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Development of immunoassays for the rapid determination of the endocrine disruptor bisphenol A released from polymer materials and productsRaysyan, Anna 08 October 2021 (has links)
Die COVID-19-Pandemie machte deutlich, wie wichtig die Verfügbarkeit eines Schnelltests für ein funktionierendes Gesundheitssystem ist. Mit dieser einfachen Technologie kann die Unsicherheit in den unterschiedlichen und teils kontroversen statistischen Kennzahlen signifikant verringert werden.
Immunoassays wie LFIA, FPIA und ELISA (Lateral Flow Immunoassay, Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay und Enzymimmunoassay) werden in der Diagnostik und der Umweltanalyse eingesetzt. Die Verwendung von LFIA für ein Screening vor Ort bietet eine Alternative zu instrumentellen Methoden sowie komplizierteren Immunoassay-Formaten und liefert innerhalb von 10 bis 15 Minuten Ergebnisse. Verfahren mit Membranen als feste Träger erlauben parallele Assays in derselben Probe. In dieser Arbeit wurden Latex-Mikropartikel-basierte und Gold-Nanopartikel-basierte LFIAs zum Nachweis von Bisphenol A (BPA) entwickelt. Ein Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Nitrocellulose-Membranen, Konjugatpads, Membranbehandlungen sowie einer geeigneten LFIA-Vorbehandlung zwecks Optimierung. Die Ergebnisse eines LFIA-Tests können sowohl mit bloßem Auge als auch instrumentell interpretiert werden. Die visuelle Nachweisgrenze (vLOD) wurde bei 10 μg/L gefunden, die berechnete instrumentelle Nachweisgrenze (cLOD) war 0,14 μg/L. Die Synthese der Haptenproteinkonjugate und deren weitere Bewertung in einem ELISA-Aufbau führte zu einem hochempfindlichen Assay mit einer Nachweisgrenze von 0,05 μg/L. Zusätzlich wurde ein Mix-and-Read-FPIA zur Bestimmung von BPA entwickelt. Dafür wurden neue Tracer-Moleküle, welche Fluorophore mit Derivaten des Analyten verbinden, einschließlich eines C6-Spacers (Ahx) synthetisiert. Der Einfluss der Ahx-Tracer-Brückenlänge auf die Assay-Empfindlichkeit wurde abgeschätzt, die Nachweisgrenze lag bei 1,0 μg/L mit einem Arbeitsbereich von 2 bis 155 μg/L.
Die Methoden wurden für reale Proben gegen LC-MS/MS als Referenzmethode mit guter Übereinstimmung mit LFIA, FPIA und ELISA validiert. / The COVID-19 pandemic made it obvious how important the availability of a rapid test is for an efficient healthcare system. This simple technology can significantly reduce the uncertainty in the various and sometimes highly controversial statistical figures of a pandemic.
Immunoassays, like LFIA, FPIA and ELISA (lateral flow immunoassay, fluorescence polarization immunoassay, enzyme immunoassay) are used in diagnostics and environmental analysis. The use of LFIA for on-site screening is an alternative to instrumental methods and to more sophisticated immunoassay formats. Results from LFIA are obtained within 10 to 15 min. Methods that use membranes as solid supports allow parallel assays to be performed in the same sample. In this work, latex microparticles-based and gold nanoparticles-based LFIAs for a rapid detection of bisphenol A (BPA) were developed. The work focused on the search for suitable nitrocellulose membranes, conjugate pads, membrane treatments, as well as for a proper LFIA pretreatment to optimize the performance. The results of an LFIA test can be interpreted both by naked eye and instrumentally. The visual limit of detection (vLOD) was found to be 10 μg/L, the calculated instrumental limit of detection (cLOD) was 0.14 μg/L. The synthesis of the required hapten-protein conjugates and further evaluation in an ELISA setup resulted in a highly sensitive assay with a limit of detection of 0.05 μg/L. Additionally, a mix-and-read FPIA for determination of BPA was developed. Here, new tracer molecules that link fluorophores to derivatives of the analyte were synthesized, including a C6 spacer (Ahx). The influence of the Ahx tracer bridge length on the assay sensitivity was estimated. The limit of detection was 1.0 μg/L with a working range from 2 to 155 μg/L.
The methods were validated for real samples against LC-MS/MS as reference method with good agreement with LFIA, FPIA, and ELISA.
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Fluorescent Core-Shell Molecularly Imprinted Particles for Analysis of Highly Polar Biomolecular Motifs and Small-Molecule AnalytesKimani, Martha Wamaitha 10 February 2023 (has links)
In dieser Arbeit wurden fluoreszierende MIP-Partikel hergestellt, um polare Analyten von biologischer und ökologischer Bedeutung zu analysieren, zum Beispiel den Krebs-Biomarker Sialinsäure (SA) und die Herbizide Glyphosat (GPS), Haloxyfop P und Fenoxaprop P. Die MIP-Schale wurde auf Siliziumdioxid und siliziumdioxid-beschichtete Polystyrol (PS)-Kernpartikel synthetisiert und enthielt einen Fluoreszenzfarbstoff, dessen Signal in Anwesenheit der Zielanalyten verstärkt wurde. Die Leistungsfähigkeit aller MIP-Partikel wurde durch den Vergleich ihres Bindungsverhaltens mit den nicht geprägten Polymer (NIP)-Partikeln und/oder durch ihre Diskriminierungsfähigkeit gegenüber konkurrierenden Analyten bewertet. Fluoreszierende Monomer für die MIP-Synthese erwiesen sich als vorteilhaft, da sowohl die Bindungsleistung als auch die Assoziationskonstanten einfacher bestimmt werden konnten. Als Alternative zur traditionellen Wasserstoffbrückenbindung zwischen Analyt und Bindungseinheit des Farbstoffes in unpolaren Lösungsmitteln, kann die Deprotonierung-Protonierung von harnstoffhaltigen Farbstoffen als Sensing-Mechanismus in polaren Medien wie DMF verwendet werden. Darüber hinaus führte die Verwendung eines „Dummy“-Analyten für die NIP-Partikel-Synthese zu einer Polymerschicht mit ähnlichen Eigenschaften wie die der MIP-Partikel, womit "Dummy"-NIPs als deutlich bessere Kontrollpartikel herangezogen werden konnten. Insgesamt erwies sich die Bestimmung der Diskriminierung der MIPs gegenüber konkurrierenden Analyten als konsistenteres Maß für die Leistungsbeurteilung. Mit Siliziumdioxid beschichtete, farbstoffdotierte PS-Partikel erwiesen sich als vielseitige Plattform für das Aufwachsen fluoreszierender MIP-Schalen, um zweifach fluoreszierende MIPs zu erhalten. Das Vorhandensein eines Kontrollsignals ist vorteilhaft für die Korrektur instrumenteller Schwankungen während analytischer Tests. / Fluorescent MIP particles were prepared to target highly polar analytes of biological and environmental significance, namely sialic acid (SA) and glyphosate (GPS), haloxyfop P and fenoxaprop P. Silica and silica-coated polystyrene (PS) particles were used as core supports on which a MIP shell was synthesized. In all systems, the MIP shell contained a fluorescent dye with urea sensing motifs whose signal was enhanced in the presence of the target analyte. The performance of all MIP particles was evaluated by comparing their binding behaviour to that of non-imprinted polymer (NIP) controls and/or determining their discrimination ability against competing analytes. It was found that the application of fluorescent monomers in MIP synthesis is advantageous due to simplified determination of binding performance and binding parameters such as association constants. It was also shown that deprotonation-reprotonation of urea containing dyes can be used as a sensing mechanism in polar media such as DMF, as an alternative to traditional hydrogen bonding in non-polar aprotic solvents. In addition, the results showed that the inclusion of a “dummy” template during NIP synthesis led to the formation of a polymer layer with similar properties as the MIP, and thus, “dummy” NIPs provided a more relevant comparison for MIP binding. Overall, the discrimination of MIPs against competing analytes was found to be a more consistent measure of MIP performance. When a urea containing dye was used to prepare MIPs targeting anions by hydrogen bonding in non-polar media, the choice of counterion used during imprinting influenced the binding behaviour of the resulting MIPs and must be carefully chosen. Lastly, silica-coated dye-doped PS was found to be a versatile platform for the grafting of fluorescent MIP shells to achieve dual fluorescent MIPs, and the presence of a control signal was beneficial in correcting instrumental fluctuations during analytical assays.
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Sensory molecularly imprinted polymer (MIP) coatings for nanoparticle- and fiber optic-based assaysWagner, Sabine 22 March 2019 (has links)
Für den Nachweis dieser Schadstoffe in niedrigen Konzentrationsbereichen sind schnelle und empfindliche Analysemethoden erforderlich. Molekular geprägte Polymere (MIPs) wurden als synthetische Materialien entwickelt, um die molekulare Erkennung von natürlichen Rezeptoren nachzuahmen, aufgrund ihrer Fähigkeit, selektiv eine Vielzahl von Analyten zu erkennen, ihre Stabilität und ihrer einfachen Herstellung. Sie sind zunehmend in der chemischen Sensorik als Rezeptormaterial für den Nachweis bestimmter Analyten bei niedrigen Konzentrationen zu finden, insbesondere in Kombination mit Fluoreszenz aufgrund dessen hoher Empfindlichkeit.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von optischen Sensormaterialien unter Verwendung von MIPs als Erkennungselemente im Zusammenhang mit Fluoreszenz zum sensitiven Nachweis von Herbiziden und Antibiotika in Wasser- und Lebensmittelproben and deren Kombination mit verschiedenen Vorrichtungsformaten für die zukünftige Detektion einer breiten Palette von wichtigen Analyten. / For the detection of these contaminants in low concentration ranges fast and sensitive analytical tools are required. Molecularly imprinted polymers (MIPs) have been used as synthetic materials mimicking molecular recognition by natural receptors due to their ability to recognize selectively a wide range of analytes, their stability and ease of synthesis. They have gained more and more attention in chemical sensing as receptor material for the detection of suitable groups of analytes at low concentrations especially in combination with fluorescence due to the latter’s high sensitivity.
This work aimed the development of optical sensor materials using MIPs as recognition elements connected with fluorescence for the sensitive detection of herbicides and antibiotics in water and food samples and their combination with various device formats for the future detection of a wide range of analytes.
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Particulate systems and thin-film based platformsHecht, Mandy 06 October 2015 (has links)
Die Verbindung von hoch entwickelten Nanomaterialien mit fluoreszenzbasierten Technologien hat sich zu einem aufstrebenden Forschungsbereich entwickelt. Nichtsdestotrotz ist bis heute der Schritt von einem organischen Indikatormolekül zum anwendbaren Sensorsystem ein komplexer Prozess. Diese Arbeit zielte darauf ab, sensorische Materialien verschiedener chemischer Natur für diverse Analyten zu entwickeln, zu charakterisieren und zu etablieren. Hierbei wurden zunächst pH sensitive Fluoreszenzfarbstoffe entwickelt und in dünnen Membranen immobilisiert. Der Teststreifen ermöglicht die Beurteilung von pH-Änderungen mit dem Auge. Darüber hinaus wurde gezeigt, wie diese Farbstoffe auch in eine wasserlösliche Form überführt werden können. Damit konnten lokale pH-Änderungen an der Wachstumsfront von Silikat-Biomorphs detektiert werden. Auch partikuläre Systeme stellten sich als geeignete Materialien heraus. Es konnte gezeigt werden, wie die Silikat-Matrix von Partikeln zu verbesserten Eigenschaften für Farbstoffe führt. Mittels farbstoffbeladener Partikel konnte in einem Lateral-Flow-Assay ein schneller Nachweis von TATP etabliert werden. Ein anderer Ansatz verfolgte das Ziel des sensitiven Nachweises von Quecksilberionen in Wasser. In einem anderen System konnten Silikat-Nanopartikeln so funktionalisiert werden, dass ein sensitiver und selektiver Nachweis von Schwermetallionen und Anionen über ein Quencher-Displacement-Assay gelang. Zusätzlich wurde die einzigartige Oberfläche von Zellulosepartikeln mithilfe eines neu entwickelten Fluoreszenzfarbstoffs untersucht. Die untersuchten Materialien und Strategien zeigen, wie leicht innovative Moleküle für potentielle sensorische Systeme im wässrigen Medium auf Basis von fluoreszierenden Partikeln und dünnen Schichten geschaffen werden können. Das Verhalten der hergestellten Materialien wurde über spektroskopische Methoden evaluiert und dabei, wenn möglich, die Parameter Sensitivität, Selektivität und Ansprechzeit beurteilt. / The combination of fluorescence and nanomaterials has developed into an emerging research area. Nonetheless until now the step from an organic sensory molecule to a final sensor format is a complex endeavor. This thesis aimed at the preparation of particulate and thin-film based platforms for various analytes through combining the features of an appropriate host material with outstanding properties of dyes concomitant with sensitive fluorescence detection techniques. In particular, pH sensitive fluorescent probes were sterically immobilized into a thin membrane. The dip-stick allows the assessment upon change in pH with the eye. Especially a probe working at high basic pH range was converted into a water-soluble analogue and was directly applied at the growth front of silica biomorphs to detect local pH changes. But also particulate structures are suitable host materials. It is shown how the silica matrix of nanoparticles lead to improved optical properties for embedded dyes. The interactions of silica and fluorescent dyes within the pores of mesoporous particles were exploited to develop an actual sensor format based detection of TATP. In another approach it was possible to detect mercury ions in water. Heavy metal ions were also successfully detected in a quencher displacement assay involving receptor-dye functionalized silica nanoparticles. The impact of the unique surface properties of cellulose microparticles was shown by a fluorescent dye which allows an assessment of the surface functional groups and microenvironment through the reactivity and its changes in the optical properties. The performance of the prepared materials were evaluated mostly by spectroscopic methods and if possible assessed in terms of sensitivity, selectivity and response time. The newly developed and investigated materials based on fluorescent particulate and thin-films show the facile application of innovative sensor probes for potentially sensing devices.
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