The Small Cab-like Proteins (SCPs) in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 accumulate in cells grown under different stress conditions. Genes coding for SCPs have been found in all sequenced organisms performing oxygenic photosynthesis and even in the genomes of cyanophages. Deletion of multiple scp genes in Synechocystis resulted in mutants with severely impaired growth and altered pigment content. These findings indicate the importance of SCPs in photosynthesis; however, their specific function is not well understood. SCPs share a chlorophyll-binding motif with the plant light harvesting complex, suggesting that they bind chlorophyll. Here I describe my findings, which unambiguously show that SCPs are able to bind chlorophyll in vitro. Although they affect both the stoichiometric ratio of Photosystem I to II and chlorophyll stability, they do not seem to be directly involved in non-photochemical quenching. I was able to reveal the location of the SCPs within the cyanobacterial cell: in stressed cells they attach to Photosystem II in the thylakoid membrane. Furthermore, I revealed the presence of another light-harvesting like (Lil)/SCP protein in Synechocystis sp. PCC 6803. The gene, slr1544, codifying for this newly characterised LilA protein, co-transcribes together with scpD and also appears to bind to Photosystem II during stress.

Chlorophyll spielt eine unabdingbare Rolle für die lichtabhängige Reaktion der Photosynthese. Die adäquate Versorgung mit Chlorophyll wird dabei durch die Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) gewährleistet. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Proteinen identifiziert, welche an der Anpassung der TBS an wechselnde (a)biotische Wachstumsbedingungen der Pflanze beteiligt sind. Allerdings konnte bislang nicht zweifelsfrei geklärt werden, wie die TBS mit der Integration von Chlorophyllen in die Photosysteme koordiniert wird. Vor einigen Jahren wurde ein Interaktionspartner der Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) in Synechocystis identifiziert, welcher als potenzieller Faktor dieser Koordination in Frage kommt. Das POR-INTERACTING TPR-Protein (Pitt) stabilisiert POR an der Thylakoidmembran und interagiert auch mit dem Vorstufenprotein des D1. Pitt gehört zur Familie der tetratricopeptide repeat (TPR) Proteine, deren Vertreter vorrangig für die Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen zuständig sind. Aus diesem Grund war, neben der Identifikation des potenziellen Pitt-Homologs im Modelorganismus Arabidopsis thaliana, die Analyse von anderen Vertretern dieser Proteinklasse ein vielversprechender Ansatz bei der Identifikation von weiteren Regulatoren der TBS oder Photosynthese. Von den fünf ausgewählten TPR-Proteinen aus Arabidopsis thaliana mit einer hohen Sequenzähnlichkeit zu Pitt waren vier in der Lage, physisch mit POR zu interagieren. Von diesen vier Kandidaten ist das durch das Gen At1g78915 kodierte, membranintegrale TPR-Protein (TPR1) der beste Kandidat des putativen Pitt-Homologs in Arabidopsis. Vergleichbar zu Pitt interagiert TPR1 mit POR und stabilisiert das Enzym an den plastidären Membranen. Die Stabilisierung von POR durch TPR1 spielt eine entscheidende Rolle während der Etiolierung und Ergrünung von Keimlingen. Darüber hinaus steht TPR1 im Zusammenhang mit der schnellen Inaktivierung der 5-Aminolävulinsäuresynthese. / Chlorophyll plays an indispensable role in the light reaction of the photosynthesis. The adequate supply of chlorophyll is ensured by tetrapyrrole biosynthesis (TBS). Within the last decades, multiple proteins were identified, which are involved in adjusting the TBS-pathway to changing (a)biotic plant growth conditions. Nevertheless, it is not fully understood how the TBS-pathway is coordinated parallel to the assembly of the photosystems and the integration of chlorophylls into the pigment-binding subunits of the photosystems. Several years ago, an interaction partner of the protochlorophyllide-oxidoreductase (POR) was identified in Synechocystis which was proposed to be involved in the coordination of these mechanisms. The POR-INTERACTING TPR-Protein (Pitt) binds and stabilizes POR at the thylakoid membranes and interacts with the precursor protein of D1. Therefore, Pitt could facilitate the incorporation of chlorophylls into the plastid-encoded nascent photosynthetic subunits. Pitt belongs to the tetratricopeptide repeat (TPR) protein family, whose members mediate protein-protein-interactions. Besides the identification of the potential Pitt-homolog in the model organism Arabidopsis thaliana, analysis of additional members of the TPR-protein superfamily was a promising approach for the identification of further posttranslational regulators of TBS and photosynthesis. Five Arabidopsis thaliana TPR-proteins with a high sequence similarity to Pitt were selected. Four of those proteins are able to interact physically with POR. Among them, the TPR-protein encoded by the gene At1g78915 (TPR1) was the best candidate to represent a putative Pitt homolog in Arabidopsis. Similar to Pitt, TPR1 is a plastid-localized integral membrane protein, which interacts with POR at the thylakoid membranes. The stabilizing effect of TPR1 on POR is especially needed during etioliation and greening. Additionally, TPR1 is required for a inactivation of the 5'-aminolevulinic acid synthesis.

Die für Pflanzen lebenswichtige Synthese von Tetrapyrrolen bedarf einer fein justierten Anpassung an die Umweltbedingungen und erfolgt auf transkriptioneller und post-translationaler Ebene. In den Chloroplasten hat sich die Regulation von Enzymen über ihren Redox-Status als probates Mittel zur Koordination der photosynthetischen Energiegewinnung und des Metabolismus erwiesen. Die bei der Photosynthese generierten Reduktionsäquivalente werden zum Teil über die Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase auf eine Vielzahl plastidärer Thioredoxine (TRX) übertragen, welche Disulfidbrücken ihrer Zielproteine reduzieren können. Unter den Enzymen der Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) wurden bisher mehrere TRX-Interaktionspartner identifiziert, darunter die Glutamyl-tRNA-Reduktase (GluTR) und die 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase (ALAD). In Arabidopsis Mutanten, in denen die NADPH-abhängige Thioredoxin-Reduktase (NTRC) oder f- und m-Typ-TRX fehlen, konnten verringerte Chlorophyll- und Hämgehalte beobachtet werden. Diese ließen sich auf die verringerte Stabilität verschiedener TBS-Enzyme in den Mutanten zurückführen, darunter auch die GluTR und ALAD. Die Relevanz der Cysteine (Cys, C) für die Regulation der GluTR1-Stabilität wurde in vivo über transgene Arabidopsis Cys➔Serin (Ser, S)-Substitutionslinien untersucht. Dabei erwies sich GluTR1(C464S) stärker vor dem Abbau über die kaseinolytische Protease (Clp) geschützt als das WT-Protein. Eine intermolekulare Disulfidbrücke zwischen den beiden Cys464-Resten des GluTR1-Homodimers wird daher als Abbausignal postuliert. Mit Hilfe der rekombinanten ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Stabilität, sondern auch die Aktivität der ALAD1 in vitro vom Redox-Status des Enzyms abhängig ist. Die ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnten über Enzymaktivitäts- und gel shift-Assays unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen zur Identifizierung der redox-sensitiven Cys beitragen. / The synthesis of tetrapyrroles, such as chlorophyll, is vital for plants and requires a finetuned regulation. The control mechanisms involved in tetrapyrrole biosynthesis (TBS) take place both on transcriptional and post-translational levels. A broadly spread post-translational regulatory mechanism in the chloroplast involves the reduction of inter- or intramolecular disulfide bonds of redox-sensitive target enzymes by thioredoxins (TRX). Thereby the coupling of photosynthetic energy production with several energy-consuming metabolic processes can be accomplished. The reduction of disulfide bonds in redox-sensitive enzymes was previously shown to lead usually to their activation. Regarding the TBS, several TRX interacting proteins have been identified, including glutamyl-tRNA-reductase (GluTR) as well as the 5-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD). Through the detailed and combined analysis of mutants with deficient NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC), TRX-f and TRX-m, a correlation became evident between decreased chlorophyll and heme levels of the mutants and lower amounts of several TBS enzymes, including GluTR and ALAD. For GluTR1, transgenic Arabidopsis cysteine (Cys, C) ➔ serine (Ser, S) substitution lines were generated and analyzed to identify the redox-sensitive Cys residues in vivo. In these studies, GluTR1(C464S) was shown to be better protected from degradation by the caseinolytic protease (Clp) than the GluTR1 WT protein. Thus, an intermolecular disulfide bond between the Cys464 residues in the dimerization domain of the GluTR1 homodimer is postulated to serve as a degradation signal under oxidizing conditions. However, it was shown by activity- and gel shift-assays with recombinant ALAD1(Cys➔Ser) substitution mutants that not only the stability, but also the in vitro activity of ALAD1 depends on the enzyme's redox state. Redox-sensitive inter- and intramolecular disulfide bridges of ALAD1 were identified among Cys71, Cys152 and Cys251.

Die Endprodukte der Tetrapyrrolbiosynthese sind essentiell für die Schwefel- und Stickstoffassimilation (Sirohäm), der von Photorezeptoren abhängigen Genexpression (Phytochromobilin), Elektronenübertragungsreaktionen (Häm) und der Photosynthese (Chlorophyll). Die Synthese von Chlorophyllen wird durch eine Mg-Chelatase (MgCh) eingeleitet, die durch das GENOMES UNCOUPLED 4 (GUN4) Protein stimuliert wird. GUN4 ist essentiell für die Aktivierung der MgCh und die Synthese von Chlorophyllen. Das GUN4 aus Arabidopsis thaliana wird ausschließlich an der vorletzten Aminosäure (S264) des C-Terminus phosphoryliert. Die in vitro und in vivo MgCh-Aktivität wird hingegen durch phosphoryliertes GUN4 nicht mehr stimuliert. De-phosphoryliertes GUN4 bewirkt die lichtabhängige Aktivierung der MgCh im Übergang von der Nacht zum Tag in Angiospermen. Im Laufe der Evolution photosynthetisch aktiver Organismen hat sich die in den Angiospermen hochkonservierte Phosphorylierungsstelle entwickelt. GUN4-Homologe aus Synechocystis oder Chlamydomonas werden nicht phosphoryliert. Im Rahmen der Suche nach der GUN4-spezifischen Proteinkinase wurden vier in den Plastiden lokalisierte PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION identifiziert. In dieser Arbeit wurden zusätzlich Experimente zum durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Signalweg durchgeführt. gun Mutanten sind durch eine defizitäre cytosolische Anthocyan-/Flavonoidbiosynthese charakterisiert. Auf der Suche nach Hinweisen für einen Zusammenhang zwischen Anthocyanen und der De-repression von PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES wurde eine neue gun Mutante identifiziert. Der knockout der durch TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) kodierten CHALCON SYNTHASE führte zu einer mit den gun Mutanten vergleichbaren De-repression der PHANGs nach Norflurazon-Behandlung. Pharmakologische Experimente belegen eine mögliche Funktion der Phenylpropanoidbiosynthese in der durch die GUN-Proteine vermittelten retrograden Kommunikation. / Endproducts of the tetrapyrrole biosynthesis pathway are essential for the assimilation of sulfur and nitrogen (siroheme), photoreceptor mediated control of nuclear gene expression (phytochromobilin), electron transfer reactions (heme) and photosynthesis (chlorophyll). The synthesis of chlorophyll is initiated by a Mg-chelatase (MgCh) which is stimulated by the GUN4 protein. GUN4 is essential for the activation of MgCh and synthesis of chlorophyll. GUN4 from Arabidopsis thaliana is exclusively phosphorylated at the next-to-last amino acid of the C-terminus (S264). The stimulatory impact towards MgCh is reduced upon GUN4 phosphorylation. De-phosphorylated GUN4 stimulates MgCh activity during the transition from night to daytime. The phosphorylation site of GUN4 has evolved in the clade of angiosperms. GUN4 homologs of Synechocystis or Chlamydomonas are not phosphorylated. In an attempt to isolate the GUN4-kinase four formerly unknown PLASTID PROTEIN KINASE WITH UNKNOWN FUNCTION were identified. In addition to the elucidation of the post-translational GUN4 modifications, experiments concerning the GUN-dependent retrograde signaling pathway were performed. Under conditions which lead to a block of chloroplast development the de-repression of PHOTOSYNTHESIS-ASSOCIATED NUCLEAR GENES is paralleled by a reduced accumulation of anthocyanins in the gun mutants. When searching for a correlation between anthocyanin biosynthesis and expression of PHANGs a new gun mutant was identified. The knockout of CHALCONE SYNTHASE encoded by TRANSPARENT TESTA 4 (TT4) leads to a comparable de-repression of PHANGs after norflurazon treatment as it was observed for the gun mutants. Pharmacological modification of phenylpropanoid biosynthesis revealed that an intermediate of the pathway is a component of chloroplast-to-nucleus communication. Hence, first evidences for a function of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in mediating the GUN-dependent retrograde signal were obtained.

Fluorescence in blue light (FLU) ist ein negativer Feedbackregulator der Chlorophyllbiosynthese, welcher an der Dunkelrepression der 5-Aminolävulinsäure (ALA)-Synthese beteiligt ist. FLU ist Teil eines Komplexes, der die Enzyme umfasst, welche an der Katalyse der finalen Schritte der Chlorophyllbiosynthese beteiligt sind. Drei funktionelle Domänen wurden für das Arabidopsis FLU Protein postuliert: eine Tetratricopeptid-Wiederholungsdomäne (TPR) befindet sich am C-Terminus; eine Transmembrandomäne (TM) ist am N-Terminus lokalisiert; eine Coiled-coil-Domäne (linker) liegt dazwischen. Die TPR-Domäne von FLU Domäne interagiert mit dem C-terminalen Ende der Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der ALA-Synthese. Diese Arbeit zur Erweiterung des Wissen über die Funktion von FLU im Licht sowie über die Rolle der funktionellen Domänen von FLU bei der Inaktivierung der ALA-Synthese bei. / Fluorescence in blue light (FLU), a negative feedback regulator of chlorophyll biosynthesis, is involved in dark repression of 5-aminolevulinic acid (ALA) synthesis. FLU is part of a complex comprising the enzymes catalyzing the final steps of chlorophyll synthesis. Three functional domains were proposed in the Arabidopsis FLU protein: a tetratricopeptide repeat (TPR) domain is at the C-terminus; a transmembrane domain (TM) is at the N-terminus; a coiled-coil domain (linker) is in between. The TPR(FLU) domain interacts with the C-terminal end of glutamyl-tRNA reductase (GluTR), the rate-limiting enzyme of ALA synthesis. This thesis contributes to the extended knowledge about the function of FLU in light as well as the role of the structural domains of FLU in the inactivation of ALA synthesis.