In photosynthetischen Organismen vermitteln Tetrapyrrole während der Chloroplastenbiogenese und als Antwort auf Veränderungen des Entwicklungszustandes sowie wechselnder Umweltbedingungen retrograde Signale zur Kontrolle der Expression von Kerngenen (NGE). In der vorliegenden Arbeit wurde ein induzierbares RNAi-System in Arabidopsis eingesetzt, um enzymatische Schritte des Mg-Zweigs der Tetrapyrrolbiosynthese (TPBS) zu inaktivieren. Es sollte gezeigt werden, inwiefern Tetrapyrrole zu einer kontinuierlichen Regulation der NGE beitragen, um abhängig von durch wechselnde Umweltbedingungen bedingte Veränderungen der TPBS, die Homöostase der Chloroplasten zu justieren. Die Untersuchungen zur Kurzzeitinduktion zeigten, dass veränderte Gehalte an Mg Protoporphyrin IX (MgP), Mg-Protoporphyrin IX-monomethylester (MgPME) und Protochlorophyllid (Pchlid) als Folge verminderter Enzymaktivitäten nicht primär zu einer Anpassung der NGE innerhalb der ersten 24 h führen. Vielmehr weisen die Ergenisse dieser Arbeit auf ein komplexes, vielschichtiges Signalnetzwerk aus retrograden und anterograden Signalwegen unter der Mitwirkung transkriptionellen und posttranslationalen Regulationsmechanismen hin. Es wird angenommen, dass Veränderungen der TPBS über ROS-Signalwege oder Redox-vermittelte Signale zur Regulation der NGE beitragen. Diese Signale könnten aus beeinträchtigten Photosystemen stammen, welche eine Folge der Akkumulation von photoreaktiven Intermediaten und unzureichenden Mengen an Chlorophyll sein können. / In photosynthetic organisms, tetrapyrroles are known to mediate retrograde control of nuclear gene expression (NGE) during chloroplast biogenesis in response to developmental and environmental changes. In these studies, an inducible RNAi system was used in Arabidopsis plants to inactivate enzymatic steps in the Mg-branch of tetrapyrrole biosynthesis (TPBS). It was intended to proof whether tetrapyrroles contribute to a permanent regulation of NGE due to changes in the TPBS and in response to environmental changes to achieve an adjustment of chloroplast homeostasis. The investigations of short-term responses due to altered levels of Mg protoporphyrin (MgP), Mg protoporphyrin monomethylester (MgPME) and protochlorophyllide (Pchlid) caused by a robust down-regulation of enzyme activity within the first 24 h reveal that these Mg porphyrins do not primarily contribute to the modulation of NGE. All results together indicate a complex multi-layered signaling network of anterograde and retrograde control and contributions of transcriptional as well as posttranslational regulation mechanisms. It is proposed that changes in the TPBS mediate the regulation of NGE via ROS-signaling pathways or redox signals deriving from disturbed photosystems due to accumulation of photoreactive intermediates and the lack of chlorophyll.

Die vorliegende Studie präsentiert eine Analyse der Integration der AhR und Wnt/beta-catenin Signalwege in den CYP1A1 Promotor sowie den regulatorischen Einfluss der Promotorlogik auf die Genexpression. Experimentell wurde diese Analyse mithilfe 29 mutagener Reporterkonstrukte des humanen CYP1A1 Promotors durchgeführt. Ein mathematisches Modell, welches eine Repräsentation des Crosstalks der Signaltransduktionswege mit einer statistisch mechanischen Beschreibung der kombinatorischen Promotorbelegung kombiniert, komplementierte den experimentellen Ansatz. Unter zusätzlicher Zuhilfenahme von gut kontrollierbaren synthetischen Promotorkonstrukten fand ich heraus, dass nur jenes Dioxin-responsive Element das sich am nächsten am Transkriptionsstartpunkt befindet, die Promotorbelegung an die RNA Polymerase kommuniziert. Außerdem beobachtete ich, dass Transkriptionsfaktoren alleine mit Transkriptionsfaktoren interagieren die mit benachbarten Bindestellen assoziieren, d.h. Interaktionen überbrücken keine größeren Entfernungen. Der Modellierungsansatz ermöglichte zudem die erfolgreiche Vorhersage einer UND-Gatter-ähnlichen Integration der beiden Signalwege in den Promotor. Für die genomische Architektur des CYP1A1 Promotors konnte ich die Signifikanz der Zielbindestelle des Wnt/beta-catenin Signalwegs innerhalb des cis-regulatorischen Region demonstrieren. Mithilfe des Modells fand ich heraus, dass diese Bindestelle am stärksten und vielfältigsten mit den restlichen Transkriptionsfaktoren interagiert. Zusätzliche konnte, im Vergleich zu dem alles-oder-nichts UND-Gatter der synthetischen Konstrukte, eine sehr viel graduellere Antwort auf die Integration der beiden Signalwege aufgezeigt werden. Abschließend wurde das physiologisch zu beobachtende Expressionsmuster von dem Modell vorhergesagt und experimentell validiert. / The study at hand presents an analysis of the integration of the AhR and the Wnt/beta-catenin signaling pathways into the CYP1A1 promoter as well as the regulatory influence of the promoter logic on gene expression. Experimentally, this analysis was conducted with the help of 29 mutant constructs of the human CYP1A1 promoter. I complemented this experimental approach with a set of mathematical models that combined a representation of the signaling crosstalk with a statistical mechanics description of the combinatorial promoter occupancy. With the help of well controllable synthetic promoter constructs I found that only the dioxin responsive element closest to the transcription start site communicates the promoter occupancy to the RNA polymerase. Furthermore, transcription factors only interact with transcription factors that associate with nearby binding sites, i.e., no long-distance binding was observed. The modeling approach subsequently enabled the successful prediction of an AND-gate-like integration of the two signaling pathways into the promoter. For the genomic architecture of the CYP1A1 promoter, I could demonstrate the importance of the Wnt/beta-catenin pathway target binding site within the cis-regulatory region. The model uncovered that this binding site is the strongest and most promiscuous interaction partner of the remaining transcription factors. In addition, a less switch-like response to the integration of the two signaling pathways as compared to the all-or-none AND-gate within the synthetic constructs could be demonstrated. And lastly, the physiological expression pattern in liver lobules could be successfully predicted by the model and experimentally verified.

Die für Pflanzen lebenswichtige Synthese von Tetrapyrrolen bedarf einer fein justierten Anpassung an die Umweltbedingungen und erfolgt auf transkriptioneller und post-translationaler Ebene. In den Chloroplasten hat sich die Regulation von Enzymen über ihren Redox-Status als probates Mittel zur Koordination der photosynthetischen Energiegewinnung und des Metabolismus erwiesen. Die bei der Photosynthese generierten Reduktionsäquivalente werden zum Teil über die Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase auf eine Vielzahl plastidärer Thioredoxine (TRX) übertragen, welche Disulfidbrücken ihrer Zielproteine reduzieren können. Unter den Enzymen der Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) wurden bisher mehrere TRX-Interaktionspartner identifiziert, darunter die Glutamyl-tRNA-Reduktase (GluTR) und die 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase (ALAD). In Arabidopsis Mutanten, in denen die NADPH-abhängige Thioredoxin-Reduktase (NTRC) oder f- und m-Typ-TRX fehlen, konnten verringerte Chlorophyll- und Hämgehalte beobachtet werden. Diese ließen sich auf die verringerte Stabilität verschiedener TBS-Enzyme in den Mutanten zurückführen, darunter auch die GluTR und ALAD. Die Relevanz der Cysteine (Cys, C) für die Regulation der GluTR1-Stabilität wurde in vivo über transgene Arabidopsis Cys➔Serin (Ser, S)-Substitutionslinien untersucht. Dabei erwies sich GluTR1(C464S) stärker vor dem Abbau über die kaseinolytische Protease (Clp) geschützt als das WT-Protein. Eine intermolekulare Disulfidbrücke zwischen den beiden Cys464-Resten des GluTR1-Homodimers wird daher als Abbausignal postuliert. Mit Hilfe der rekombinanten ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Stabilität, sondern auch die Aktivität der ALAD1 in vitro vom Redox-Status des Enzyms abhängig ist. Die ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnten über Enzymaktivitäts- und gel shift-Assays unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen zur Identifizierung der redox-sensitiven Cys beitragen. / The synthesis of tetrapyrroles, such as chlorophyll, is vital for plants and requires a finetuned regulation. The control mechanisms involved in tetrapyrrole biosynthesis (TBS) take place both on transcriptional and post-translational levels. A broadly spread post-translational regulatory mechanism in the chloroplast involves the reduction of inter- or intramolecular disulfide bonds of redox-sensitive target enzymes by thioredoxins (TRX). Thereby the coupling of photosynthetic energy production with several energy-consuming metabolic processes can be accomplished. The reduction of disulfide bonds in redox-sensitive enzymes was previously shown to lead usually to their activation. Regarding the TBS, several TRX interacting proteins have been identified, including glutamyl-tRNA-reductase (GluTR) as well as the 5-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD). Through the detailed and combined analysis of mutants with deficient NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC), TRX-f and TRX-m, a correlation became evident between decreased chlorophyll and heme levels of the mutants and lower amounts of several TBS enzymes, including GluTR and ALAD. For GluTR1, transgenic Arabidopsis cysteine (Cys, C) ➔ serine (Ser, S) substitution lines were generated and analyzed to identify the redox-sensitive Cys residues in vivo. In these studies, GluTR1(C464S) was shown to be better protected from degradation by the caseinolytic protease (Clp) than the GluTR1 WT protein. Thus, an intermolecular disulfide bond between the Cys464 residues in the dimerization domain of the GluTR1 homodimer is postulated to serve as a degradation signal under oxidizing conditions. However, it was shown by activity- and gel shift-assays with recombinant ALAD1(Cys➔Ser) substitution mutants that not only the stability, but also the in vitro activity of ALAD1 depends on the enzyme's redox state. Redox-sensitive inter- and intramolecular disulfide bridges of ALAD1 were identified among Cys71, Cys152 and Cys251.

Eine Studie zur kovalenten Immobilisierung einiger Porphyrinderivate und einer p-Maleimidophenyl-Spezies (p-MP) auf der Si(111)-Oberfläche wird vorgestellt. Hierbei lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung des Einflusses von Reaktionsparametern auf die Abscheidung und die Qualität organischer Schichten. Die dünnen Schichten werden mittels nasschemischer Methoden abgeschieden. Die hergestellten Strukturen werden mit einer Vielzahl oberflächensensitiver Messtechniken wie der IR-Ellipsometrie, der XPS-, der SEIRA- und der IR-Reflexionsspektroskopie analysiert. Alle Abscheidungen in dieser Arbeit werden in situ durchgeführt, zusätzlich zu den ex situ Reaktionen, um das Verständnis der Filmwachstums- und Depositionsgeschwindigkeiten zu erhalten. Bei der Untersuchung der Porphyrin-Dünnschichten lag der Fokus auf den synthetische Bedingungen der Materialabscheidung. Die Lösungsreaktionen zeigen, dass die Reaktion mit dem voraktivierten Porphyrinderivat zu einer besseren Ausbeute führt als mit dem in situ aktivierten Porphyrin. Wenn diese Reaktion jedoch unter Verwendung des Schicht-für-Schicht-Abscheidungsprinzips auf die Oberfläche übertragen wird, findet die Reaktion mit den oberflächengebundenen Aminosilanmolekülen mit einer viel langsameren Geschwindigkeit statt als die gleiche Reaktion in Lösung. Es wird ein alternativer Syntheseansatz vorgeschlagen, bei dem das Produkt in Lösung hergestellt und dann auf dem oxidierten Si-Substrat abgeschieden wird. Eine weitere in situ-Studie zum p-MP-Elektropfropfen auf der H-terminierten Si(111)-Oberfläche liefert Details zur Dünnschichtbildung im monolagigen und im sub-monolagigen Bereich. Die spontane Pfropfung von p-MP wird ebenfalls in situ überwacht. Es wurde festgestellt, dass die Bildung einer Monoschicht während der stromlosen Abscheidung länger dauert als bei einer elektrochemischen Abscheidung. Als Alternative zum Radikalmechanismus wird ein kationischer Mechanismus vorgeschlagen. / A study on the covalent immobilization of a couple of porphyrin derivatives and a p-maleimidophenyl species (p-MP) on Si(111) surface is presented to investigate how do reaction parameters influence the deposition and the quality of organic layers. The thin films are deposited with “wet chemistry” methods. The prepared structures are analyzed with a variety of surface sensitive techniques, namely, IR ellipsometry, XPS, SEIRA, and IR reflection spectroscopy. All depositions in this work are conducted in situ, in addition to the ex situ reactions, to gain an understanding of the film growth and deposition rates. The study on porphyrin thin films focused on the synthetic conditions of material deposition. Solution reactions indicate that the reaction with the pre-activated porphyrin derivative leads to a better yield than with the in situ-activated porphyrin. However, when this reaction is transferred to the surface by using the layer-by-layer deposition approach, the reaction with the surface-bound aminosilanes molecules takes place at a much slower rate than the same reaction in solution. An alternative synthetic approach, where the product is prepared in solution and then deposited on the oxidized Si substrate, is proposed. A parallel in situ study on p-MP electrografting on the H-terminated Si(111) surface provides details on the thin film formation in a monolayer and a sub-monolayer regime. The spontaneous grafting of p-MP is also monitored in situ. It was found that the formation of a monolayer during the electroless deposition takes longer than an electrochemical deposition. A cationic mechanism is proposed as an alternative to a radical mechanism.

Die Endprodukte der Tetrapyrrolbiosynthese sind essentiell für die Schwefel- und Stickstoffassimilation (Sirohäm), der von Photorezeptoren abhängigen Genexpression (Phytochromobilin), Elektronenübertragungsreaktionen (Häm) und der Photosynthese (Chlorophyll). Die Synthese von Chlorophyllen wird durch eine Mg-Chelatase (MgCh) eingeleitet, die durch das GENOMES UNCOUPLED 4 (GUN4) Protein stimuliert wird. GUN4 ist essentiell für die Aktivierung der MgCh und die Synthese von Chlorophyllen. Das GUN4 aus Arabidopsis thaliana wird ausschließlich an der vorletzten Aminosäure (S264) des C-Terminus phosphoryliert. Die in vitro und in vivo MgCh-Aktivität wird hingegen durch phosphoryliertes GUN4 nicht mehr stimuliert. De-phosphoryliertes GUN4 bewirkt die lichtabhängige Aktivierung der MgCh im Übergang von der Nacht zum Tag in Angiospermen. Im Laufe der Evolution photosynthetisch aktiver Organismen hat sich die in den Angiospermen hochkonservierte Phosphorylierungsstelle entwickelt. GUN4-Homologe aus Synechocystis oder Chlamydomonas werden nicht phosphoryliert. Im Rahmen der Suche nach der GUN4-spezifischen Proteinkinase wurden vier in den Plastiden lokalisierte PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION identifiziert. In dieser Arbeit wurden zusätzlich Experimente zum durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Signalweg durchgeführt. gun Mutanten sind durch eine defizitäre cytosolische Anthocyan-/Flavonoidbiosynthese charakterisiert. Auf der Suche nach Hinweisen für einen Zusammenhang zwischen Anthocyanen und der De-repression von PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES wurde eine neue gun Mutante identifiziert. Der knockout der durch TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) kodierten CHALCON SYNTHASE führte zu einer mit den gun Mutanten vergleichbaren De-repression der PHANGs nach Norflurazon-Behandlung. Pharmakologische Experimente belegen eine mögliche Funktion der Phenylpropanoidbiosynthese in der durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Kommunikation. / Endproducts of the tetrapyrrole biosynthesis pathway are essential for the assimilation of sulfur and nitrogen (siroheme), photoreceptor mediated control of nuclear gene expression (phytochromobilin), electron transfer reactions (heme) and photosynthesis (chlorophyll). The synthesis of chlorophyll is initiated by a Mg-chelatase (MgCh) which is stimulated by the GUN4 protein. GUN4 is essential for the activation of MgCh and synthesis of chlorophyll. GUN4 from Arabidopsis thaliana is exclusively phosphorylated at the next-to-last amino acid of the C-terminus (S264). The stimulatory impact towards MgCh is reduced upon GUN4 phosphorylation. De-phosphorylated GUN4 stimulates MgCh activity during the transition from night to daytime. The phosphorylation site of GUN4 has evolved in the clade of angiosperms. GUN4 homologs of Synechocystis or Chlamydomonas are not phosphorylated. In an attempt to isolate the GUN4-kinase four formerly unknown PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION were identified. In addition to the elucidation of the post-translational GUN4 modifications, experiments concerning the GUN-dependent retrograde signaling pathway were performed. Under conditions which lead to a block of chloroplast development the de-repression of PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES is paralleled by a reduced accumulation of anthocyanins in the gun mutants. When searching for a correlation between anthocyanin biosynthesis and expression of PHANGs a new gun mutant was identified. The knockout of CHALCONE SYNTHASE encoded by TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) leads to a comparable de-repression of PHANGs after norflurazon treatment as it was observed for the gun mutants. Pharmacological modification of phenylpropanoid biosynthesis revealed that an intermediate of the pathway is a component of chloroplast-to-nucleus communication. Hence, first evidences for a function of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in mediating the GUN-dependent retrograde signal were obtained.

In der vorliegenden Arbeit wurde der lichtinduzierte Reaktionszyklus des bakteriellen Phytochroms Agp2 aus Agrobacterium tumefaciens mit FTIR‑ und UV‑Vis‑Spektroskopie untersucht. Der Photorezeptor besteht aus einem photosensorischen Modul und einer signalgebenden Histidin-Kinase-Domäne. Das photosensorische Modul bindet das Tetrapyrrol Biliverdin als Chromophor. Der Grundzustand von Agp2 (Pfr, 750 nm) ist gegenüber dem lichtaktivierten Zustand (Pr, 700 nm) rotverschoben, weshalb Agp2 den Bathyphytochromen zugeordnet wird. Die Untersuchungen erfolgten unter Verwendung von Isotopenmarkierung, H/D-Austauschexperimenten und ortsspezifischer Mutagenese. Daraus ließen sich folgende molekulare Änderungen charakterisieren, welche im Reaktionszyklus von Agp2 erfolgen: Die lichtinduzierte Isomerisierung des Chromophors führt zu einem Übergang vom Pfr- in den Pr-Zustand, wobei zwei Intermediate, Lumi‑F und Meta‑F, durchlaufen werden. Neben der Konformationsänderung des Chromophor‑D‑Rings ist auch die C‑Ring-Propionsäureseitenkette an der Photoreaktion beteiligt. Die C-Ring-Propionsäureseitenkette ist im Pfr-Zustand protoniert und wird im Übergang von Meta-F zu Pr deprotoniert. Der Pr-Zustand weist eine pH-Abhängigkeit auf, welche auf die pH-abhängige Ladung des Histidins 278 der Chromophortasche zurückzuführen ist. Je nach Ladung des Histidins 278 wird die Keto‑ bzw. Enolform der C(19)=O‑Gruppe des D‑Rings stabilisiert. Die Keto/Enol-Tautomerie ist auf eine innerhalb des Chromophors erfolgende Protontranslokation zurückzuführen und moduliert die Relaxation in den Pfr-Zustand. Änderungen der Amid-I-Absorption im Pfr-Pr-Übergang werden der Umstrukturierung der Tongue-Region des photosensorischen Moduls von einer Alpha-helikalen zu einer Beta‑Faltblatt-Struktur zugeordnet. Diese Strukturänderung wird als möglicher Weg der proteininternen Signaltransduktion zwischen photosensorischem und signalgebendem Modul vorgeschlagen. / In this thesis the light-induced reaction cycle of the bacterial phytochrome Agp2 from Agrobacterium tumefaciens was investigated using FTIR and UV‑vis spectroscopy. The photoreceptor comprises a photosensitive module and a signalling histidine kinase domain. The photosensitive module binds the biliverdin tetrapyrrol as chromophore. The Agp2 ground state (Pfr, 750 nm) is red-shifted in comparison with its light-activated state (Pr, 700 nm). Therefore, Agp2 is assigned to the group of bathy phytochromes. The investigations were conducted using isotopically labelled protein, labelled chromophore as well as hydrogen‑deuterium (H‑D) exchange and site-directed mutagenesis. Based on these the following molecular changes could be characterized that occur in the reaction cycle of Agp2: The light-induced isomerization of the chromophore leads to a transition from the Pfr to the Pr state, involving two intermediates, Lumi-F and Meta-F. Besides conformational changes of the chromophore D-ring, the C-ring propionic side chain is involved in the photoreaction as well. The C-ring propionic side chain is protonated in the Pfr state and gets deprotonated in the Meta-F to Pr transition. The Pr state exhibits pH‑dependent alterations which can be explained by pH dependent polarity changes of histidine 278 in the chromophore pocket. Depending on the charge of histidine, the D‑ring C(19)=O group is stabilized either in keto or enol form. The keto/enol tautomerism involves a proton translocation within the chromophore and modulates the relaxation to the Pfr state. The changes in the amide I region in the Pfr-Pr transition are associated with an alpha‑helix to beta‑sheet secondary structure change of the PHY domain tongue‑region. This structural change is proposed as the potential path of signal transduction between the photosensitive and the signalling module.