Reaktionen zwischen reaktiven Oligonukleotiden, die durch komplementäre Nukleinsäuretemplate in hoher effektiver Molarität angeordnet werden, haben auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik an Bedeutung gewonnen. Sie bieten die Möglichkeit zur Erzeugung von mehreren Signalmolekülen pro Templat, wenn die templatgebundenen Produkte durch neue Reaktanden verdrängt werden. Da die Produkte ebenfalls hohe Templataffinitäten aufweisen, schränken sie jedoch die katalytische Templataktivität ein (Produktinhibierung). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuer Ansatz zur Umgehung der Produktinhibierung entwickelt. Dazu wurde eine DNA-vermittelte PNA-Verknüpfungsreaktion in eine PCR integriert. Die Reaktion wurde direkt durch das während der PCR vervielfältigte Templat ausgelöst und erfolgreich in der einzelbasenspezifischen Genotypisierung von genomischer DNA eingesetzt. Die Nachweisgrenze war mit 30 Templatmolekülen im Vergleich zu bisherigen templatgesteuerten Reaktionen um etliche Größenordnungen niedriger. Ein alternativer Ansatz widmete sich neuen Strategien zur Verminderung der Produktinhibierung. Templatgesteuerte Verknüpfungs-Zyklisierungsreaktionen lieferten zyklische Verknüpfungsprodukte, welche gegenüber ihren linearen Pendants durch deutlich geringere Templataffinitäten gekennzeichnet waren. Daher überstiegen die Ausbeuten jene von Verknüpfungsreaktionen ohne Zyklisierung. Die Zunahme der Templataffinität in Folge der Verknüpfung wurde jedoch durch die Zyklisierung nicht vollständig kompensiert. Daher wurden templatgesteuerte Transferreakionen entwickelt, bei denen das DNA-Templat die Zyklisierung von nicht verknüpften Reaktionsprodukten steuert. Diese waren durch geringere Templataffinitäten als die linearen Reaktanden gekennzeichnet. Die Transfer-Zyklisierungsreaktionen lieferten bei fortgeschrittener Reaktion höhere Ausbeuten als Transferreaktionen ohne Zyklisierungsschritt. Dies bestätigte die erfolgreiche Verminderung der Produktinhibierung. / Reactions between reactive oligonucleotides that are aligned by complementary nucleic acid templates at high effective molarities have gained considerable attention in the field of nucleic acid diagnostics. They are capable of generating multiple signaling molecules per target, if the template-bound products are replaced by fresh reactants. However, since product molecules usually exhibit high template affinities, they impede the catalytic activity of the template (product inhibition). This work initially describes the development of a new approach that bypasses product inhibiton. To this end, a DNA-mediated PNA-ligation reaction was integrated in a PCR. The reaction was directly triggered by the template which was amplified during PCR. Furthermore, the reaction was successfully applied in single base-specific genotyping of genomic DNA. The limit of detection (30 template molecules) was several magnitudes lower compared to previous template-controlled reactions. In an alternative approach, new strategies to reduce product inhibition were developed. Template-mediated ligation-cyclization (“cycligation”) reactions generated cyclic ligation products that were characterized by significantly lower template affinities compared to their linear counterparts. The yields upon cycligation were higher than those from ligation reactions without cyclization. However, the increase in template affinity gained upon ligation of the reactants could not be completely compensated through product cyclization. Therefore, template-mediated transfer reactions were designed in which the DNA-template actuates the cyclization of non-ligated products. These were characterized by reduced template affinities compared to the linear reactants. The transfer-cyclization reactions produced higher yields than transfer reactions without a cyclization step, thereby confirming the successful reduction of product inhibition.

Die Detektion von Nukleinsäuren ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Erkennung von viralen und bakteriellen Spezies in biologischen Proben. Oligonukleotid-vermittelte Reaktionen (OVR), die die Zielsequenz als Katalysator der chemischen Reaktion zwischen reaktiven Sonden verwenden, bieten gegenüber den enzymatischen Methoden viele Vorteile, wie z.B. Simplizität und Kosteneffizienz. Normalerweise besitzt das Produkt der OVR deutliche fluoreszierende Eigenschaften, die durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen werden können. Die Haupteinschränkung solcher Systeme ist die nur moderate Helligkeit von organischen Farbstoffen, die meistens zur Markierung von reaktiven Sonden genutzt werden. Um dieses Problem zu lösen, sind Fluorophore mit höherer Helligkeit erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Detektion von RNA durch Templat-vermittelten Transfer des Fluorophors auf den Quantum Dot (QD). Das System besteht aus zwei reaktiven Peptide Nucleic Acid (PNA)-basierten Antisense-Sonden. Die Label Akzeptor PNA (LAPNA) Sonde ist auf dem QD immobilisiert und enthält eine Cysteineinheit am N-terminus. Die Label Donor PNA (LDPNA) Sonde trägt eine Cy5-Einheit, die als Thioester gebunden ist. Durch die benachbarte Hybridisierung der Sonden am RNA-Templat nimmt die effektive Molarität der reaktiven Gruppen zu, und führt somit durch das Prinzip von Native Chemical Ligation zum Transfer des Cy5 auf den QD. Dies resultiert in Förster−Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen dem QD und den Cy5-Molekülen, der durch die Löschung der Emission des QDs sowie die Verstärkung der Fluoreszenz des Cy5 beobachtet werden kann. Die Verwendung von sehr hellen QDs als FRET-Donor ermöglicht die Umsetzung von Sonden bei geringen Konzentrationen und ermöglicht die Erkennung von RNA mit Nachweisgrenzen im Bereich von weniger pikomolar. / Detection of nucleic acids is one of the most reliable methods for the identification of bacterial and viral species in biological samples. Oligonucleotide-templated reactions (OTRs) that exploit an RNA or DNA target to catalyze a chemical reaction hold great promise for the development of enzyme-free and low-cost detection schemes. Commonly, these strategies rely on organic dyes and are designed so that the product of OTR exhibits distinct fluorogenic properties. The main constraint of such schemes is the moderate brightness of organic fluorophores, which limits the read-out when the probes are used at low concentrations. To tackle this obstacle, significantly brighter fluorophores are needed. This work describes the development of an RNA detection scheme that relies on target-templated fluorophore transfer onto a semiconductor quantum dot (QD). The approach uses two reactive peptide nucleic acid (PNA) antisense probes. Label acceptor peptide nucleic acid (LAPNA) probe is immobilized on a QD and bears a cysteine at the N-terminus; label donor peptide nucleic acid (LDPNA) probe is equipped with a Cy5 dye, attached as a thioester. The adjacent annealing of these recognition elements following binding to target RNA triggers the transfer of Cy5 onto a QD in a native chemical ligation manner. This leads to a detectable fluorescence signal brought about by FRET from QD to the Cy5. The use of unprecedentedly bright QDs that can act as FRET donors for several Cy5 functionalities allows application of probes at very low concentrations (pM range) and achieves enhanced sensitivity of target-templated RNA detection. The method enabled RNA detection in the low pM range using a conventional microtiter plate reader.