Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen weiteren Schritt zur Aufklärung der visuellen Kaskade beizutragen. Erstmals konnten die Enthalpieänderungen für den G-Protein-Zyklus und dessen Teilreaktionen im Titrationskalorimeter am rekonstituierten System bestimmt werden. Der G-Protein-Zyklus Der Photorezeptor Rhodopsin katalysiert in seinem lichtaktivierten Zustand (R*) die Aktivierung des G-Proteins Transducin (Gt) durch Austausch von GDP gegen GTP in der Nukleotidbindungstasche von Transducin. Durch die intrinsische GTPase des G-Proteins, wird GTP hydrolysiert und Gt kehrt in den inaktiven Zustand zurück. Die Titration von GTP zum Komplex aus lichtaktiviertem Rhodopsin und Transducin (R*G-Komplex) ergab für den gesamten G-Protein-Zyklus eine Reaktionsenthalpie von - 4.6 ± 0.8 kcal pro Mol GTP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den in der Literatur aufgeführten Werten für die Reaktionsenthalpie der Hydrolyse von ATP zu ADP (- 4.9 kcal/Mol; Gajewski et al., 1986 [22 ]). Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus waren nicht direkt durch Titrationsexperimente zugänglich. Durch Variation der Konzentrationen der einzelnen Reaktionspartner konnten jedoch die unterschiedlichen Phasen des Wärmesignals zu Teilschritten des Zyklus zugeordnet und deren Reaktionsenthalpien bestimmt werden. Die R*G-Komplexbildung Der Bindung von R* an GGDP sind mehrere Reaktionen untrennbar überlagert. Die gemessene Enthalpieänderung von + 2.0 kcal/Mol ist die Summe der Wärmeänderungen durch Abgabe des an G[alpha] gebundenen GDP, Bindung von R* an Transducin und die Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen den Rhodopsin Intermediaten MI- und MII-Rhodopsin bei dieser Bindung.Die Komplexdissoziation Unter Verwendung von GTP[gamma]S wurde für die Komplexdissoziation eine Enthalpieänderung von - 4.4 kcal/Mol ermittelt. Es ist zu beachten, daß dieser Teilschritt sich aus mehreren Reaktionen zusammensetzt. Dies sind die Bindung des zugegebenen GTPgS an den R*G-Komplex, die Dissoziation von R* und Transducin, die Trennung der Untereinheiten des G-Proteins und die Einstellung des MI-MII-Gleichgewichtes nach Freiwerden des Rhodopsins. Da die Wärmeänderung der genannten Reaktionen nicht separat bestimmt werden konnte, entspricht die im Kalorimeter gemessene Wärme der Summe der Enthalpieänderungen dieser Reaktionen.Die Hydrolysereaktion von GGTP zu GGDP Die Enthalpieänderung durch Hydrolyse des an Transducin gebundenen GTP zu GDP wurde aus der Gesamtwärme des Zyklus zu - 2.2 kcal/Mol errechnet. Die Reaktionsenthalpie des gesamten Zyklus wird nur von der Energieabgabe des GTP bestimmt, dabei wird die Energie des GTP jedoch nicht vollständig bei der Hydrolyse des Transducin-gebundenen GTP zu GDP frei. Die Differenz zwischen der Gesamtenthalpieänderung und der Wärme, die bei Hydrolyse von Gt-gebundenem GTP frei wird, liegt in einer höheren inneren Energie von Transducin in der GTP-bindenden Konformation als im GDP-bindenden Zustand.

PixD (Slr1694) ist ein Photorezeptor, der den sensors of blue light using FAD (BLUF) Proteinen zugeordnet wurde. Die Übertragung des Stimulus auf das Apoprotein erfolgt in dieser Proteinfamilie über eine Neuordnung des Wasserstoffbrückennetzwerkes um den Kofaktor, in das die strikt konservierten Reste Tyrosin-8 (Y8), Glutamin-50 (Q50) und möglicherweise das semi-konservierte Tryptophan-91 (W91) involviert sind. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Hinweise auf die Wasserstoffbrückenkonfiguration der Flavinbindetasche in Dunkel- und Lichtzustand zu erhalten, um eine bessere Vorstellung von der Stabilisierung des Lichtzustandes zu bekommen und mögliche Wege der Signaltransduktion an die Proteinoberfläche einzugrenzen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich lichtaktivierte Interaktionsänderungen zwischen Apoprotein und Chromophor auf die Neubildung einer Wasserstoffbrücke zum Flavin C4-Carbonyl beschränken. In Übereinstimmung zu früheren Analysen liegt das Q50 im Dunkelzustand in seiner Amid-Form vor. Sein Seitenkettencarbonyl ist im Lichtzustand vermutlich zu Y8 ausgerichtet, wobei Hinweise auf eine Amid-Imidsäure-Tautomerisierung des Glutamins in PixD gefunden wurden. Eine selektive Isotopenmarkierung des Tryptophan-91 zeigte Anzeichen für eine Verlängerung des β5-Stranges, die wahrscheinlich ein zentrales Element der Signalweiterleitung an die Proteinoberfläche darstellt. Möglicherweise erstreckt sich das Wasserstoffbrückennetzwerk dabei bis in die über dem beta5-Strang liegende alpha-Helix. Wird es gestört, scheint das Proteininnere für Imidazol zugänglich gemacht zu werden, wo es die Aktivierungsenergie für die Rückkehr in den Dunkelzustand beeinflusst. Auch Substitutionen des H73 im gegenüberliegenden Eckstrang des beta-Faltblattes beeinflussten die Geschwindigkeit der Dunkelrelaxation von PixD. Sie veränderten die IR-Absorption gegenüber dem Wildtyp jedoch nicht und unterstützen die Theorie einer Protonenleitung über das benachbarte H72. / The photoreceptor PixD (Slr1694) belongs to the sensors of blue light using FAD (BLUF) protein family. These photoreceptors propagate the signal by a rearrangement of hydrogen bonds surrounding the cofactor, involving the highly conserved residues tyrosine-8 (Y8), glutamine 50 (Q50) and perhaps the semi-conserved tryptophan-91 (W91). One aim of the presented work was to gain a deeper insight into the hydrogen bond configuration of the flavin binding pocket in the light and dark state conformations. Thereby, knowledge of the stabilization mechanisms for the light state and the signal propagation to the protein surface could be acquired. The results indicate a restriction of light induced changes in hydrogen bonding of the flavin to its C4 carbonyl. In agreement with former studies, the Q50 forms the amide isomer in the dark state. Its side chain carbonyl group most likely points towards Y8 in the active protein. Besides, the results support an amide-imidic acid-tautomerization of Q50 in PixD. A selective isotope labeling of the tryptophan-91 localized at the beginning of an edge strand of the beta sheet indicates an elongation of the secondary structure that may represent a central element of the signal propagation to the protein surface. The secondary structure is possibly connected with an alpha helix located above the beta5 strand by hydrogen bonds. A disturbance of this interaction probably allows the base catalyst imidazole to enter the protein core. Substitutions of H73 in the opposing edge beta strand changed the rate of the PixD dark relaxation as well. However, they had no visible effect on the infrared absorbance compared to the wild type and hence support a putative involvement of the neighbouring H72 in proton transfer reactions.

Diese Doktorarbeit führt ein hierarchisches Modell für das unüberwachte Lernen aus quasi-natürlichen Videosequenzen ein. Das Modell basiert auf den Lernprinzipien der Langsamkeit und Spärlichkeit, für die verschiedene Ansätze und Implementierungen vorgestellt werden. Eine Vielzahl von Neuronentypen im Hippocampus von Nagern und Primaten kodiert verschiedene Aspekte der räumlichen Umgebung eines Tieres. Dazu gehören Ortszellen (place cells), Kopfrichtungszellen (head direction cells), Raumansichtszellen (spatial view cells) und Gitterzellen (grid cells). Die Hauptergebnisse dieser Arbeit basieren auf dem Training des hierarchischen Modells mit Videosequenzen aus einer Virtual-Reality-Umgebung. Das Modell reproduziert die wichtigsten räumlichen Codes aus dem Hippocampus. Die Art der erzeugten Repräsentationen hängt hauptsächlich von der Bewegungsstatistik des simulierten Tieres ab. Das vorgestellte Modell wird außerdem auf das Problem der invaranten Objekterkennung angewandt, indem Videosequenzen von simulierten Kugelhaufen oder Fischen als Stimuli genutzt wurden. Die resultierenden Modellrepräsentationen erlauben das unabhängige Auslesen von Objektidentität, Position und Rotationswinkel im Raum. / This thesis introduces a hierarchical model for unsupervised learning from naturalistic video sequences. The model is based on the principles of slowness and sparseness. Different approaches and implementations for these principles are discussed. A variety of neuron classes in the hippocampal formation of rodents and primates codes for different aspects of space surrounding the animal, including place cells, head direction cells, spatial view cells and grid cells. In the main part of this thesis, video sequences from a virtual reality environment are used for training the hierarchical model. The behavior of most known hippocampal neuron types coding for space are reproduced by this model. The type of representations generated by the model is mostly determined by the movement statistics of the simulated animal. The model approach is not limited to spatial coding. An application of the model to invariant object recognition is described, where artificial clusters of spheres or rendered fish are presented to the model. The resulting representations allow a simple extraction of the identity of the object presented as well as of its position and viewing angle.

Rhodopsin ist der Photorezeptor der Stäbchenzellen in der Retina von Vertebraten und wird als Prototyp für die gesamte Gruppe der GPCRs beforscht. Trifft ein Photon auf das Protein, so wird der über eine Schiffbase kovalent gebundene Chromophor von seiner 11-cis- in die All-trans-Konfiguration isomerisiert und setzt infolgedessen den Aktivierungsprozess in Gang. Dieser mündet in der aktiven Rezeptorkonformation, die das G-Protein Transducin aktivieren kann und dadurch eine Kaskade weiterer Aktivierungsschritten einleitet, die letztlich ein Nervensignal verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der späten Aktivierungsschritte und ihrer Ursache-Wirkungs-Beziehungen. Zu diesem Zweck wurden Blitzlichtphotolyse, Elektronenspinresonanz (EPR) mit Spinlabeling (SDSL), UV/vis-Spektroskopie, FTIR-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie angewandt. Kinetische Messungen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, um die Abfolge der mit den unterschiedlichen Techniken zugänglichen Aktivierungsschritte aufzuklären. Nach der Bildung des absorptionsspektroskopisch definierten Meta-II-Zustands bewegt sich die Helix TM6 in einem späteren Schritt als ganzes nach außen und markiert damit den Übergang von Meta-IIa zu Meta-IIb. Dadurch wird die bis dahin in der Membran verborgene D(E)RY-Region für das Umgebungsmedium zugänglich und nimmt ohne Zeitverzögerung ein Proton auf, wodurch der Meta-IIb*H+-Zustand gebildet wird. Die verfügbaren Daten sprechen dafür, dass das D(E)RY-Motiv bei der Aktivierung des Transducins sowohl die Alpha- als auch die Gamma-Untereinheit desselben bindet. Die Bindung von zu Transducin-Abschnitten analogen Peptiden kann dann erfolgen, wenn die Helix TM6 im nach außen bewegten Zustand ist, und führt zur Abgabe von bis zu zwei Protonen vom aktivierten Rhodopsin. Sowohl das D(E)RY- und das NPxxY(x)5,6F-Motiv als auch die beiden Zustände Meta-IIb und Meta-IIb*H+ könnten relevant für den sequenziellen Transducin-Aktivierungsmechanismus sein. / Rhodopsin is the photoreceptor in the rod cells of the vertebrate retina. It is considered as a prototype of the whole group of GPCRs. Upon absorption of a photon the chromophore, which is covalently bound through a Schiff base, is isomerized from its 11-cis into the all-trans configuration. This initiates the activation process and finally results in the active receptor conformation which is capable of activating the G protein transducin and thereby triggers a cascade of further activation steps which finally cause a nerve signal. The aim of this work was the clarification of the late activation steps and their cause-and-effect chain. For this purpose flash photolysis, electron paramagnetic resonance (EPR) with spin labeling (SDSL), UV/vis spectroscopy, FTIR spectroscopy and fluorescence spectroscopy were applied. Kinetic measurements were executed under identical conditions in order to elucidate the sequence of activation steps, which are accessible with the different techniques. After formation of the spectroscopically defined Meta-II state helix TM6 moves outward as a rigid body, thereby marking the transition from Meta-IIa to Meta-IIb. Therefore the D(E)RY region, which is until then buried in the membrane, gets accessible to the surrounding solution. It consequently takes up a proton without delay, thus forming the Meta-IIb*H+ state. Available data argue for the D(E)RY motif binding both the Alpha and the Gamma subunit of transducin during activation of the latter. The binding of peptides which are analogous to sections of transducin is possible when helix TM6 is in the outward position. It causes the release of up to two protons from the activated rhodopsin. Both the D(E)RY motif and the NPxxY(x)5,6F motif as well as both the states Meta-IIb and Meta-IIb*H+ are potentially relevant for the sequential transducin activation mechanism.

Die Aufgabe des Proteins Arrestin ist die Beendigung der Signalweitergabe über den GPCR Signalweg. In Stäbchenzellen bindet Arrestin an Licht-aktiviertes phosphoriliertes Rhodopsin um die Signalweitergabe zu unterdrücken. Die Bindung von Arrestin an Rhodopsin erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wechselwirkt Arrestin mit dem phosphorilierten C-Terminus von Rhodopsin und bildet einen prä-Komplex, dies induziert Konformationsänderungen im Arrestin wodurch die Bildung eines High-affinity Komplex unter Kopplung an den helikalen Kern des aktivierten Rezeptors erfolgen kann. Biochemische Untersuchungen und Kristallstrukturen haben einen Einblick in die Konformation des Komplexes aus Arrestin und Rhodopsin ermöglicht. In dieser Arbeit werden site-directed Fluorezenz Experimente angewandt um die strukturellen Änderungen zu untersuchen, die bei der Bindung von Arrestin an Rhodopsin ablaufen und der nterschiedlichen Bindungsmodi innerhalb der Wechselwirkung zwischen Arrestin und Rhodopsin. Insbesondere wird hier eine, bisher nicht beschriebene, Assoziation von Arrestin an die Membran untersucht. Des Weiteren wurden Erkenntnisse über die Struktur des prä-Komplexes gewonnen. Die Konformation vom Arrestin im prä-Komplex scheint die Konformation im Basalzustand nachzubilden unter Beteiligung zweier Kontaktstellen: Interaktion mit dem phosphorilierten C-Terminus des Rezeptors und Assoziation mit der Membran. Beim Übergang in den High-affinity Komplex durchläuft Arrestin eine Konformationsänderung in eine aktivere Konformation: der C-Terminus wird verdrängt, es erfolgt eine Neuausrichtung der zentralen flexiblen Schleifen und die Orientierung des Membranankers ändert sich. Die Aufgabe des prä-Komplexes ist somit Arrestin und den Rezeptor zusammen zu bringen sowie die korrekte Orientierung sicherzustellen um einen schnellen Übergang in den High-affinity Komplex zu ermöglichen. / The protein arrestin is responsible for termination of GPCR signalling. In the rod cell, arrestin binds light-activated phosphorylated rhodopsin in order to block further signal transduction. The binding of arrestin to rhodopsin is a two-step process. Arrestin first interacts with the phosphorylated receptor C-terminus in a pre-complex, which induces conformational changes in arrestin that allow coupling to the helical core of the active receptor in a high-affinity complex. Biochemical studies and crystal structures have provided insights into the conformation of the arrestin-rhodopsin complex. This dissertation describes site-directed fluorescence experiments, which were carried out to further investigate the conformational changes occurring upon arrestin binding to rhodopsin and the nature of different binding modes of the arrestin-rhodopsin interaction. In particular this involved characterization of a previously unidentified association of arrestin with the membrane, as well as further elucidation of the structure of the pre-complex. The conformation of arrestin in the pre-complex is indicated to resemble that of the basal state of arrestin, and involves two sites of contact: interaction with the phosphorylated receptor C-terminus, and association with the membrane. Upon transition to the high-affinity complex, arrestin undergoes a conformational change to a more active conformation: the auto-inhibitory C-tail is displaced, there is movement within the central flexible loops, and the orientation of the membrane anchor changes. The pre-complex therefore most likely functions to bring arrestin and the receptor into close contact, and in the correct orientation, to allow for fast transition to the high-affinity complex.

In dieser Dissertation wird ein Modell des visuellen Systems untersucht, basierend auf dem Prinzip des unüberwachten Langsamkeitslernens und des SFA-Algorithmus (Slow Feature Analysis). Dieses Modell wird hier für die invariante Objekterkennung und verwandte Probleme eingesetzt. Das Modell kann dabei sowohl die zu Grunde liegenden diskreten Variablen der Stimuli extrahieren (z.B. die Identität des gezeigten Objektes) als auch kontinuierliche Variablen (z.B. Position und Rotationswinkel). Dabei ist es in der Lage, mit komplizierten Transformationen umzugehen, wie beispielsweise Tiefenrotation. Die Leistungsfähigkeit des Modells wird zunächst mit Hilfe von überwachten Methoden zur Datenanalyse untersucht. Anschließend wird gezeigt, dass auch die biologisch fundierte Methode des Verstärkenden Lernens (reinforcement learning) die Ausgabedaten unseres Modells erfolgreich verwenden kann. Dies erlaubt die Anwendung des Verstärkenden Lernens auf hochdimensionale visuelle Stimuli. Im zweiten Teil der Arbeit wird versucht, das hierarchische Modell mit Top-down Prozessen zu erweitern, speziell für die Rekonstruktion von visuellen Stimuli. Dabei setzen wir die Methode der Vektorquantisierung ein und verbinden diese mit einem Verfahren zum Gradientenabstieg. Die wesentlichen Komponenten der für unsere Simulationen entwickelten Software wurden in eine quelloffene Programmbibliothek integriert, in das ``Modular toolkit for Data Processing'''' (MDP). Diese Programmkomponenten werden im letzten Teil der Dissertation vorgestellt. / This thesis examines a model of the visual system, which is based on the principle of unsupervised slowness learning and using Slow Feature Analysis (SFA). We apply this model to the task of invariant object recognition and several related problems. The model not only learns to extract the underlying discrete variables of the stimuli (e.g., identity of the shown object) but also to extract continuous variables (e.g., position and rotational angles). It is shown to be capable of dealing with complex transformations like in-depth rotation. The performance of the model is first measured with the help of supervised post-processing methods. We then show that biologically motivated methods like reinforcement learning are also capable of processing the high-level output from the model. This enables reinforcement learning to deal with high-dimensional visual stimuli. In the second part of this thesis we try to extend the model with top-down processes, centered around the task of reconstructing visual stimuli. We utilize the method of vector quantization and combine it with gradient descent. The key components of our simulation software have been integrated into an open-source software library, the Modular toolkit for Data Processing (MDP). These components are presented in the last part of the thesis.

Die Suche nach einem Zielobjekt in einer komplexen visuellen Szene ist ein alltäglicher Wahrnehmungsvorgang und ein etabliertes experimentelles Paradigma für die Untersuchung selektiver Aufmerksamkeit. Einem klassischen Modell zufolge ist der Suchprozeß seriell: Die Objekte werden nacheinander vom Aufmerksamkeitsfokus selektiert und so für die Identifikation bereitgestellt. Ein Alternativmodell postuliert einen parallelen Suchprozeß, bei dem alle Objekte in der Szene gleichzeitig vom Sehsystem verarbeitet werden. Beide Modelltypen sind gleich gut mit den Resultaten bisheriger Verhaltensexperimente kompatibel. In der vorliegenden Arbeit wurden die neuronalen Grundlagen des Suchprozesses mit Hilfe der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT) im menschlichen Gehirn untersucht. Es ist bekannt, dass das frontale Augenfeld (FEF) und drei Subregionen (AIPS, PIPS und IPTO) des posterioren parietalen Cortex (PPC) den im seriellen Suchmodell postulierten Teilprozeß der Verschiebung des Aufmerksamkeitsfokus (ohne Augenbewegungen) kontrollieren. In Experiment 1 wurde geprüft, ob diese Regionen auch am Suchprozeß beteiligt sind. Dazu wurde das fMRT-Signal zwischen einer schwierigen Suche nach einer Verknüpfung zweier visueller Merkmale und einer einfachen Suche nach einem einzelnen Merkmal verglichen. Motorische Anforderungen und Reizmuster waren in beiden Bedingungen so ähnlich wie möglich und in Kontrollexperimenten wurde sichergestellt, dass Aktivierungsunterschiede zwischen beiden Bedingungen keine motorischen oder sensorischen Prozesse reflektieren, sondern spezifisch den Prozeß der Verknüpfungssuche. FEF, AIPS, PIPS und IPTO wurden differentiell aktiviert. In Experiment 2 wurde getestet, ob die Beteiligung dieser Areale an der visuellen Suche von der Notwendigkeit einer Merkmalsverknüpfung abhängt. Dazu wurde eine schwierige Merkmalssuche mit der einfachen Merkmalssuche verglichen und kontrolliert, dass auch dieser Vergleich sensorische und motorische Faktoren eliminierte. Differentielle Aktivierungen in diesem Experiment reflektierten nun nicht mehr den Merkmalsverknüpfungsprozeß, sondern allein die höhere Schwierigkeit der Suche. Auch hier fand sich eine differentielle Aktivierung des FEF, AIPS, PIPS und IPTO. Dabei unterschieden sich die Schwierigkeit auf der Verhaltensebene wie auch die differentielle Aktivierung von PIPS auf der neuronalen Ebene nicht zwischen Verknüpfungs- und schwieriger Merkmalssuche. Die Ergebnisse demonstrieren, dass das FEF und drei Subregionen des PPC an der schwierigen visuellen Suche beteiligt sind. Dies ist gut mit der Annahme eines seriellen und nur schwer mit der eines parallelen Suchprozesses vereinbar. Darüber hinaus suggerieren die Befunde, dass der Beitrag des PPC und FEF zur visuellen Suche nicht auf den Prozeß der Merkmalsverknüpfung beschränkt ist, sondern allgemeiner die Anforderung an den Suchprozeß reflektiert. / The search for a target object in a complex visual scene is an all-day process of visual perception and an established experimental paradigm for the study of selective attention. A classical model postulates a serial search process. That is, objects are selected sequentially by the focus of attention and are thereby routed to the identification stage. An alternative model postulates a parallel search process, in which all objects within the scene are processed simultaneously. Both models are equally consistent with the current behavioural data. In this thesis, the neural basis of the search process in the human brain was investigated with functional magnetic resonance imaging (fMRI). The frontal eye field (FEF) and three sub-regions (AIPS, PIPS und IPTO) of the posterior parietal cortex (PPC) are known to control the shifting of the focus of attention in space (without eye movements), which is postulated by the serial model to be an essential sub-process of visual search. Experiment 1 tested whether the same areas are also engaged in the search process. The fMRI signal was compared between a difficult search for a feature conjunction and an easy search for a single feature. Motor requirements and stimuli were as similar as possible across conditions and control experiments demonstrated that activation differences between conditions do not reflect sensory or motor factors, but rather the process of conjunction search. The FEF, AIPS, PIPS, and IPTO were differentially activated. Experiment 2 tested whether the involvement of these areas in visual search depends on the necessity for conjoining features. A difficult feature search was compared with the easy feature search. This comparison also eliminated sensory and motor factors according to control experiments. Differential activations in this experiment did not reflect the feature conjunction process, but only the higher search difficulty. Again, a differential activation of the FEF, AIPS, PIPS, and IPTO was found. The conjunction and the difficult feature search did not differ in their difficulty at the behavioral level as well as in PIPS activation strength at the neural level. The results show that the FEF and three PPC sub-regions contribute to difficult visual search. This is consistent with the assumption of a serial, but much less consistent with the assumption of a parallel, search process. Furthermore the results suggest that the contribution of the PPC and FEF to visual search is not restricted to the feature conjunction process, but more generally reflects the demands on the search process.