Diese Arbeit beinhaltet Ergebnisse der ersten klinischen Studie zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Zellen in einem Tumor mit der dafür notwendigen Probengröße. Dies ermöglichte die Erstellung eines umfassenden Bildes von Subpopulationen innerhalb eines Tumors mit großem diagnostischem Potential. Die Änderung der Einzelzellmechanik von Tumorzellen wird durch Veränderung des Zytoskeletts, einem komplexes Polymernetzwerk in Zellen, hervorgerufen. Mit Hilfe von Zellgiften wurde das Zytoskelett gezielt manipuliert, um den Einfluss einzelner Faktoren auf die Biomechanik zu bestimmen. Aus Gewebeproben von Brustkrebspatienten wurden Zellen mit Hilfe enzymatischer Aufspaltung des extrazellulären Kollagennetzwerkes isoliert. Als Kontrollsystem wurden Primärzellen aus Brustreduktionsgewebe und aus Fibroadenomen, gutartigen Gewebeneubildungen der Brustdrüse, verwendet. Unter Einsatz des Optischen Stretchers, einer Zweistrahl-Laserfalle, wurden suspendierte Zellen für zwei Sekunden einer konstanten Zugspannung ausgesetzt und das Deformations- wie auch das anschließende Relaxationsverhalten beobachtet. Dabei ergaben sich wesentliche Unterschiede zwischen Tumor- und Kontrollproben. Neben Zellen mit ähnlichen Steifigkeiten, enthielten Tumorproben Subpopulationen sehr weicher Zellen, wie sie in Normalgewebe nicht zu finden sind. Desweiteren war das Relaxationsverhalten der Tumorzellen stärker elastisch dominiert. Einzelne Zellen kontrahierten sogar aktiv gegen die Zugspannung. Versuche, das Zytoskelett mittels Zellgiften künstlich in einem Zustand zu bringen, der in Krebszellen beobachtet wurde, ergaben zwar ebenfalls die Zunahme weicherer Zellen, jedoch war das Relaxationsverhalten eher viskos dominiert. Fluoreszenzaufnahmen des Aktin-Zytoskeletts sowie der fokalen Adhäsionen, die das Aktin-Netzwerk der Zelle mit dem Substrat verankern, zeigten Veränderungen bei Krebszellen im Vergleich zu Kontrollen. Darüber hinaus wurden Einflussfaktoren auf die Zellmechanik untersucht. Neben Kulturbedingungen, beeinflussen auch Alter und Medikation das biomechanische Verhalten. Die Steifigkeit der Krebszellen scheint vom Ursprungsgewebe beeinflusst zu werden, sodass Zellen verschiedener Krebsarten Steifigkeiten in unterschiedlichen Regimes zeigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Informationen für unser Verständnis der Karzinogenese und bilden die Grundlage für eine neue diagnostische Methode zur Bestimmung der Tumoraggressivität. Eine gezielte Untersuchung der gefundenen Subpopulationen in einem Tumor könnte dabei helfen, neue Therapieansätze zu entwickeln und damit die hohen Rezidivraten aggressiver Tumore zu vermindern.

Diese Arbeit beinhaltet Ergebnisse der ersten klinischen Studie zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Zellen in einem Tumor mit der dafür notwendigen Probengröße. Dies ermöglichte die Erstellung eines umfassenden Bildes von Subpopulationen innerhalb eines Tumors mit großem diagnostischem Potential. Die Änderung der Einzelzellmechanik von Tumorzellen wird durch Veränderung des Zytoskeletts, einem komplexes Polymernetzwerk in Zellen, hervorgerufen. Mit Hilfe von Zellgiften wurde das Zytoskelett gezielt manipuliert, um den Einfluss einzelner Faktoren auf die Biomechanik zu bestimmen. Aus Gewebeproben von Brustkrebspatienten wurden Zellen mit Hilfe enzymatischer Aufspaltung des extrazellulären Kollagennetzwerkes isoliert. Als Kontrollsystem wurden Primärzellen aus Brustreduktionsgewebe und aus Fibroadenomen, gutartigen Gewebeneubildungen der Brustdrüse, verwendet. Unter Einsatz des Optischen Stretchers, einer Zweistrahl-Laserfalle, wurden suspendierte Zellen für zwei Sekunden einer konstanten Zugspannung ausgesetzt und das Deformations- wie auch das anschließende Relaxationsverhalten beobachtet. Dabei ergaben sich wesentliche Unterschiede zwischen Tumor- und Kontrollproben. Neben Zellen mit ähnlichen Steifigkeiten, enthielten Tumorproben Subpopulationen sehr weicher Zellen, wie sie in Normalgewebe nicht zu finden sind. Desweiteren war das Relaxationsverhalten der Tumorzellen stärker elastisch dominiert. Einzelne Zellen kontrahierten sogar aktiv gegen die Zugspannung. Versuche, das Zytoskelett mittels Zellgiften künstlich in einem Zustand zu bringen, der in Krebszellen beobachtet wurde, ergaben zwar ebenfalls die Zunahme weicherer Zellen, jedoch war das Relaxationsverhalten eher viskos dominiert. Fluoreszenzaufnahmen des Aktin-Zytoskeletts sowie der fokalen Adhäsionen, die das Aktin-Netzwerk der Zelle mit dem Substrat verankern, zeigten Veränderungen bei Krebszellen im Vergleich zu Kontrollen. Darüber hinaus wurden Einflussfaktoren auf die Zellmechanik untersucht. Neben Kulturbedingungen, beeinflussen auch Alter und Medikation das biomechanische Verhalten. Die Steifigkeit der Krebszellen scheint vom Ursprungsgewebe beeinflusst zu werden, sodass Zellen verschiedener Krebsarten Steifigkeiten in unterschiedlichen Regimes zeigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Informationen für unser Verständnis der Karzinogenese und bilden die Grundlage für eine neue diagnostische Methode zur Bestimmung der Tumoraggressivität. Eine gezielte Untersuchung der gefundenen Subpopulationen in einem Tumor könnte dabei helfen, neue Therapieansätze zu entwickeln und damit die hohen Rezidivraten aggressiver Tumore zu vermindern.:Bibliographische Beschreibung 3 1 Introduction 10 2 Background 13 2.1 Cancer development and diagnosis 13 2.2 Biomechanics of cells 16 2.2.1 Cytoskeletal changes in cancer cells 17 2.2.2 Micro-mechanical measurement techniques 21 2.2.3 Interaction of laser light with cells: physical principles of the Optical Stretcher 25 2.2.4 Physical models of cell rheology 29 2.3 Cancer cell motility 35 2.4 Tumor boundaries 38 3 Materials and Methods 40 3.1 Sample preparation 40 3.1.1 Cell lines 40 3.1.2 Primary cells from breast reduction 41 3.1.3 Solid tissue samples 41 3.1.4 Drug treatment 48 3.1.5 Fluorescent staining 49 3.2 The Optical Stretcher 50 3.2.1 Experimental Setup 50 3.2.2 Data analysis 52 3.2.3 Reproducibility of Optical Stretcher measurements 52 3.2.4 Laser induced heating in optical traps 54 3.3 Rheometer measurements of collagen gels 57 4 Experimental Results 58 4.1 Parameter space of Optical Stretcher measurements 58 4.2 How well defined are primary tissues? 60 4.2.1 Cells adapt mechanical properties to culture conditions 60 4.2.2 Individual and cell type differences 64 4.3 Characterization of human primary breast cancer cells 68 4.3.1 Malignant tissues comprise an increased number of softer cells 69 4.3.2 Tumor cells show a strong relaxation behavior 73 4.3.3 Single cells contract against applied stress 75 4.4 Changing the biomechanical phenotype - induced alterations of the F-actin network 76 5 Discussion 80 5.1 Measurement bias and impact factors 80 5.2 Softening as an effect of cytoskeletal reorganization in cancer cells 84 5.3 Mechanism of cytoskeletal reorganization 86 5.4 Cells on their way of breaking the boundary 89 6 Conclusion and Outlook 92 Appendix 94 A Cell culture protocols 94 A.1 Used materials and devices for cell culture 94 A.2 Thawing of cells 95 A.3 Medium exchange 96 A.4 Passaging and preparation for measurement 96 A.5 Collagen gel preparation 97 A.6 Culturing specifics for each cell line used 98 A.7 Tissue dissociation protocol for human mamma carcinoma 98 A.8 Fluorescent staining 99 B Additional graphs 101 Bibliography 103 Acknowledgements 114 Curriculum Vitae 115 Selbständigkeitserklärung 116

Cell-substrate interactions play a key role in the regulation of epithelial cell mechanics. Through a series of studies, we demonstrate how substrate interactions impact both the response to an oncogene and the cellular contractility and organization of a monolayer. We first examine the effects of oncogenic Ras in cells in adherent and suspended states. To accomplish this, we utilized atomic force microscopy and a microfluidic optical stretcher. We found that adherent cells stiffen and suspended cells soften with the expression of constitutively active Ras. The effect on adherent cells was reversed when contractility was inhibited with the ROCK inhibitor Y-27632, resulting in softer cells. These findings suggest that increased ROCK activity as a result of Ras has opposite effects on suspended and adhered cells. In a subsequent study, we examined the effects of a substrate on contracting and relaxing monolayers. We created a new methodology for measuring the mechanodynamics of epithelial monolayers by culturing cells at an air-liquid interface. These model monolayers were grown in the absence of any supporting structures in hanging drops. We found that the direction of strain in the unsupported monolayers was not correlated to nuclear alignment as observed when the monolayers were grown on soft deformable gels. It was also observed that both gel and glass substrates led to the promotion of long-range cell nuclei alignment not seen in the unsupported monolayers. To further characterize the morphology and mechanics of monolayers clusters observed in our experiments, we created a new computational model based on the vertex model. The energy function used in this model takes into account cell-cell and cell-substrate adhesion as well as anisotropic cellular mechanical properties. The results of these simulations suggest that the promotion of long-range alignment on solid substrates were due to cells having anisotropic elastic moduli with global alignment. They also suggest that the alignment observed in monolayers grown on air water interfaces is due to cells having low substrate adhesion and isotropic moduli. Our findings establish the importance of studying epithelial cell mechanics in different states of attachment.

Mechanical properties of cells, mainly defined by their cytoskeleton, are closely related to cell function and can be measured with a dual-beam laser trap (optical stretcher). Functional changes, which go hand in hand with changes of the cytoskeleton, also occur during differentiation of stem cells. This suggests monitoring differentiation by the changing compliance of the cells. During the course of my PhD I measured the compliance of three different types of stem cells before and after differentiation and was able to detect differences in some of the cell types. In order to relate rheological experiments to cell migration as a further example of functional change I investigated the migration behavior of cells that showed different compliance and found differences in migration. I was additionally able to show an altered migration behavior after I actively changed the mechanical behavior of one cell type using cytoskeletal drugs. These migration experiments have been carried out in 2D and 3D migration assays. Furthermore, the influence of the stiffness of the surrounding material on the migration behavior has been investigated. After relating functional changes to changes in compliance, I studied which mechanisms can be used to actually influence cell compliance and investigated the effect of cytoskeletal stabilizers or destabilizers as well as drugs acting on molecular motors. The effect of the surrounding temperature has been considered as well. Finally, I developed a new version of the optical stretcher measurement tool, which enables cell sorting and drug screening using a monolithic glass chip. With the results presented in this thesis I relate mechanical compliance to the cytoskeleton and specific cellular functions. I deliver insights how mechanical changes in cells can be used to identify and follow functional changes and how this knowledge can help to interfere with such functions, specifically in pathologies correlated to these functions. My modified optical stretcher would be developed to screen the effects of drugs on cell compliance and to sort cells with different mechanical properties. Such drug screening and cell sorting will offer diagnostic treatment options for various pathologies.

Orale Plattenepithelkarzinome stellen seit Jahrzehnten eine globale Herausforderung im Gesundheitswesen dar. In dieser Studie wird mit dem Optical Stretcher ein neuer diagnostischer Ansatz in der Krebserkennung der Mundhöhle untersucht und im Rahmen einer klinischen Pilotstudie evaluiert. Dabei steht die Beurteilung der viskoelastischen Eigenschaften von oralen Epithelzellen im Vordergrund. Eine entscheidende Rolle spielt hierbei vor allem das Zytoskelett einer Zelle, welches aus unterschiedlichen Faserstrukturen ein komplexes, dynamisches Gerüst bildet und für die Strukturgebung sowie für die mechanischen Eigenschaften der unterschiedlichen Zelltypen verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden diesbezüglich einzelne Zellen im Optical Stretcher ohne direkten mechanischen Kontakt durch zwei gegenüberliegende Laserstrahlen verformt. Dabei wurde die relative Deformation als Längenänderung entlang der Laserachse von gedehnter zu ungedehnter Zelle definiert. Die relative Deformation dient als Vergleichsparameter und unterliegt verschiedenen Einflussfaktoren. Schließlich erlauben das Maß und die Art der Deformation, welche individuell für jede Zelle sind, Rückschlüsse auf ihr biologisches Verhalten. In Kombination mit statistischen Auswertungsalgorithmen war es möglich, signifikante Unterschiede hinsichtlich der relativen Dehnung zwischen benignen und malignen oralen Zellen darzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Optical Stretcher in der Lage ist, bereits minimale Veränderungen zwischen den verschiedenen zytoskelettalen Zuständen einer Zelle zu detektieren und somit wird sich die Dehnungsfähigkeit einer Zelle zukünftig als sensibler Zellmarker zur Dignitätsbestimmung etablieren.

Orale Plattenepithelkarzinome stellen seit Jahrzehnten eine globale Herausforderung im Gesundheitswesen dar. In dieser Studie wird mit dem Optical Stretcher ein neuer diagnostischer Ansatz in der Krebserkennung der Mundhöhle untersucht und im Rahmen einer klinischen Pilotstudie evaluiert. Dabei steht die Beurteilung der viskoelastischen Eigenschaften von oralen Epithelzellen im Vordergrund. Eine entscheidende Rolle spielt hierbei vor allem das Zytoskelett einer Zelle, welches aus unterschiedlichen Faserstrukturen ein komplexes, dynamisches Gerüst bildet und für die Strukturgebung sowie für die mechanischen Eigenschaften der unterschiedlichen Zelltypen verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden diesbezüglich einzelne Zellen im Optical Stretcher ohne direkten mechanischen Kontakt durch zwei gegenüberliegende Laserstrahlen verformt. Dabei wurde die relative Deformation als Längenänderung entlang der Laserachse von gedehnter zu ungedehnter Zelle definiert. Die relative Deformation dient als Vergleichsparameter und unterliegt verschiedenen Einflussfaktoren. Schließlich erlauben das Maß und die Art der Deformation, welche individuell für jede Zelle sind, Rückschlüsse auf ihr biologisches Verhalten. In Kombination mit statistischen Auswertungsalgorithmen war es möglich, signifikante Unterschiede hinsichtlich der relativen Dehnung zwischen benignen und malignen oralen Zellen darzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Optical Stretcher in der Lage ist, bereits minimale Veränderungen zwischen den verschiedenen zytoskelettalen Zuständen einer Zelle zu detektieren und somit wird sich die Dehnungsfähigkeit einer Zelle zukünftig als sensibler Zellmarker zur Dignitätsbestimmung etablieren.

Physical forces in the cellular microenvironment play an important role in governing cell function. Forces transmitted through the cell cause distinct deformation of the nucleus, and possibly play a role in force-mediated gene expression. The work presented in this thesis drew upon innovative strategies employing simultaneous atomic force and laser-scanning confocal microscopy, as well as parallel optical stretching experiments, to gain unique insights into the response of eukaryotic cell nuclei to external force. Non-destructive approaches confirmed the existence of a clear anisotropy in nuclear mechanical properties, and showed that the nucleus' mechanical response to extracellular forces is differentially governed by both nuclear and cytoskeletal prestress: nuclear prestress regulates shape and anisotropic deformation, whereas cytoskeletal prestress modulates the magnitude and degree of deformation. Importantly, the anisotropic mechanical response was conserved among diverse differentiated cell types from multiple species, suggesting that nuclear mechanical anisotropy plays an important role in cell function.

Physical forces in the cellular microenvironment play an important role in governing cell function. Forces transmitted through the cell cause distinct deformation of the nucleus, and possibly play a role in force-mediated gene expression. The work presented in this thesis drew upon innovative strategies employing simultaneous atomic force and laser-scanning confocal microscopy, as well as parallel optical stretching experiments, to gain unique insights into the response of eukaryotic cell nuclei to external force. Non-destructive approaches confirmed the existence of a clear anisotropy in nuclear mechanical properties, and showed that the nucleus' mechanical response to extracellular forces is differentially governed by both nuclear and cytoskeletal prestress: nuclear prestress regulates shape and anisotropic deformation, whereas cytoskeletal prestress modulates the magnitude and degree of deformation. Importantly, the anisotropic mechanical response was conserved among diverse differentiated cell types from multiple species, suggesting that nuclear mechanical anisotropy plays an important role in cell function.

Physical forces in the cellular microenvironment play an important role in governing cell function. Forces transmitted through the cell cause distinct deformation of the nucleus, and possibly play a role in force-mediated gene expression. The work presented in this thesis drew upon innovative strategies employing simultaneous atomic force and laser-scanning confocal microscopy, as well as parallel optical stretching experiments, to gain unique insights into the response of eukaryotic cell nuclei to external force. Non-destructive approaches confirmed the existence of a clear anisotropy in nuclear mechanical properties, and showed that the nucleus' mechanical response to extracellular forces is differentially governed by both nuclear and cytoskeletal prestress: nuclear prestress regulates shape and anisotropic deformation, whereas cytoskeletal prestress modulates the magnitude and degree of deformation. Importantly, the anisotropic mechanical response was conserved among diverse differentiated cell types from multiple species, suggesting that nuclear mechanical anisotropy plays an important role in cell function.

Untersucht wurden MCF7-neuT-Zellen bezüglich ihrer optischen Verformbarkeit im Optical Stretcher, zeitabhängig nach Beginn einer ErbB2-Überexpression. Es konnte gezeigt werden, dass sich Brustkrebszellen 24 Stunden nach Beginn einer induzierten ErbB2-Überexpression deutlich von Kontrollzellen unterscheiden, indem sie sich aktiv gegen äußeren Zug zusammenziehen. Dieses als Mechanoaktivierbarkeit bekannte Phänomen ist ein Zeichen von Malignität. Nach zwei Tagen ErbB2-Überexpression zeigt sich diese Mechanoaktivierbarkeit allenfalls noch residuell, nach vier Tagen gibt es keinen Unterschied mehr zu den Kontrollzellen ohne ErbB2-Überexpression. Eine mögliche Deutung dieser Ergebnisse wäre ein Zweiphasen-Modell der Entstehung der ErbB2-überexprimierenden Brusttumore und ihrer frühen Mikrometastasen: In der ersten Phase werden die Zellen aktiv und kontraktil und sind so in der Lage, sich aus dem Zellverband zu lösen und ihren Ursprungsort zu verlassen. Bereits nach zwei bis vier Tagen sind sie aber nicht mehr von unveränderten, benignen Zellen zu unterscheiden und können unerkannt und unerreichbar für Chemotherapeutika als „dormant cells“ viele Jahre überdauern.:1 Abkürzungsverzeichnis 5 2 Einleitung 6 3 Biologische Grundlagen 10 3.1 Der ErbB2-Rezeptor 10 3.1.1 Rezeptoren der epithelialen Wachstumsfaktoren 10 3.1.2 ErbB2-Überexpression im Rahmen der Kanzerogenese 13 3.1.3 Zeitliche Veränderungen nach induzierter ErbB2-Rezeptor-Überexpression 18 3.2 Das Zytoskelett 19 4 Physikalischer Hintergrund 23 4.1 Viskoelastizität semiflexibler Polymere als zelluläre Strukturbasis 23 4.2 Überblick der bisherigen Zellelastizitätsmessungen 24 4.3 Der Optical Stretcher 25 4.3.1 Vergleich mit herkömmlichen Verfahren 25 4.3.2 Berechnung des Spannungsprofils 27 5 Aufgabenstellung 33 6 Material und Methoden 34 6.1 Verwendete Zellen 34 6.1.1 Zelllinien 34 6.1.2 Zellkultur 35 6.1.3 Zellvorbereitung 36 6.2 Elastizitätsmessungen am Optical Stretcher 37 6.3 Methodik Auswertung 41 6.3.1 Zellstatistik 41 6.3.2 Fluoreszenzmessungen 43 6.3.3 Bildauswertung 44 6.3.4 Verformungskurven und initiale Integrale 46 7 Ergebnisse 49 7.1 Motivation und Vorgehen 49 7.2 Reproduzierbarkeit der Daten 50 7.3 Entwicklung der optischen Verformbarkeit der Vektorkontrollzellen in Abhängigkeit von der Doxicyclinzugabe 53 7.3.1 Vektorkontrollzellen nach einem Tag Kulturdauer 53 7.3.2 Vektorkontrollzellen nach zwei Tagen Kulturdauer 55 7.3.3 Vektorkontrollzellen nach vier Tagen Kulturdauer 57 7.4 Entwicklung der optischen Verformbarkeit der MCF-7/neuT-Zellen in Abhängigkeit von der Doxicyclinzugabe 59 7.4.1 NeuT-Zellen nach einem Tag Kulturdauer 59 7.4.2 NeuT-Zellen nach zwei Tagen Kulturdauer 61 7.4.3 NeuT-Zellen nach vier Tagen Kulturdauer 63 7.5 Vergleich MCF-7/neuT und Vektorkontrollzellen 65 7.5.1 Veränderung durch Expression des neuT-Genes 65 7.5.2 Veränderungen durch die Kulturdauer 68 7.6 Zusammenfassung 70 8 Diskussion und Ausblick 71 8.1 Statistische Relevanz 72 8.2 Biphasischer Verlauf der ErbB2-induzierten Zellveränderungen im Vergleich zu anderen Untersuchungen 72 8.3 Interpretation des biphasischen Musters 74 8.4 Ausblick 76 9 Zusammenfassung der Arbeit 78 10 Referenzen 81 10.1 Weblinks 91 11 Anlagen 92 11.1 Selbstständigkeitserklärung 92 11.2 Lebenslauf 93 11.2.1 Allgemeine Angaben 93 11.2.2 Schulische Ausbildung 93 11.2.3 Studium 93 11.2.4 beruflicher Werdegang 94 11.3 Publikation 95 11.4 Danksagung 96