Innerhalb dieser Arbeit wurde ein kompetitiver ELISA etabliert und validiert, der eine Quantifizierung von Drogen im humanen Serum gemäß geltender Richtlinien ermöglicht. Der Nachweis erzielte zudem vergleichbare Ergebnisse zur Referenzmethode (Massenspektrometrie). Es wurden neun Drogen (Amphetamin, Methamphetamin, Methylenedioxymethamphetamin (MDMA), Tetrahydrocannabinol (THC), Phencyclidin (PCP), Methadon, Morphin, Kokain und Benzoylecgonin) und insgesamt 33 Antikörper verwendet. Alle Reagenzien durchliefen zunächst ein stringentes Validierungsverfahren. Nach Ausschluss möglicher Kreuzreaktivitäten konnten für drei Drogen (Methadon, MDMA und Benzoylecgonin) jeweils ein Antikörper bestimmt werden, der eine spezifische und sensitive Quantifizierung der Droge ermöglichte. Mit dem anti-MDMA Antikörper war zusätzlich der Nachweis in einem miniaturisierten Format (Microarray) möglich. Die verwendeten Antikörper zeigten keine Kreuzreaktivitäten mit anderen Drogen, Antikörpern, dem Probenmaterial oder anderen Versuchskomponenten. Weiterhin wurde kein Einfluss etwaiger Abbauprodukte im langfristig gelagerten Serum beobachtet. Durch die Ergebnisse wird gezeigt, dass ein immunologischer Nachweis von Drogenmissbrauch in Serum eine verlässliche Ergänzung zu bestehenden Methoden darstellt. Bei einer Übertragung des immunologischen Ansatzes auf ein Microarray ergibt sich zudem die Möglichkeit mehrere Drogen und Serumproben parallel nachzuweisen bzw. zu vermessen. Der höhere Probendurchsatz, der kompakte Versuchsaufbau und der geringere Verbrauch an Material gehört zu den größten Vorteilen dieser Technik. / A competitive ELISA was established, which enables a reliable quantification of serological drug samples according to current guidelines. The method achieved comparable results to the standard method mass spectrometry. In total nine drugs (amphetamine, methamphetamine, 3,4-methylenedioxy-methamphetamine (MDMA), tetrahydrocannabinol (THC), phencyclidine (PCP), methadone, morphine, cocaine and benzoylecgonine) and 33 antibodies were tested. All reagents had to pass through a stringent validation process. After exclusion of cross-reactivities antibodies against three drugs (methadone, MDMA, benzoylecgonine) were validated, which allowed a specific and sensitive quantification. Additionally, by using the anti-MDMA antibody a detection of MDMA in serum on microarray (miniaturized format) was achieved. No cross-reactivities were detected for the used antibodies with other drugs, antibodies, sample material or other assay components. Furthermore, no influence of degradation products in long-stored serum was recorded. The results prove, that immunoassays can be a reliable complement to existing methods. By adapting the immunological method to a microarray, the simultaneous quantification of various drugs and serum samples is enabled. The increased through-put, smaller footprint and the decreased consumption of reagents are some of the biggest advantages of this technique.

Bei der adaptiven Immunantwort wird ein breites Repertoire an Effektor-T-Zellen gebildet, das sich durch spezifische und vielfältige funktionelle Fähigkeiten auszeichnet. Neben der Aktivierung der Immunantwort werden Mechanismen benötigt, die Immunantworten regulieren und abschalten können, um unerwünschte Immunreaktion zu verhindern. Die Arbeit befasst sich mit der Rolle von CD152 (CTLA-4), einem Homolog zu CD28, bei der Begrenzung von T-Zellantworten. Die Inhibition der Proliferationsbegrenzung der T-Zellen durch CD152 war ursprünglich auf eine späte Abschaltung der T-Zellproliferation zurückgeführt worden. Wir konnten zeigen, dass CD152 bereits die T-Zellaktivierung abschalten kann und somit die Aktivierungsschwelle der T-Zelle heraufsetzt. Wir konnten auch zeigen, dass CD152 die frühe T-Zellproliferation auf zwei Ebenen inhibiert: Durch die Transkriptionsinitiierung des autologen, Proliferation-induzierenden Zytokins IL-2 und durch die Expression von G1-Kinasen, die für das voranschreiten des Zellzyklus unerläßlich sind. Bisher war es nicht möglich, individuelle, CD152-oberflächen-exprimierende T-Zellen zu detektieren. Um die Expression von CD152 auf der Oberfläche von T-Zellen zu analysieren, haben wir eine sensitive Färbemethode für Oberflächen-exprimiertes CD152 etabliert. Wir konnten damit zeigen, dass während einer antigen-spezifischen Stimulation Zellmembran-gebundenes CD152 lediglich auf einer Subpopulation von aktivierten Zellen (CD152+ T-Zellen) exprimiert wird. Isolierte, aktivierte CD152+ T-Zellen waren im Gegensatz zu aktivierten CD152- T-Zellen bei Restimulation in ihrer Proliferation inhibiert. Dies zeigt auch, dass CD152 in der Lage ist, bereits aktivierte T-Zellen zu inhibieren. Die heterogene Expression von CD152 auf der Oberfläche lässt vermuten, dass die CD152 exprimierenden Zellen, wenn sie ein CD152-Signal bekommen, eine andere Zelldifferenzierung einschlagen als Zellen ohne CD152. Wiederholte oder chronische Aktivierung von Th-Zellen führt zu einer Form von Apoptose, dem Aktivierungs-induzierter Zelltod, gegen den Th2-Zellen resistent sind. Aktivierte Th2-Zellen exprimieren, im Gegensatz zu Th1-Zellen, häufiger CD152 auf ihrer Oberfläche. Wir konnten zeigen, dass CD152-Kreuzvernetzung von aktivierten T-Zellen direkt Resistenz gegen Apoptose vermittelt. Dies geschieht, indem ein Signaltransduktionsmolekül, die PI3´Kinase, aktiviert wird. Dies führt zur Inaktivierung von Apoptose-unterstützenden Molekülen (Phosphorylierung von FKHRL1 und Herunterregulation von FasL) und zur Induktion des Apoptose-verhindernden Moleküls Bcl-2. Vermeidung von Apoptose ist eine zentrale Voraussetzung zur Induktion von Gedächtniszellen. CD152 exprimierende Zellen wären somit gute Kandidaten, um zu Gedächtniszellen zu differenzieren. Um die Rolle von CD152 bei der späten T-Zelldifferenzierung in vivo untersuchen zu können, wurde das CD152 Gen konditionell in der Maus mutagenisiert. / During adaptive immune responses a broad repertoire of effector T-cells is generated, characterized by diverse functional capabilities. Besides activation of the immune response other mechanisms are needed in order to regulate and terminate responses, thus preventing unwanted immune reactions. Here I focus on the role of CD152 (CTLA-4), a homologue of CD28, in the limitation of T-cell responses. Inhibition of T-cell-proliferation by CD152 was originally attributed to a late regulation of the T-cell proliferation. We now show that CD152 is already able to prevent the activation of T-cells and to set the threshold for their activation. We also show that CD152 inhibits T-cell activation in two ways: It inhibits the induction of the growth-factor IL-2 and it inhibits the expression of G1-kinases mandatory for the progression of the cell cycle. Until now, it has not been possible to detect individual T-cells expressing CD152 at their surface. To analyze the expression of CD152 at the surface of individual cells, we developed a sensitive staining method. Using this technique we could show that antigen-specific stimulation of T-cells leads to the expression of surface-bound CD152 only on a fraction of the activated T-cells. Isolated, activated CD152+ T-cells were inhibited in their proliferation whereas CD152- T cells were not. This also shows that CD152 is indeed able to inhibit already activated T-cells. The heterogenous expression of CD152 at the cell surface of already activated T-cells also suggests that CD152+ T-cells will differentiate differently compared to CD152-T-cells. Repeated or chronic activation of Th-cells leads to one form of apoptosis, activation-induced cell death (AICD), against which Th2-cells are resistant. Activated Th2-cells express surface CD152 at higher frequencies than Th1-cells. We show here, that CD152-crosslinking of activated T-cells directly induces resistance against AICD by a mechanism requiring PI3´kinase. This leads to the inactivation of pro-apoptotic molecules (phosphorylation of FKHRL1 and downregulation of FasL). It also leads to the induction of the survival molecule Bcl-2. Prevention of apoptosis is a central prerequisite for the generation of memory cells. Therefore, surface CD152+ T-cells might be good candidates to differentiate into memory cells. To investigate the role of CD152 during the differentiation of T-cells in vivo, the CD152 gene was conditional mutagenese of the CD152 gene was generated.

Die COVID-19-Pandemie machte deutlich, wie wichtig die Verfügbarkeit eines Schnelltests für ein funktionierendes Gesundheitssystem ist. Mit dieser einfachen Technologie kann die Unsicherheit in den unterschiedlichen und teils kontroversen statistischen Kennzahlen signifikant verringert werden. Immunoassays wie LFIA, FPIA und ELISA (Lateral Flow Immunoassay, Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay und Enzymimmunoassay) werden in der Diagnostik und der Umweltanalyse eingesetzt. Die Verwendung von LFIA für ein Screening vor Ort bietet eine Alternative zu instrumentellen Methoden sowie komplizierteren Immunoassay-Formaten und liefert innerhalb von 10 bis 15 Minuten Ergebnisse. Verfahren mit Membranen als feste Träger erlauben parallele Assays in derselben Probe. In dieser Arbeit wurden Latex-Mikropartikel-basierte und Gold-Nanopartikel-basierte LFIAs zum Nachweis von Bisphenol A (BPA) entwickelt. Ein Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Nitrocellulose-Membranen, Konjugatpads, Membranbehandlungen sowie einer geeigneten LFIA-Vorbehandlung zwecks Optimierung. Die Ergebnisse eines LFIA-Tests können sowohl mit bloßem Auge als auch instrumentell interpretiert werden. Die visuelle Nachweisgrenze (vLOD) wurde bei 10 μg/L gefunden, die berechnete instrumentelle Nachweisgrenze (cLOD) war 0,14 μg/L. Die Synthese der Haptenproteinkonjugate und deren weitere Bewertung in einem ELISA-Aufbau führte zu einem hochempfindlichen Assay mit einer Nachweisgrenze von 0,05 μg/L. Zusätzlich wurde ein Mix-and-Read-FPIA zur Bestimmung von BPA entwickelt. Dafür wurden neue Tracer-Moleküle, welche Fluorophore mit Derivaten des Analyten verbinden, einschließlich eines C6-Spacers (Ahx) synthetisiert. Der Einfluss der Ahx-Tracer-Brückenlänge auf die Assay-Empfindlichkeit wurde abgeschätzt, die Nachweisgrenze lag bei 1,0 μg/L mit einem Arbeitsbereich von 2 bis 155 μg/L. Die Methoden wurden für reale Proben gegen LC-MS/MS als Referenzmethode mit guter Übereinstimmung mit LFIA, FPIA und ELISA validiert. / The COVID-19 pandemic made it obvious how important the availability of a rapid test is for an efficient healthcare system. This simple technology can significantly reduce the uncertainty in the various and sometimes highly controversial statistical figures of a pandemic. Immunoassays, like LFIA, FPIA and ELISA (lateral flow immunoassay, fluorescence polarization immunoassay, enzyme immunoassay) are used in diagnostics and environmental analysis. The use of LFIA for on-site screening is an alternative to instrumental methods and to more sophisticated immunoassay formats. Results from LFIA are obtained within 10 to 15 min. Methods that use membranes as solid supports allow parallel assays to be performed in the same sample. In this work, latex microparticles-based and gold nanoparticles-based LFIAs for a rapid detection of bisphenol A (BPA) were developed. The work focused on the search for suitable nitrocellulose membranes, conjugate pads, membrane treatments, as well as for a proper LFIA pretreatment to optimize the performance. The results of an LFIA test can be interpreted both by naked eye and instrumentally. The visual limit of detection (vLOD) was found to be 10 μg/L, the calculated instrumental limit of detection (cLOD) was 0.14 μg/L. The synthesis of the required hapten-protein conjugates and further evaluation in an ELISA setup resulted in a highly sensitive assay with a limit of detection of 0.05 μg/L. Additionally, a mix-and-read FPIA for determination of BPA was developed. Here, new tracer molecules that link fluorophores to derivatives of the analyte were synthesized, including a C6 spacer (Ahx). The influence of the Ahx tracer bridge length on the assay sensitivity was estimated. The limit of detection was 1.0 μg/L with a working range from 2 to 155 μg/L. The methods were validated for real samples against LC-MS/MS as reference method with good agreement with LFIA, FPIA, and ELISA.

Die Kontamination von Trinkwasser mit Arzneimitteln stellt eine ernste Gesundheitsgefahr dar. Um die Trinkwasserqualität kontinuierlich überwachen und im Falle einer Verunreinigung zeitnah reagieren zu können, sind neuartige Sensoren erforderlich. Hier können immunanalytische Methoden, die auf der Bindung des Analyten an hochselektive Antikörper beruhen, hilfreich sein. In dieser Arbeit wurden magnetpartikelbasierte Immunoassays (MBBAs) für zwei relevante Kontaminanten des Trinkwassers entwickelt: Diclofenac (DCF) und Amoxicillin (AMX). Bei letzterem erwiesen sich neben der Ausgangsverbindung auch dessen Hydrolyseprodukte (HPs) als relevant für die Gefährdungsbeurteilung. In einer umfassenden Studie wurde der Einfluss von externen Faktoren und intrinsischen Eigenschaften des Wassers auf die Hydrolysegeschwindigkeit untersucht. Da die Hydrolyse von AMX auch die Erkennung durch den Antikörper beeinflusst, wurde eine Strategie zur Analyse von Proben mit unbekanntem Hydrolysegrad von AMX unter Verwendung des Enzyms β-Lactamase in der Probenvorbereitung entwickelt. Für beide Analyten ermöglichen die MBBAs eine schnelle Quantifizierung mit Ergebnissen in weniger als einer Stunde, was eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Immunoassays wie dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) darstellt. Im Vergleich zu den entsprechenden ELISAs mit denselben Antikörpern weisen die MBBAs zudem verbesserte analytische Parameter auf, wie einen breiteren Messbereich und niedrigere Nachweisgrenzen. Aufgrund der magnetischen Eigenschaften der Partikel, die als Plattform für die Assays dienen, eignen sie sich für den mobilen und automatisierten Einsatz vor Ort. Ein integriertes Diagnosesystem, bei dem die elektrochemische Detektion mittels Chronoamperometrie auf einem mikrofluidischen Chip eine weitere Miniaturisierung des Systems ermöglicht, wurde entworfen, um die Überwachung der Trinkwasserqualität online in Wasserwerken zu ermöglichen. / The contamination of drinking water with pharmaceuticals represents a severe health risk. In order to monitor the drinking water quality continuously and enable quick countermeasures in case of contamination, novel sensors are required. Here, immunoanalytical methods based on the binding of the analyte to highly selective antibodies can be helpful. In this work, magnetic bead-based immunoassays (MBBAs) have been developed for the detection of two relevant contaminants of drinking water: diclofenac (DCF) and amoxicillin (AMX). In case of the latter, not only the parent drug is of interest in the risk assessment but also its hydrolysis products (HPs). In a comprehensive study, the influence of external factors and intrinsic properties of the water on the rate of hydrolysis was investigated. As the hydrolysis of AMX further impacts the recognition by the antibody, a strategy to analyze samples with unknown hydrolysis degree of AMX was established employing the enzyme β-lactamase in sample preparation. For both analytes, the MBBAs enable the fast quantification with results obtained in less than one hour which represents a major improvement over conventional immunoassays like the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Compared to the respective ELISAs with the same antibodies, the MBBAs further exhibit improved analytical parameters such as a broader measurement range and lower limits of detection. Due to the magnetic properties of the beads that serve as a platform for the assays, they are suitable for the mobile and automated detection at the point-of-care. An integrated diagnostic system was designed in which electrochemical detection with chronoamperometry on a microfluidic chip allows for further miniaturization of the system to enable monitoring of the drinking water quality online in water supply pipes at waterworks.