Mononukleotid einer Glykolnukleinsäure (GNA) ist ein strukturelles Alleinstellungsmerkmal. Bisher sind nur Kristallstrukturen von vollständiger GNA bekannt, daher ist die Struktur in Lösung dieses Doppelstranges von generellem Interesse. Die geringe Größe von R-Glycerol stört das Rückgrat des 6HQ-Stranges, welche eine von der helikalen Achse abweichende Stapelachse für die drei zentralen Basen verursacht. Die letzte Modifikation ist ein künstliches Basenpaar bestehend aus 4-Aminophthalimid (4AP) und 2,4-Diaminopyrimidin (DAP). Anstatt der gewünschten drei Wasserstoffbrücken wurden zwei Strukturen, die entweder eine oder zwei Wasserstoffbrücken beinhalten, beobachtet, welche durch die Verbindung von 4AP zur 2’-Deoxyribofuranose erklärt werden können. / The solution structures of three differently modified DNA double strands were solved by NMR spectroscopy. They all incorporate polarity probes in the center of the helix that are sensitive to the immediate environment. Their melting behavior was characterized by a new method that utilizes complete absorption spectra in combination with Singular Value Decomposition (SVD). The latter allows to analyze the spectra in their entirety, which is required to follow the blue shift of the probe signal that is caused by the aforementioned sensitivity to the environment. In this way the duplex melting process is characterized in local and global terms.The first modification, 2-hydroxy-7-carboxyfluorene (HCF), is placed opposite an abasic site to avoid steric strain. NMR spectroscopy revealed two equally distributed conformations, since rotation of the HCF chromophore is only hindered by stacking interactions inside the helix. The second double strand comprises R-glycerol linked 6-hydroxyquinolinium (6HQ) opposite cytosine. The incorporation of 6HQ as glycol nucleic acid (GNA) mononucleotide is a unique structural feature. Until now, only crystal structures of full GNA backbone duplexes are known, so the solution structure of this double strand is of general interest. The small size of R-glycerol disturbs the backbone of the 6HQ strand, which causes a stacking axis that differs from the helical long axis for the three central bases. The last modification is an artificial base pair made of 4-aminophthalimide (4AP) and 2,4-diaminopyrimidine (DAP). Instead of the desired three hydrogen bonds, two structures containing either a single or two hydrogen bonds are observed that can be explained by the linkage of 4AP to 2’-deoxyribofuranose.