In photosynthetischen Organismen vermitteln Tetrapyrrole während der Chloroplastenbiogenese und als Antwort auf Veränderungen des Entwicklungszustandes sowie wechselnder Umweltbedingungen retrograde Signale zur Kontrolle der Expression von Kerngenen (NGE). In der vorliegenden Arbeit wurde ein induzierbares RNAi-System in Arabidopsis eingesetzt, um enzymatische Schritte des Mg-Zweigs der Tetrapyrrolbiosynthese (TPBS) zu inaktivieren. Es sollte gezeigt werden, inwiefern Tetrapyrrole zu einer kontinuierlichen Regulation der NGE beitragen, um abhängig von durch wechselnde Umweltbedingungen bedingte Veränderungen der TPBS, die Homöostase der Chloroplasten zu justieren. Die Untersuchungen zur Kurzzeitinduktion zeigten, dass veränderte Gehalte an Mg Protoporphyrin IX (MgP), Mg-Protoporphyrin IX-monomethylester (MgPME) und Protochlorophyllid (Pchlid) als Folge verminderter Enzymaktivitäten nicht primär zu einer Anpassung der NGE innerhalb der ersten 24 h führen. Vielmehr weisen die Ergenisse dieser Arbeit auf ein komplexes, vielschichtiges Signalnetzwerk aus retrograden und anterograden Signalwegen unter der Mitwirkung transkriptionellen und posttranslationalen Regulationsmechanismen hin. Es wird angenommen, dass Veränderungen der TPBS über ROS-Signalwege oder Redox-vermittelte Signale zur Regulation der NGE beitragen. Diese Signale könnten aus beeinträchtigten Photosystemen stammen, welche eine Folge der Akkumulation von photoreaktiven Intermediaten und unzureichenden Mengen an Chlorophyll sein können. / In photosynthetic organisms, tetrapyrroles are known to mediate retrograde control of nuclear gene expression (NGE) during chloroplast biogenesis in response to developmental and environmental changes. In these studies, an inducible RNAi system was used in Arabidopsis plants to inactivate enzymatic steps in the Mg-branch of tetrapyrrole biosynthesis (TPBS). It was intended to proof whether tetrapyrroles contribute to a permanent regulation of NGE due to changes in the TPBS and in response to environmental changes to achieve an adjustment of chloroplast homeostasis. The investigations of short-term responses due to altered levels of Mg protoporphyrin (MgP), Mg protoporphyrin monomethylester (MgPME) and protochlorophyllide (Pchlid) caused by a robust down-regulation of enzyme activity within the first 24 h reveal that these Mg porphyrins do not primarily contribute to the modulation of NGE. All results together indicate a complex multi-layered signaling network of anterograde and retrograde control and contributions of transcriptional as well as posttranslational regulation mechanisms. It is proposed that changes in the TPBS mediate the regulation of NGE via ROS-signaling pathways or redox signals deriving from disturbed photosystems due to accumulation of photoreactive intermediates and the lack of chlorophyll.

Das Anliegen dieser Arbeit besteht darin, die Kinetik von elektronischen Singulett- und Triplett-Anregungen innerhalb des solubilisierten Lichtsammelkomplexes des Photosystem II (LHCII) zu untersuchen. Die Untersuchungen gliedern sich in drei Teilkomplexe: Klärung der Frage, in welchem Maße die gegenseitige Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett-Zuständen (Singuletts)zu deren Vernichtung führt. Um dies zu analysieren, wurden Messungen zur nichtlinearen Fluoreszenz von LHCII in einem großen Bereich der Anregungsimpuls-Intensität durchgeführt. Dazu war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt, die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz räumlich zu selektieren. Die so gemessene Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII verringert sich um bis zu 4 Größenordnungen bei maximaler Intensität und entspricht einem sättigenden Verhalten der Fluoreszenz. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, daß der Transfer der Anregungsenergie innerhalb eines gesamten solubilisierten LHCII-Trimers extrem schnell vonstatten geht. Untersuchung zur Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung im LHCII. Dazu wurde ein Meßaufbau für Pump-Test-Messungen der nichtlinearen Transmission mit optischer Zeitverzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls realisiert. Besonderes Augenmerk wurde auf die Vermeidung von Meß-Artefakten gelegt. Die zeitliche Änderung der Absorption bei 507 nm spiegelt die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung in solubilisiertem LHCII wider. Bei der Modellierung der gemessenen Daten wurde die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl nach Car variiert. Die beste Anpassung ergibt den Grenzfall . Als untere Grenze kann im Rahmen der Meßgenauigkeit ein Wert von (0.5 ns)-1 angegeben werden. Dieser Wert ist mehr als eine Größenordnung größer, als der noch vor kurzer Zeit akzeptierte Wert von Kramer und Mathis (1980). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Chlorophyllen und Karotinoiden in LHCII wesentlich stärker ist, als bisher angenommen wurde. Untersuchung der Wechselwirkung von Singuletts mit langlebigen Tripletts anhand der Fluoreszenz, die durch einen elektronisch verzögerten Test-Laser-Impuls hervorgerufen wird. Diese "Test-Fluoreszenz" nimmt mit Erhöhung der Pump-Intensität drastisch ab und erreicht bei hohen Pump-Intensitäten wenige Prozent des Ausgangswertes. Das Zurückkehren zum Ausgangswert wurde als Funktion der Verzögerungszeit bei verschiedenen Pump-Intensitäten gemessen. Mit Hilfe der Stern-Volmer Gleichung lassen sich daraus die quenchenden Populationen berechnen. Dies ergibt, daß das Quenching bei vergleichsweise geringen Pump-Intensitäten eindeutig den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann. Bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten wurde eine zusätzliche, extrem stark quenchende Spezies identifiziert, bei der es sich möglicherweise um Chlorophyll-Tripletts oder -Ionen handelt. / In this study the kinetics of electronically excited singlet and triplet states within solubilized light harvesting complexes of photosystem II (LHCII) is investigated. It is subdivided into three parts: The mutual interaction between excited singlet states and their annihilation was analyzed. For that purpose nonlinear fluorescence measurements were performed in a huge range of excitation pulse intensity. A method was developed that allows a spatial selection of the fluorescence. The fluorescence yield determined in this way shows a drastic decrease of up to 4 orders of magnitude at the highest intensity used and corresponds to a saturation like behavior of the fluorescence. As a result of the theoretical investigation of this result, the excitation energy transfer within the overall LHCII-trimer is extremely fast. The kinetics of carotenoid triplet formation in LHCII was analyzed by pump-probe measurements of nonlinear transmission using an optically generated delay between pump- and probe-pulses. Special care was taken to prevent artifacts in this kind of measurement. The temporal change of the absorbance at 507 nm reflects the kinetic of carotenoid triplet formation in solubilized LHCII. The fit of the experimental data by a kinetic model provides that the rate for the triplet transfer from 3Chl to Car is (0.5 ns)-1. This value is more than one order of magnitude higher than the results obtained so far (Kramer and Mathis, 1980). This shows that the interaction between chlorophylls and carotenoids is much higher than previously assumed. The interaction between singlets and (long living) triplets was investigated by measurements of the fluorescence originating from a delayed probe pulse in the presence of a pump pulse. This "probe-fluorescence" decreases drastically with increasing pump pulse intensity up to a level of a few percent at the highest intensity. The recovery to the initial value (pump pulse off) was studied as a function of the electronically generated time delay and at different pump intensities. The population of quenching species was calculated by means of the Stern-Volmer Equation. As a result of this analysis the quenching at low pump intensities can clearly be attributed to carotenoid triplets. At high pump pulse intensities an extremely strong quenching species is formed which can be probably identified by chlorophyll-triplets or -ions.

In Pflanzen spielen Anpassungsprozesse als Reaktion auf die Umwelt eine zentrale Rolle, so z. B. auf der Ebene der Photosynthese und des Wachstums. Einer der wichtigsten Faktoren, die das Wachstumsverhalten beeinflussen, ist die Lichtverfügbarkeit und -verwertung. In vorliegender Arbeit galt es, die Auswirkung von Licht- und Chlorophyll (Chl)-Mangel auf verschiedene pflanzliche Prozesse zu untersuchen. Dabei standen folgende Fragen im Mittelpunkt: (1) Welche Konsequenzen haben ein reduziertes Anzuchtlichtangebot sowie eine limitierte Chl-Biosynthese für Photosynthese, Wachstum und Entwicklung von Tabakpflanzen? (2) Welche Bedeutung kommt dabei dem Energiestoffwechsel zu? (3) Welche regulativen Prozesse und Mechanismen spielen hierbei eine Rolle? Dazu wurden untransformierte Pflanzen von Tabak (Nicotiana tabacum L.) sowie 3 transgene Linien mit einem antisense-Konstrukt von Glutamat-1-Semialdehyd- Aminotransferase, einem Enzym der Chl-Biosynthese, entweder unter 300 oder 30 µmol Quanten m-2 s-1 photosynthetisch aktiver Strahlung angezogen. Es erfolgten Messungen zur morphometrischen Charakterisierung der Pflanzen, zur Lichtabsorption und zum CO2-/H2O-Gaswechsel der Blätter sowie Bestimmungen der Blattgehalte an Chl, Stärke, Zuckern, Kohlen- und Stickstoff sowie löslichem Protein, desweiteren der Mengen an Adenylaten und Pyridinnucleotiden sowie der NADP+-MDH-Aktivität. Ausserdem wurden licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen von Blättern und Chloroplasten durchgeführt. (1) Lichtmangel während der Anzucht sowie eine eingeschränkte Chl-Bildung hatten ein verringertes Absorptionsvermögen der Blätter zur Folge, was zur Reduzierung von Elektronentransport-, CO2-Aufnahme-, Photorespirations- und Dunkelatmungsraten führte. Dementsprechend zeigten diese Pflanzen eine verringerte Biomassebildung und -akkumulation und letztendlich eine Einschränkung von Wachstums- und Entwicklungsprozessen. (2) Die Ergebnisse zum Energie- und Reduktionsstatus zeigten, dass eine verminderte Bereitstellung von ATP und NADPH+H+ infolge des verringerten Absorptionsvermögens nicht vordergründig für die verringerten Stoffwechsel- und Wachstumsraten in den Licht- und Chl-Mangelpflanzen verantwortlich war. Vielmehr ergab sich dadurch langfristig via feedforward-Kontrolle eine down-Regulation von Energie-und Reduktionsequivalente-verbrauchenden Prozessen, um letztendlich ein energetisches Gleichgewicht zu sichern. (3) Eine ständige Anpassung an die vorherrschenden Anzuchtbedingungen und damit die langfristige Erhaltung der Homöostase ist grundlegende Überlebensstrategie der Pflanzen. Unter Bedingungen, die einen Energiemangel zur Folge haben - wie z. B. Licht- und Chl-Mangel -, treten regulative und kompensatorische Prozesse in Kraft, die die Wirkung des limitierenden Faktors auf die pflanzlichen Proz esse mit steigender Hierarchieebene abschwächen und somit der Optimierung des Energie- und Substratflusses in Richtung Wachstum, Entwicklung und Reproduktion dienen. Im Zusammenhang damit werden mögliche wirkende Kompensationsmechanismen diskutiert und unter anderem ein sogenanntes overflow-Modell vorgestellt. / In plants acclimation processes occur in response to changes of environmental factors e. g. at the level of photosynthesi s and growth. One of the most important factors affecting growth pattern of plants is the light availability and light utilization. The aim of the present work was to determine the effects of light and chlorophyll (chl) deficiency on several plant processes. The questions were: (1) What are the consequences of a reduced supply of growth light and a limited chl biosynthesis for photosynthesis, growth and development of tobacco plants? (2) What is thereby the significance of the energy and redox equivalents? (3) What kind of regulatory processes and mechanisms can be involved? Untransformed plants of tobacco (Nicotiana tabacum L.) and 3 transgenic lines with an antisense construct for glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, an enzyme of the chl biosynthesis pathway, were grown under 300 or 30 µmol quants m-2 s-1 of photosynthetic active radiation. The following methods were applied: morphometry, light microscopy of leaf section and electron microscopy of chloroplasts, measurements of CO2/H2O gas exchange and light absorption, determinations of leaf contents of chl, adenylates, pyridine nucleotides, carbon, nitrogen, sugars, starch, soluble proteins and of NADP+ malate dehydrogenase activity. (1) Light deficiency during the growth and also a limited formation of chl led to a decreased leaf absorptance and further to a reduction of the rates of electron transport, CO2 assimilation, photorespiration and mitochondrial dark respiration. In this context these plants showed a decreased starch content and biomass accumulation and a reduction of growth rates and final growth data. (2) A reduced supply of ATP and NADPH+H+ due to the decreased photon absorption was not only directly responsible for the reduced metabolic and growth rates obtained in the deficient plants. In addition it resulted via feedforward control in a longterm down regulation of pro cesses consuming energy and redox equivalents. This led to the maintenance of the balance of energy and reduction states. (3) The basic survival strategy of plants is a permanent acclimation to the present growth conditions by which the homoeostasis is maintained. Under stress conditions leading to an energy shortage - like light and chl deficiency - regulating and compensating processes occur. These are responsible for the finding that the impact of the reduced energy supply is less pronounced at the level of growth compared to the level of photosynthesis. In general, the extent to which the rates were reduced decreased with increasing level of hierarchy. This resulted in an optimal flow of energy and substrates in direction of growth, development and reproduction. In this context several compensating mechanisms are discussed, e. g. an overflow model is proposed.

Chlorophyll spielt eine unabdingbare Rolle für die lichtabhängige Reaktion der Photosynthese. Die adäquate Versorgung mit Chlorophyll wird dabei durch die Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) gewährleistet. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Proteinen identifiziert, welche an der Anpassung der TBS an wechselnde (a)biotische Wachstumsbedingungen der Pflanze beteiligt sind. Allerdings konnte bislang nicht zweifelsfrei geklärt werden, wie die TBS mit der Integration von Chlorophyllen in die Photosysteme koordiniert wird. Vor einigen Jahren wurde ein Interaktionspartner der Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) in Synechocystis identifiziert, welcher als potenzieller Faktor dieser Koordination in Frage kommt. Das POR-INTERACTING TPR-Protein (Pitt) stabilisiert POR an der Thylakoidmembran und interagiert auch mit dem Vorstufenprotein des D1. Pitt gehört zur Familie der tetratricopeptide repeat (TPR) Proteine, deren Vertreter vorrangig für die Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen zuständig sind. Aus diesem Grund war, neben der Identifikation des potenziellen Pitt-Homologs im Modelorganismus Arabidopsis thaliana, die Analyse von anderen Vertretern dieser Proteinklasse ein vielversprechender Ansatz bei der Identifikation von weiteren Regulatoren der TBS oder Photosynthese. Von den fünf ausgewählten TPR-Proteinen aus Arabidopsis thaliana mit einer hohen Sequenzähnlichkeit zu Pitt waren vier in der Lage, physisch mit POR zu interagieren. Von diesen vier Kandidaten ist das durch das Gen At1g78915 kodierte, membranintegrale TPR-Protein (TPR1) der beste Kandidat des putativen Pitt-Homologs in Arabidopsis. Vergleichbar zu Pitt interagiert TPR1 mit POR und stabilisiert das Enzym an den plastidären Membranen. Die Stabilisierung von POR durch TPR1 spielt eine entscheidende Rolle während der Etiolierung und Ergrünung von Keimlingen. Darüber hinaus steht TPR1 im Zusammenhang mit der schnellen Inaktivierung der 5-Aminolävulinsäuresynthese. / Chlorophyll plays an indispensable role in the light reaction of the photosynthesis. The adequate supply of chlorophyll is ensured by tetrapyrrole biosynthesis (TBS). Within the last decades, multiple proteins were identified, which are involved in adjusting the TBS-pathway to changing (a)biotic plant growth conditions. Nevertheless, it is not fully understood how the TBS-pathway is coordinated parallel to the assembly of the photosystems and the integration of chlorophylls into the pigment-binding subunits of the photosystems. Several years ago, an interaction partner of the protochlorophyllide-oxidoreductase (POR) was identified in Synechocystis which was proposed to be involved in the coordination of these mechanisms. The POR-INTERACTING TPR-Protein (Pitt) binds and stabilizes POR at the thylakoid membranes and interacts with the precursor protein of D1. Therefore, Pitt could facilitate the incorporation of chlorophylls into the plastid-encoded nascent photosynthetic subunits. Pitt belongs to the tetratricopeptide repeat (TPR) protein family, whose members mediate protein-protein-interactions. Besides the identification of the potential Pitt-homolog in the model organism Arabidopsis thaliana, analysis of additional members of the TPR-protein superfamily was a promising approach for the identification of further posttranslational regulators of TBS and photosynthesis. Five Arabidopsis thaliana TPR-proteins with a high sequence similarity to Pitt were selected. Four of those proteins are able to interact physically with POR. Among them, the TPR-protein encoded by the gene At1g78915 (TPR1) was the best candidate to represent a putative Pitt homolog in Arabidopsis. Similar to Pitt, TPR1 is a plastid-localized integral membrane protein, which interacts with POR at the thylakoid membranes. The stabilizing effect of TPR1 on POR is especially needed during etioliation and greening. Additionally, TPR1 is required for a inactivation of the 5'-aminolevulinic acid synthesis.

Bei der lichtinduzierten Oxidation von Wasser im Photosystem II (PSII) werden zwei wassermoleküle im katalytischen Zyklus des Metallclusters (Mn4CaO5) benötigt, und vier Protonen aus dem Cluster in den Lumen abgegeben. Daher ist es für das Verständnis des Mechanismus´ der Wasseroxidation von entscheidender Bedeutung, die Veränderung der Protonierungszustände am cluster während der Katalyse zu untersuchen. Hierbei sollten sowohl die Wasserkanäle für die Zuführung der Substratwassermoleküle als auch die Transportwege für die Freisetzung der Protonen untersucht werden. Deshalb wurde in meiner ersten Veröffentlichung ein neues Protokoll entwickelt, um einzelne große Kristalle von dPSII mit einer Länge von ~3 mm in der Längsachse zu züchten. Diese Kristalle mit einer Auflösung von ca. 8 Å gemessen. Um eine höhere Auflösung zu erzielen, ist die Verbesserung der Kristallqualität essenziell. Daher wurde in meiner zweiten Veröffentlichung die Struktur des Detergens-Protein-Komplexes von dPSII mit βDM, durch Anwendung von SANS in Kombination mit SAXS untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass βDM eine monomolekulare Schicht um dPSII bildet. Darüber hinaus konnten freie Mizellen von βDM in der Lösung nachgewiesen werden. Damit ist eine weitere Optimierung der βDM-Konzentration in der Proteinlösung erforderlich, um die Bildung von freien Mizellen zu minimieren. In meiner dritten Veröffentlichung wurde die strukturelle Dynamik in den Wasserkanälen, während des S2-S3 Übergangs mit Hilfe der XFEL untersucht. Ein Datensatz mit einer hohen Auflösung von 1,89 Å wurde durch die Zusammenführung von Daten gewonnen, die während des S2-S3 Übergangs gesammelt wurden. In Anbetracht der Analyse der zusammengeführten Daten und der einzelnen Zeitpunkte, die während des S2-S3 Übergangs gesammelt wurden, ist es wahrscheinlich, dass ein Substratwasser durch den O1-Kanal geliefert wird. Im Gegensatz dazu wird ein Proton aus dem Cluster durch den Cl1 Transportweg in Richtung Lumen freigesetzt. / The light-induced oxidation of water in Photosystem II (PSII) requires incorporating two water molecules in the catalytic cycle of the active metal cluster (Mn4CaO5). Furthermore, four protons are released towards the bulk from the cluster. Therefore, tracking the change of protonation states at the active catalytic site and the surrounding protein side chains during catalysis and elucidating the pathways of water substrate insertion and proton release are crucial to understanding the water oxidation mechanism. Therefore, in the first study of my work, a new protocol was developed to grow single large dPSIIcc crystals with a length of ~3 mm in the long axis. These crystals, soaked in D2O containing buffer, diffracted to about 8 Å resolution. Improving the crystal quality is crucial for achieving a better resolution. Consequently, in the second study of my work, the structure of the detergent-protein complex of βDM-dPSIIcc has been investigated by applying SANS in combination with SAXS. The results showed that βDM is forming a monomolecular layer around the dimeric PSII core complex (dPSIIcc). Moreover, the SAXS data detected a peak assigned to the free micelles of βDM. These results raise the necessity to optimize the βDM concentration in the protein solution to avoid the possible excess of free micelles. In the third study of my work, the structural dynamics in the water channels connecting the cluster to the lumen during the S2  S3 transition were investigated using serial femtosecond XFEL. A high-resolution data set was obtained at a resolution of 1.89 Å by combining data collected at RT. Considering the analysis of the combined data and the individual time points collected during the S2  S3 transition, it is likely that the substrate water insertion into the open coordination site of the Mn1 ion is delivered through the O1 channel. In contrast, a proton from the cluster is released towards the bulk through the Cl1 A channel.

Die Endprodukte der Tetrapyrrolbiosynthese sind essentiell für die Schwefel- und Stickstoffassimilation (Sirohäm), der von Photorezeptoren abhängigen Genexpression (Phytochromobilin), Elektronenübertragungsreaktionen (Häm) und der Photosynthese (Chlorophyll). Die Synthese von Chlorophyllen wird durch eine Mg-Chelatase (MgCh) eingeleitet, die durch das GENOMES UNCOUPLED 4 (GUN4) Protein stimuliert wird. GUN4 ist essentiell für die Aktivierung der MgCh und die Synthese von Chlorophyllen. Das GUN4 aus Arabidopsis thaliana wird ausschließlich an der vorletzten Aminosäure (S264) des C-Terminus phosphoryliert. Die in vitro und in vivo MgCh-Aktivität wird hingegen durch phosphoryliertes GUN4 nicht mehr stimuliert. De-phosphoryliertes GUN4 bewirkt die lichtabhängige Aktivierung der MgCh im Übergang von der Nacht zum Tag in Angiospermen. Im Laufe der Evolution photosynthetisch aktiver Organismen hat sich die in den Angiospermen hochkonservierte Phosphorylierungsstelle entwickelt. GUN4-Homologe aus Synechocystis oder Chlamydomonas werden nicht phosphoryliert. Im Rahmen der Suche nach der GUN4-spezifischen Proteinkinase wurden vier in den Plastiden lokalisierte PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION identifiziert. In dieser Arbeit wurden zusätzlich Experimente zum durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Signalweg durchgeführt. gun Mutanten sind durch eine defizitäre cytosolische Anthocyan-/Flavonoidbiosynthese charakterisiert. Auf der Suche nach Hinweisen für einen Zusammenhang zwischen Anthocyanen und der De-repression von PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES wurde eine neue gun Mutante identifiziert. Der knockout der durch TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) kodierten CHALCON SYNTHASE führte zu einer mit den gun Mutanten vergleichbaren De-repression der PHANGs nach Norflurazon-Behandlung. Pharmakologische Experimente belegen eine mögliche Funktion der Phenylpropanoidbiosynthese in der durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Kommunikation. / Endproducts of the tetrapyrrole biosynthesis pathway are essential for the assimilation of sulfur and nitrogen (siroheme), photoreceptor mediated control of nuclear gene expression (phytochromobilin), electron transfer reactions (heme) and photosynthesis (chlorophyll). The synthesis of chlorophyll is initiated by a Mg-chelatase (MgCh) which is stimulated by the GUN4 protein. GUN4 is essential for the activation of MgCh and synthesis of chlorophyll. GUN4 from Arabidopsis thaliana is exclusively phosphorylated at the next-to-last amino acid of the C-terminus (S264). The stimulatory impact towards MgCh is reduced upon GUN4 phosphorylation. De-phosphorylated GUN4 stimulates MgCh activity during the transition from night to daytime. The phosphorylation site of GUN4 has evolved in the clade of angiosperms. GUN4 homologs of Synechocystis or Chlamydomonas are not phosphorylated. In an attempt to isolate the GUN4-kinase four formerly unknown PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION were identified. In addition to the elucidation of the post-translational GUN4 modifications, experiments concerning the GUN-dependent retrograde signaling pathway were performed. Under conditions which lead to a block of chloroplast development the de-repression of PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES is paralleled by a reduced accumulation of anthocyanins in the gun mutants. When searching for a correlation between anthocyanin biosynthesis and expression of PHANGs a new gun mutant was identified. The knockout of CHALCONE SYNTHASE encoded by TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) leads to a comparable de-repression of PHANGs after norflurazon treatment as it was observed for the gun mutants. Pharmacological modification of phenylpropanoid biosynthesis revealed that an intermediate of the pathway is a component of chloroplast-to-nucleus communication. Hence, first evidences for a function of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in mediating the GUN-dependent retrograde signal were obtained.

Ultraschnelle Energietransferprozesse zwischen den Anregungszuständen organischer Pigmentmoleküle in photosynthetischen Lichtsammelkomplexen gehören zu den schnellsten bisher untersuchten biologischen Ereignissen. Diese Vorgänge wurden insbesondere auch für den Haupt-Antennenkomplex der höheren Pflanzen (LHCII) beobachtet, der mehr als die Hälfte des pflanzlichen Chlorophylls (Chl) bindet (5 Chl b und 7 Chl a pro Monomer). Offenbar ist dieser Pigment-Protein-Komplex entscheidend für Regulationsmechanismen verantwortlich, die eine schnelle Adaptation des Photosyntheseapparats an wechselnde Licht- bedingungen ermöglichen. Die Struktur von LHCII ist mit einer Auflösung von 3.4 Å bekannt und erlaubt (im Prinzip) die Berechnung des Anregungsenergietransfers auf Basis eines Förster-Mechanismus. In diesem Zusammenhang gibt es jedoch noch zahlreiche ungeklärte Fragen, die vor allem die Orientierung der Pigmente zueinander sowie deren mögliche starke (exzitonische) Wechselwirkung betreffen. Allerdings sind konventionelle spektroskopische Methoden nicht geeignet, diese Merkmale ausreichend aufzuklären. Aus diesem Grund wird in dieser Arbeit untersucht, inwieweit neuere laserspektroskopische Methoden wie die nichtlineare Polarisationsspektroskopie in der Frequenzdomäne (NLPF) zur Ermittlung unbekannter Parameter beitragen können. Anfänglich ergaben sich besonders Fragen der Anwendbarkeit der NLPF auf solche hoch- komplexen Untersuchungsobjekte sowie der Signifikanz eventuell erzielbarer Ergebnisse. Aufbauend auf einer parallel verfaßten Dissertation zu theoretischen Aspekten der NLPF- Methode [1] wurde daher ein vereinfachtes System modelliert, das die Heterogenität der individuellen Chl(e) im LHCII widerspiegelt. Die gewonnenen Resultate ließen vermuten, daß die reine Simulation von NLPF-Spektren nicht ausreicht, um eindeutige Aussagen über die Molekülparameter zu gewinnen. Um den benötigten zusätzlichen Erkenntnisgewinn zu erreichen, wurden daher Paralleluntersuchungen mit anderen laserspektroskopischen Methoden (nichtlineare Absorption mit fs-Pulsen, intensitätsabhängige NLPF, Einzelmolekülspektroskopie, Tieftemperatur-NLPF) sowie mit in vitro rekonstituierten Protein-Mutanten durchgeführt. Als Ergebnis konnte die Subbstruktur der Qy- Absorptionsbande der ersten angeregten Zustände der Chl(e) für LHCII ausreichend beschrieben werden. Darüber hinaus ergaben sich Aussagen zu exzitonischen Wechselwirkungen zwischen bestimmten Chl(en), die unter anderem Einfluß auf das Energie- transferverhalten haben. Diese zusätzlichen Untersuchungen erlaubten letztendlich eine Modellierung der bei Raum- temperatur an LHCII gemessenen NLPF-Spektren. Neben dem dabei implizit gewonnenen Verständnis der nichtlinearen optischen Eigenschaften im Bereich der Qy-Absorption ließen sich so Aussagen über bestimmte Modellparameter, besonders über die Orientierung von Übergangsdipolmomenten, ableiten. Abschließend wurde die Auswirkung der Erkenntnisse auf das Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen für intra- und inter-komplexen Energietransfer erläutert. / Ultra-fast excitation energy transfer (EET) between excited states of organic pigment molecules in photosynthetic antenna complexes belongs to the fastest observed biological processes. Such EET phenomena has been studied to a large extent for the main light- harvesting complex of the higher plants (LHCII), which appears to play an exceptional role for the regulatory function (i.e. light adaptation) of the plant photosynthetic apparatus. The structure of this pigment-protein complex harboring more than 50 % of the total chlorophyll (Chl) content is known with 3.4 Å resolution and reveals the binding sites of 5 Chl b and 7 Chl a per monomeric unit. Based on this structure analysis, EET calculations are (in principle) available on the molecular level under the assumption of Förster-type transfer. However, several molecular features like mutual pigment orientations and electronic interactions between their transition dipoles are still rather uncertain. Since conventional spectroscopic techniques can hardly reveal the corresponding parameters, this work was aimed at the evaluation of newly introduced laser spectroscopic techniques with respect to these questions. In the beginning, suitability and significance of the method when applied to highly complicated structures like pigment-protein complexes were studied by modeling heterogeneous, LHCII-like absorption systems in NLPF experiments. Based on recent improvements in the NLPF theory by a parallel theoretical investigation [1], these simulations clarified the sensitivity of the NLPF method on numerous physical parameters. As a major consequence, unambiguous evaluations of NLPF measurements appear to require substantial additional information about the investigated system. Accordingly, several supplementary methods like nonlinear absorption (using fs-pulses), intensity-dependent NLPF, single- molecule spectroscopy, and NLPF at low temperatures were employed. These investigations revealed unique information about excitonic interaction between certain Chl(s), including implications for the overall EET scheme. The sub-structure model for the Qy-absorption region of LHCII was further essentially improved by the analysis of reconstituted proteins with selectively modified Chl binding residues in the amino-acid sequence. The sum of all complementary investigations allowed finally the evaluation of room temperature NLPF measurements of trimeric LHCII. Due to the unique selectivity of the spectra to individual transition-dipole directions, several orientation parameters have been obtained. Under this point of view, the NLPF method has indeed revealed a high potential as compared to conventional techniques like circular dichroism spectroscopy. Moreover, the understanding of nonlinear phenomena in the Qy-absorption region of LHCII as a consequence of molecular interaction provides further knowledge for the application of other nonlinear optical experiments. Concluding, implications of the obtained results for the structure-function relationship of intra- and inter-complex EET were elucidated.

Fluorescence in blue light (FLU) ist ein negativer Feedbackregulator der Chlorophyllbiosynthese, welcher an der Dunkelrepression der 5-Aminolävulinsäure (ALA)-Synthese beteiligt ist. FLU ist Teil eines Komplexes, der die Enzyme umfasst, welche an der Katalyse der finalen Schritte der Chlorophyllbiosynthese beteiligt sind. Drei funktionelle Domänen wurden für das Arabidopsis FLU Protein postuliert: eine Tetratricopeptid-Wiederholungsdomäne (TPR) befindet sich am C-Terminus; eine Transmembrandomäne (TM) ist am N-Terminus lokalisiert; eine Coiled-coil-Domäne (linker) liegt dazwischen. Die TPR-Domäne von FLU Domäne interagiert mit dem C-terminalen Ende der Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der ALA-Synthese. Diese Arbeit zur Erweiterung des Wissen über die Funktion von FLU im Licht sowie über die Rolle der funktionellen Domänen von FLU bei der Inaktivierung der ALA-Synthese bei. / Fluorescence in blue light (FLU), a negative feedback regulator of chlorophyll biosynthesis, is involved in dark repression of 5-aminolevulinic acid (ALA) synthesis. FLU is part of a complex comprising the enzymes catalyzing the final steps of chlorophyll synthesis. Three functional domains were proposed in the Arabidopsis FLU protein: a tetratricopeptide repeat (TPR) domain is at the C-terminus; a transmembrane domain (TM) is at the N-terminus; a coiled-coil domain (linker) is in between. The TPR(FLU) domain interacts with the C-terminal end of glutamyl-tRNA reductase (GluTR), the rate-limiting enzyme of ALA synthesis. This thesis contributes to the extended knowledge about the function of FLU in light as well as the role of the structural domains of FLU in the inactivation of ALA synthesis.

Photosystem I (PSI) aus dem thermophilen Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus ist ein transmembraner Protein-Pigment-Superkomplex der photosynthetischen Elektronentransportkette. Er wandelt die Energie des Lichts in elektrische Energie mit einer Quanteneffizienz von nahezu 100 % um. Dazu uberträgt PSI Elektronen von Plastocyanin bzw. Cytochrom c6 (Cyt c6) auf Ferredoxin. Die Struktur des PSI wurde bereits 2001 mit einer Auflösung von 2,5 Å beschrieben (Jordan et al. 2001). Es lässt sich zur Generierung von Photoströmen auf Elektrodenoberflächen assemblieren und zur Produktion von Biokraftstoffen mit Enzymen koppeln. Die elektrische Kontaktierung des PSI mit Elektrodenoberflächen kann durch Komplexierung mit dem mitochondrialem Cytochrom c aus Pferdeherz (Cyt cHH) erhöht werden. Aufgrund der Nutzbarkeit dieses Proteinkomplexes sollte geklärt werden, wie PSI und Cyt cHH wechselwirken und wie sich die Interaktion von der des nativen PSI-Cyt c6-Komplexes unterscheidet. Deshalb lag der Fokus meiner Arbeit darauf, die Bindung des Cyt c6 und seines Analogons Cyt cHH an PSI mit kinetischen, kalorimetrischen, theoretischen und strukturellen Methoden zu untersuchen. Das Cyt c6 bindet im reduzierten Zustand an PSI und verringert nach erfolgtem Elektronentransfer seine Affinität. Das Cyt cHH bindet dagegen sowohl im reduzierten als auch im oxidierten Zustand an PSI. Mit Hilfe der kinetischen Messungen habe ich Bedingungen identifiziert, unter denen PSI mit dem jeweiligen Cytochrom c einen stabilen Komplex eingeht. Mit Hilfe eines rigid-body dockings wurden potenzielle Bindungsstellen der beiden Cytochrome berechnet. Fur Cyt c6 ergab sich eine spezifische Bindungsstelle, die eine gute Übereinstimmung mit den von mir gemessenen Kinetiken sowie mit weiteren Literaturdaten zeigt. Diese Bindungsstelle korreliert mit der veröffentlichten Kostruktur des bakteriellen Reaktionszentrums mit Cyt c2 aus Rhodobacter sphaeroides. Demgegenüber sind mehrere Cyt cHH-Bindungsstellen ... / Photosystem I (PSI) from the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus is a membrane-bound, multipigment protein supercomplex. It converts light to electrochemical energy with a quantum efficiency of almost 100 %. It reduces the luminal proteins plastocyanin and cytochrome c6 (Cyt c6) to oxidize the stromal protein Ferredoxin. The structure of PSI has been solved in 2001 at a resolution of 2,5 Å (Jordan et al. 2001). PSI can be assembled on an electrode surface to produce photocurrents and the generated electrons can be used for the production of biofuels. The mitochondrial cytochrome c from horse heart (Cyt cHH) binds strongly to both, PSI and the electrode surface, and can therefore be applied to improve the electrical coupling. Due to the practical use of the PSI-Cyt c complex, the aim of my thesis is to characterize the interaction of PSI with Cyt c6 and the analog Cyt cHH. To this end, the binding of both cytochromes to PSI was analyzed by kinetic, calorimetric, theory-based and structural methods. Cyt c6 binds to PSI while being reduced and decreases its affinity after transferring its electron. In contrast, Cyt cHH binds to PSI in both oxidation states, reduced and oxidized, with identical affinity. By means of kinetic measurements, I identified conditions in which PSI forms a stable complex with either of the two cytochromes. The positions of the cytochrome binding sites at PSI were calculated by a rigid-body docking. For the calculation with Cyt c6, the majority of the potential binding sites are located at the luminal side of PSI, close to P700. The theoretic properties of one of these binding sites are in good agreement with my own kinetic measurements and literature data. The position and orientation of Cyt c6 in this theoretic binding site is almost identical to the localization of Cyt c2 in cocrystals with the bacterial reaction center from Rhodobacter sphaeroides. The potential Cyt cHH binding sites are uniformly distributed over ...

Die pflanzliche Light-harvesting complex-Proteinfamilie besteht aus Proteinen mit vielfältigen Funktionen. Dabei ist die Funktion der Light-harvesting-like 3-Proteine (LIL3) sowie der One-helix-Proteine (OHPs) weitestgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass LIL3 nicht nur mit der Geranylgeranyl-Reduktase (CHLP), sondern auch mit der Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) interagiert. Sowohl CHLP als auch POR werden über die Interaktion zu LIL3 an die Thylakoidmembran gebunden und dadurch stabilisiert. Beide Enzyme liefern die direkten Vorstufen für den von der Chlorophyll-Synthase (CHLG) katalysierten finalen Chlorophyll-Syntheseschritt. Neben der Bestätigung der bereits früher gezeigten Chlorophyllbindung von LIL3 konnte eine Affinität zu den späten Intermediaten der Chlorophyllbiosynthese Proto IX, MgP, MgPMME und Pchlid nachgewiesen werden. Die größte Affinität bestand dabei gegenüber dem Substrat von POR, Pchlid. Basierend auf diesen Erkenntnissen wird LIL3 als Regulator der späten Chlorophyllbiosynthese-Schritte vorgeschlagen: LIL3 transportiert Substrate zwischen den Enzymen und ermöglicht durch die Bindung von CHLP und POR die Synthese der Chlorophyll-Edukte in räumlicher Nähe. Dadurch wird die Versorgung von CHLG mit dessen Edukten favorisiert. Beide OHP-Varianten (OHP1/2) bilden ausschließlich Heterodimere und binden Chlorophyll sowie Carotinoide im Verhältnis 3:1. Die Pigmentbindung basiert auf den konservierten Aminosäuren im Chlorophyllbindemotiv. An das OHP1-OHP2-Dimer bindet der PSII-Assemblierungsfaktor HCF244 und wird dadurch an der Membran verankert. HCF244 stabilisiert das OHP-Heterodimer und beide OHPs stabilisieren sich gegenseitig. Der heterotrimere OHP1-OHP2-HCF244-Komplex ist für die D1-Synthese wesentlich. Es wird vermutet, dass die OHPs an der co-translationalen Beladung von (p)D1 mit Pigmenten beteiligt sind sowie frühe Assemblierungsintermediate von PSII vor überschüssiger Anregungsenergie schützen. / The plant light-harvesting complex protein family comprises different members with a variety of functions. However, the function of the light-harvesting-like 3 proteins (LIL3) as well as the one-helix proteins (OHPs) is largely unknown. In this thesis, an interaction of LIL3 not only with geranylgeranyl-reductase (CHLP), but also with protochlorophyllide-oxidoreductase (POR) could be established. LIL3 tethers CHLP and POR to the thylakoid membrane, thereby conferring stability to both enzymes. Both CHLP and POR are synthesizing the direct chlorophyll precursors which are combined to chlorophyll by the subsequent chlorophyll synthase (CHLG). In addition to the chlorophyll binding ability of LIL3 reported earlier, an affinity of LIL3 towards the chlorophyll biosynthesis intermediates Proto IX, MgP, MgPMME, and Pchlide could be shown. Interestingly, the highest affinity of LIL3 was exerted towards Pchlide which is the substrate of POR. Therefore, LIL3 is postulated to shuffle the intermediates between enzymes and brings CHLP and POR in close proximity, which may help to supply CHLG with its substrates. Regarding the function of the OHPs an exclusive heterodimer formation of both the OHP1 and OHP2 variants could be shown. The OHP1-OHP2-heterodimer is able to bind chlorophyll and carotenoids in an approximate 3:1 ratio and pigment binding depends on dimer formation as well as the presence of the conserved amino acids in the chlorophyll binding motif. The PSII-assembly factor HCF244 is anchored to the thylakoid membrane by binding to both OHPs, thereby stabilizing the OHP-heterodimer. The heterotrimeric OHP1-OHP2-HCF244-complex is essential for D1 biosynthesis, although the exact molecular function of HCF244 is still unknown. It is suggested that the OHP-dimer is responsible for co-translational loading of (p)D1 with pigments as well as photoprotection of early PSII assembly intermediates.