京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第23723号 / 理博第4813号 / 新制||理||1689(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)教授 寺嶋 正秀, 教授 林 重彦, 教授 渡邊 一也 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

PixD (Slr1694) ist ein Photorezeptor, der den sensors of blue light using FAD (BLUF) Proteinen zugeordnet wurde. Die Übertragung des Stimulus auf das Apoprotein erfolgt in dieser Proteinfamilie über eine Neuordnung des Wasserstoffbrückennetzwerkes um den Kofaktor, in das die strikt konservierten Reste Tyrosin-8 (Y8), Glutamin-50 (Q50) und möglicherweise das semi-konservierte Tryptophan-91 (W91) involviert sind. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Hinweise auf die Wasserstoffbrückenkonfiguration der Flavinbindetasche in Dunkel- und Lichtzustand zu erhalten, um eine bessere Vorstellung von der Stabilisierung des Lichtzustandes zu bekommen und mögliche Wege der Signaltransduktion an die Proteinoberfläche einzugrenzen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich lichtaktivierte Interaktionsänderungen zwischen Apoprotein und Chromophor auf die Neubildung einer Wasserstoffbrücke zum Flavin C4-Carbonyl beschränken. In Übereinstimmung zu früheren Analysen liegt das Q50 im Dunkelzustand in seiner Amid-Form vor. Sein Seitenkettencarbonyl ist im Lichtzustand vermutlich zu Y8 ausgerichtet, wobei Hinweise auf eine Amid-Imidsäure-Tautomerisierung des Glutamins in PixD gefunden wurden. Eine selektive Isotopenmarkierung des Tryptophan-91 zeigte Anzeichen für eine Verlängerung des β5-Stranges, die wahrscheinlich ein zentrales Element der Signalweiterleitung an die Proteinoberfläche darstellt. Möglicherweise erstreckt sich das Wasserstoffbrückennetzwerk dabei bis in die über dem beta5-Strang liegende alpha-Helix. Wird es gestört, scheint das Proteininnere für Imidazol zugänglich gemacht zu werden, wo es die Aktivierungsenergie für die Rückkehr in den Dunkelzustand beeinflusst. Auch Substitutionen des H73 im gegenüberliegenden Eckstrang des beta-Faltblattes beeinflussten die Geschwindigkeit der Dunkelrelaxation von PixD. Sie veränderten die IR-Absorption gegenüber dem Wildtyp jedoch nicht und unterstützen die Theorie einer Protonenleitung über das benachbarte H72. / The photoreceptor PixD (Slr1694) belongs to the sensors of blue light using FAD (BLUF) protein family. These photoreceptors propagate the signal by a rearrangement of hydrogen bonds surrounding the cofactor, involving the highly conserved residues tyrosine-8 (Y8), glutamine 50 (Q50) and perhaps the semi-conserved tryptophan-91 (W91). One aim of the presented work was to gain a deeper insight into the hydrogen bond configuration of the flavin binding pocket in the light and dark state conformations. Thereby, knowledge of the stabilization mechanisms for the light state and the signal propagation to the protein surface could be acquired. The results indicate a restriction of light induced changes in hydrogen bonding of the flavin to its C4 carbonyl. In agreement with former studies, the Q50 forms the amide isomer in the dark state. Its side chain carbonyl group most likely points towards Y8 in the active protein. Besides, the results support an amide-imidic acid-tautomerization of Q50 in PixD. A selective isotope labeling of the tryptophan-91 localized at the beginning of an edge strand of the beta sheet indicates an elongation of the secondary structure that may represent a central element of the signal propagation to the protein surface. The secondary structure is possibly connected with an alpha helix located above the beta5 strand by hydrogen bonds. A disturbance of this interaction probably allows the base catalyst imidazole to enter the protein core. Substitutions of H73 in the opposing edge beta strand changed the rate of the PixD dark relaxation as well. However, they had no visible effect on the infrared absorbance compared to the wild type and hence support a putative involvement of the neighbouring H72 in proton transfer reactions.

Die Photophysik und Photochemie von Flavinen sind aufgrund ihrer biologischen Funktion, inbesondere von Flavoproteinen, von großen Interesse. Flavoproteine spielen eine große Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, z.B. Biolumineszenz, Entfernung von Radikalen, die bei oxidativem Stress entstehen, Photosynthese und DNA-Reparatur. Die spektroskopischen Eigenschaften des Flavin-Cofaktors machen diesen zu einem natürlichen Reporter für Veränderungen innerhalb des aktiven Zentrums. Deshalb sind die Flavoproteine eine der am meisten untersuchten Enzymfamilien. Eine biologische Aktivität des Flavins führt über einen elektronisch angeregten Zustand, wo dann, abhängig von der Aminosäureumgebung, ein bestimmter Mechanismus zu einem biologischen Prozess führt (Photozyklus). Ein wichtiges Analysetool zum Verständnis des anfänglichen Photoanregungsschritts der Flavine sind die elektronische und die Schwingungsspektroskopie. In dieser Arbeit wurden die Prozesse von Riboflavin (RF) während und nach optischer Anregung mit theoretischen Mitteln beleuchtet. Dazu wurden quantenchemische Berechnungen für Schwingungsspektren (vibratorische) von Riboflavin, auch Laktoflavin oder Vitamin B2 genannt, dem Grundmolekül der Chromophore biologischer Blaulichtrezeptoren, in dessen elektronischem Grundzustand und dessen niedrigsten angeregten Zustand durchgeführt. Weiterhin wurden vibronische (vibratorische+elektronische) Absorptionsspektren und ein vibronisches Emissionsspektrum berechnet. Die so berechneten Schwingungs- und elektronischen Spektren sind in guter qualitativer wie quantitativer Übereinstimmung mit gemessenen Werten, und helfen so, die experimentellen Signale der Photoanregung von Flavinen zuzuweisen. Unmittelbar nach der Photoanregung wurde ein Verlust des Doppelbindungscharakters im polaren Bereich des Ringssystems beobachtet, was zu der vibronischen Feinstruktur im elektronischen Absorptions- und Emissionsspektrum führte. Hier zeigte sich zudem, dass neben den vibronischen Effekten auch die Lösungsmitteleffekte wichtig für das quantitative Verständnis der Photophysik der Flavine in Lösung sind. Um Details des optischen Anregungsprozesses als initialen, elementaren Schritt zur Signalweiterleitung zu entschlüsseln, wurden ultraschnelle (femtosekundenaufgelöste) Experimente durchgeführt, die die Photoaktivierung des Flavins untersuchen. Diese Arbeit soll zu einem weiteren Verständnis und der Interpretation dieser Experimente durch das Studium der Post-Anregungsschwingungsdynamik von Riboflavin und mikrosolvatisiertem Riboflavin beitragen. Dazu wurde eine 200 fs lange Molekulardynamik in angeregten Zuständen betrachtet. Durch die Analyse charakteristischer Atombewegungen und durch die Berechnungen zeitaufgelöster Emissionsspektren fand man heraus, dass nach der optischen Anregung Schwingungen im Ringssystem des Riboflavins einsetzen. Mit Hilfe dieser Berechnungen kann die Umverteilung der Energie im angeregten Zustand beobachtet werden. Neben den theoretischen Untersuchungen zu Riboflavin in der Gasphase und auch in Lösung wurde ein Modell für eine BLUF (Blue-Light Photoreceptor Using Flavin) Domäne, ein Flavin benutzender Photorezeptor, erstellt. Hierbei zeigt sich, dass man die in dieser Arbeit angewendeten Analysemethoden auch auf biologisch relevante Systeme anwenden kann. / The photophysics and photochemistry of flavins are due to their biological function, in particular of flavoproteins, of great interest. Flavoproteins play a major role in a variety of biological processes, eg Bioluminescence, removal of free radicals, resulting in oxidative stress, photosynthesis and DNA repair. The spectroscopic properties of the flavin cofactor make this a natural reporter for changes within the active site. Therefore flavoproteins are one of the most studied enzyme families. A biological activity of the flavin via an electronically excited state, which then performs a function of the amino acid environment, a specific mechanism to a biological process (photo cycle). An important analytical tool for the understanding of the initial step of the photoexcitation flavins are the electronic and vibrational spectroscopy. In this study, the processes of riboflavin (RF) during and after optical excitation illuminated by theoretical means. These quantum chemical calculations for the vibrational spectra (vibrational) of riboflavin, or vitamin B2 lactoflavin also been mentioned, the basic molecule of biological chromophores blue light receptors in the electronic ground state and the lowest excited state performed. Furthermore, vibronic (vibrational + electronic) absorption spectra and vibronic emission spectra were calculated. The calculated vibrational and electronic spectra are in good qualitative and quantitative agreement with measured values, and help to assign the experimental signals of the photo-excitation of flavins. Immediately after photoexcitation a loss of the double bond character was observed in the polar region of the ring system, leading to the vibronic fine structure in the electronic absorption and emission spectrum. It showed also that in addition to the vibronic effects, the solvent effects are important for a quantitative understanding of the photophysics of flavins in solution. To decipher details of the optical excitation process as initial, elementary step in signal transduction, ultrafast were performed (femtosecond-resolved) experiments that investigate the photoactivation of the flavin. This work will contribute to a further understanding and interpretation of these experiments by studying the post-excitation vibrational dynamics of riboflavin and riboflavin mikrosolvatisiertem. To a 200 fs long molecular dynamics in excited states was considered. By the analysis of characteristic atomic motions and by the calculations of time-resolved emission spectra, it was found that, after the optical excitation oscillations in the ring system of the riboflavin used. Using these calculations, the energy redistribution in the excited state can be observed. In addition to the theoretical studies of riboflavin in the gas phase and in solution, a model for a BLUF (Blue Light Photoreceptor Using flavin) domain, a flavin-use photoreceptor created. It is shown that one can apply the analytical methods employed in this work and to biologically relevant systems.

In der Optogenetik werden genetisch codierbare Photorezeptorproteine in Zellen eingebracht, um spezifische Parameter durch Licht zu kontrollieren. Um den sekundären Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugänglich zu machen, haben wir vier neu identifizierte photoaktivierte Adenylatzyklasen untersucht. Die vier Gene stammen aus einem Sulfid oxidierenden Bakterium Beggiatoa und aus einem Amoeboflagellaten Naegleria gruberi. Sie codieren für 350 bis 489 Aminosäuren lange Proteine und enthalten eine Blaulicht wahrnehmende BLUF- (blue light sensors using FAD) und eine Adenylatzyklasedomäne. Zellbasierte Funktionstests in E. coli, Xenopus Oozyten und CHO Zellen sowie die Bestimmung der Adenylatzyklase-Aktivität in vitro zeigen, dass alle vier PACs lichtaktiviert arbeiten. Dabei besitzt die bakterielle PAC (bPAC) das größte Potenzial für eine optogenetische Anwendung, da sie eine hohe Lichtaktivität und ein große Licht-zu-Dunkel-Aktivitätsverhältnis besitzt. Um den Vorteil bPACs gegenüber PACalpha aus Euglena zu demonstrieren, verglichen wir beide PACS in Xenopus Oozyten, in Ratten Neuronen und in Drosophila Fliegen. Gegenüber PACalpha besitzt bPAC eine geringere Aktivität im Dunkeln, eine höhere Lichtsensitivität und einen breiteren dynamischen Bereiche und ist damit für viele Anwendungen die bevorzugte PAC. In einem analytischen Ansatz untersuchten wir die Bedeutung der BLUF-Domänen für die Regulation von bPAC. Nach Entfernen der BLUF-Domänen verblieb nur die inaktive Zyklase. Mutationen innerhalb der BLUF-Domäne, die die Photochemie oder die Signaltransduktion beeinflussten, führten zur Ausbildung eines partiell aktiven Rezeptorgrundzustandes. Dies verdeutlicht die Bedeutung eines intakten Wasserstoffbrückennetzwerkes für die funktionelle Regulation von bPAC. Als Ergenbis einer anwendungsorientierten Optimierung wurden eine bPAC Variante mit reduzierter Dunkelaktivität sowie eine Variante erhalten, die ein stabiles, neutrales Flavinradikal ausbildet. / Optogenetics represents the use of genetically encoded photoreceptor proteins to control specific parameters of cells by light. To particularly access optic control of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) we tested the suitability of four newly identified photoactivated adenylyl cyclases (PAC). Their genes originate from a soil bacterium Beggiatoa sp. and from an amoeboflagellate Naegleria gruberi. They code for 350 to 489 aa small proteins consisting of one blue light sensing BLUF (blue light sensors using FAD) and one adenylyl cyclase domain. Cell based functional assays in E. coli, Xenopus oocytes and CHO cells as well as in vitro analysis of recombinant protein reveal that all four PACs are light activated adenylyl cyclases. Moreover the bacterial PAC (bPAC) has the highest potential for an optogenetic application due to its high activity in light and low activity in the dark. To demonstrate the advantage of bPAC over the established Euglena PACalpha we compared both proteins in Xenopus oocytes, rat neurons and Drosophila fruit flies. It appears that bPAC features a lower activity in the dark, a higher light sensitivity and a broader dynamic range. Therefore bPAC is the superior optogenetic tool for many applications. In an analytical approach we investigated the impact of the BLUF domains on regulation of the cyclase. Removal of the BLUF domains left the bPAC cyclase in an inactive state. Mutating BLUF residues, which are involved either in photochemistry or signal transduction, resulted in a partially active dark state and reduced light activation of bPAC. Thus the integrity of the BLUF domain hydrogen bond network is essential for functional regulation of bPAC. As a result from application oriented optimization a bPAC variant with reduced dark activity as well as a variant that forms a stable neutral flavin radical was obtained.

In modern drug discovery, lead discovery is a term used to describe the overall process from hit discovery to lead optimisation, with the goal being to identify drug candidates. This can be greatly facilitated by the use of computer-aided (or in silico) techniques, which can reduce experimentation costs along the drug discovery pipeline. The range of relevant techniques include: molecular modelling to obtain structural information, molecular dynamics (which will be covered in Chapter 2), activity or property prediction by means of quantitative structure activity/property models (QSAR/QSPR), where machine learning techniques are introduced (to be covered in Chapter 1) and quantum chemistry, used to explain chemical structure, properties and reactivity. This thesis is divided into five parts. Chapter 1 starts with an outline of the early stages of drug discovery; introducing the use of virtual screening for hit and lead identification. Such approaches may roughly be divided into structure-based (docking, by far the most often referred to) and ligand-based, leading to a set of promising compounds for further evaluation. Then, the use of machine learning techniques, the issue of which will be frequently encountered, followed by a brief review of the "no free lunch" theorem, that describes how no learning algorithm can perform optimally on all problems. This implies that validation of predictive accuracy in multiple models is required for optimal model selection. As the dimensionality of the feature space increases, the issue referred to as "the curse of dimensionality" becomes a challenge. In closing, the last sections focus on supervised classification Random Forests. Computer-based analyses are an integral part of drug discovery. Chapter 2 begins with discussions of molecular docking; including strategies incorporating protein flexibility at global and local levels, then a specific focus on an automated docking program – AutoDock, which uses a Lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. In the second part of the chapter, a brief introduction of molecular dynamics will be given. Chapter 3 describes how we constructed a dataset of known binding sites with co-crystallised ligands, used to extract features characterising the structural and chemical properties of the binding pocket. A machine learning algorithm was adopted to create a three-way predictive model, capable of assigning each case to one of the classes (regular, orthosteric and allosteric) for in silico selection of allosteric sites, and by a feature selection algorithm (Gini) to rationalize the selection of important descriptors, most influential in classifying the binding pockets. In Chapter 4, we made use of structure-based virtual screening, and we focused on docking a fluorescent sensor to a non-canonical DNA quadruplex structure. The preferred binding poses, binding site, and the interactions are scored, followed by application of an ONIOM model to re-score the binding poses of some DNA-ligand complexes, focusing on only the best pose (with the lowest binding energy) from AutoDock. The use of a pre-generated conformational ensemble using MD to account for the receptors' flexibility followed by docking methods are termed “relaxed complex” schemes. Chapter 5 concerns the BLUF domain photocycle. We will be focused on conformational preference of some critical residues in the flavin binding site after a charge redistribution has been introduced. This work provides another activation model to address controversial features of the BLUF domain.

Die lichtaktivierte Kinase Phototropin aus Chlamydomonas reinhardtii, die photoaktivierte Adenylatcyclase (PAC) aus Euglena gracilis und das BLUF-Protein Slr1694 aus Synechocystis sp. PCC 6803 wurden in Hinblick auf die molekularen Details der primären photochemischen Prozesse sowie der Signalweiterleitung untersucht. Phototropin wurde mit Hilfe von Arginin aus Escherichia coli in Milligramm Mengen isoliert. Ohne Arginin wurde E. coli cAMP Rezeptorprotein assoziiert aufgefunden, welches eine hohe Homologie zu einer cAMP aktivierten Kinase aus C. reinhardtii besitzt. Volllängen Phototropin bildet wie einzelne LOV-Domänenkonstrukte ohne Kinasedomäne den Flavin-Triplettzustand und das kovalente Cysteinyl-Addukt. Der Zerfall des Signalzustandes ist in Anwesenheit von ATP beschleunigt und deutet auf Photorezeptor-Kinase Interaktion hin. Strukturelle Änderungen in der Kinasedomäne wurden durch FTIR-Differenzspektroskopie gezeigt. Über ELDOR-Spektroskopie wurde der Abstand der Photorezeptordomänen auf etwa 25 Angstrom bestimmt. Mutationen in Slr1694 an S28, N31 und W91 zeigten keine konservierten Einfluss auf die Dynamik des Signalzustands. Die Entfernung der Seitenkette von S28 führte zu einer 15 nm Rotverschiebung des Absorptionsspektrums aufgrund veränderter Wasserstoffbrückenkoordination des Kofaktors. Die Einführung von positiv geladenen Seitenketten an Stelle von N31 erhöhte die Kofaktorbindung von phosphorylierten Flavinen. Künstliche Kofaktoren wie Roseoflavin konnten in Slr1694 durch Koexpression eines prokaryotischen Flavintransporters erreicht werden. Die Rolle von M152 in PAC für die Signalweiterleitung wurde anhand der lichtaktivierten cAMP Synthese-Aktivität gezeigt. Durch ultraschnelle IR-Spektroskopie wurde die Beteiligung der Seitenketten von Y8 sowie Q50 bestätigt und eine genauere Beschreibung der Wasserstoffbrücken im langlebigen Signalzustand ermöglicht. / The light activated kinase Phototropin from Chlamydomonas reinhardtii, the photoactivated adenylylcyclase (PAC) from Euglena gracilis and the BLUF protein Slr1694 from Synechocystis sp. PCC 6803 were investigated concerning the molecular details of the primary photochemistry as well as signal transduction. Phototropin was isolated from Escherichia coli in mg amounts after solubilization with arginine. Without arginine E. coli cAMP receptor protein, which shows high homology to a cAMP activated kinase from C. reinhardtii, was copurified. Full length Phototropin shows similar photochemistry to LOV-domain containing proteins without the kinase including triplet and covalent cysteinyl adduct formation. Signaling state decay is accelerated in the presence of ATP and suggests photoreceptor-kinase interaction. FTIR spectroscopy showed light induced structural changes in the kinase domain. The distance of the photoreceptor domains of 25 Angstrom was determined by ELDOR spectroscopy. Mutation of the side chains of S28, N31 and W91 in Slr1694 showed no conserved influence on the dynamic of the signaling state. Removal of the hydroxyl group of S28 lead to a 15 nm red shift of the absorption spectrum as a result of altered hydrogen bond coordination of the cofactor. Introduction of positively charged side chains at the position of N31 strengthened the binding of phosphorylated flavins. An artificial flavin like roseoflavin was introduced in Slr1694 by coexpression of a bacterial flavin transporter. The essential role of M152 in PAC for signal transduction was shown by determination of light activated cAMP synthesis activity. Ultrafast IR spectroscopy confirmed the contribution of Y8 and Q50 in the photocycle and gave a more detailed description of the hydrogen bonding situation in the signaling state.