Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden. / The main aim of this work was the development of a DNA-based nanostructure. The universal four-letter code of DNA allows addressing bonds at the molecular level. The chemical and physical property of DNA makes this macromolecule an ideal candidate as a construction element for nanostructures. The aim of this work was to span a DNA strand between two fixed points. For this purpose it was necessary to develop a method which makes it possible to deposit functional molecules as anchoring elements with highly spatial resolution on a surface. These molecules should be immobilized on the lower micrometer scale to meet the requirements of the desired nanostructure. The method that has been developed for this task, which enables to deposit functional molecules, uses the binding pair biotin-neutravidin. Using the tip of an atomic force microscope (AFM), which can be uses like a pen, it was possible to deposit neutravidin on the lower micrometer scale. This neutravidin molecule is the linking element between the biotinylated glass surface and the actual address molecule. The thus generated neutravidin field could then be functionalized with a biotinylated molecule by incubation. The method has been published as sequential spotting method because it enables a sequential functionalization of neutravidin after it has been deposited. It was so possible to build up a multi-component array. The limitation of being able to deposit only one single substance with an AFM has been circumvented. It also was necessary to create anchor elements in order to immobilize the DNA at defined positions. The processing of the DNA was carried out using molecular biological methods and aimed at generating a DNA strand, which at both ends has a complementary sequence for binding to the surface bound anchor elements. The defined structure is a result of the geometry of the fixed points, generated by the AFM. Using fluorescence microscopy, the constructed DNA nanostructure was detected. The proof of the interaction of DNA-binding molecules with the DNA structure was carried out by the binding of PNA (peptide nucleic acid), which is capable of binding to double stranded DNA. The PNA and its DNA-interaction is a functional building block in the nanometer scale and can be regarded as a promising nanostructure.

Der Trend in der Kunststoffverarbeitung geht in Richtung Funktionalisierung von Bauteilen, d.h. die Funktion mehrerer Komponenten wird durch ein einziges Bauteil übernommen. Ein Beispiel ist die technische Vereinigung von Kunststoff- mit Elektronikbauteilen, sogenannte spritzgegossene Schaltungsträger (Molded Interconnect Devices, MID). Deren Herstellung ist gemäß Stand der Technik jedoch äußerst energie-, zeit- und kostenintensiv. Die Veröffentlichung stellt daher eine prozesstechnische Alternative zur Herstellung von MID-Bauteilen vor, bei welcher die Leiterbahnaufbringung ohne zusätzliche Schritte und ohne nasschemische Prozesse auskommt.

Whole-cell sensors represent an emerging branch in biosensor development since they obviate the need for enzyme/antibody purification and provide the unique opportunity to assess global parameters such as genotoxicity and bioavailability. Yeast species such as Saccharomyces cerevisiae are ideal hosts for whole-cell sensor applications. However, current approaches almost exclusively rely on analyte-induced expression of fluorescent proteins or luciferases that imply issues with light scattering and/or require the supply of additional substrates. In this study, the yeast α-factor mating pheromone, a peptide pheromone involved in cell-cell communication in Saccharomyces cerevisiae, was utilized to create the whole-cell sensor read-out signal, in particular by employing engineered sensor cells that couple the response to a user-defined environmental signal to α-factor secretion. Two novel immunoassays - relying on hydrophobin-based surface engineering - were developed to quantify the α-factor. Hydrophobins are amphiphilic fungal proteins that self-assemble into robust monolayers at hydrophobic surfaces. Two recombinant hydrophobins, either lacking (EAS) or exposing the α-factor pheromone (EAS-α) upon self-assembly, were used to functionalize polystyrene supports. In a first approach (competitive immunoassay), pheromone-specific antibodies initially bound to the functionalized surface (due to the α-factor exposed by the hydrophobin layer) were competitively detached by soluble α-factor. In a second approach, the antibodies were first premixed with pheromone-containing samples and subsequently applied to functionalized surfaces, allowing for the attachment of antibodies that still carried available binding sites (inverse immunoassay). Both immunoassays enabled quantitative assessment of the yeast pheromone in a unique but partially overlapping dynamic range and allowed for facile tuning of the assay sensitivity by adjustment of the EAS-α content of the hydrophobin layer. With a limit of detection of 0.1 nM α-factor, the inverse immunoassay proved to be the most sensitive pheromone quantification assay currently available. Due to the high stability of hydrophobin monolayers, functionalized surfaces could be reused for multiple consecutive measurements. Favorably, both immunoassays proved to be largely robust against the changes in the sample matrix composition, allowing for pheromone quantification in complex sample matrices such as yeast culture supernatants. Hence, these immunoassays could also be applied to study the pheromone secretion of wild-type and engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Additionally, a proof-of-concept whole-cell sensor for thiamine was developed by combining the hydrophobin-based immunoassays with engineered sensor cells of Schizosaccharomyces pombe modulating the secretion of the α-factor pheromone in response to thiamine. Since this read-out strategy encompasses intrinsic signal amplification and enables flexible choice of the transducer element, it could contribute to the development of miniaturized, portable whole-cell sensors for on-site application.

Die Modifizierung von Carbon Black Partikeln und multi-walled Carbon Nanotubes mit Poly(vinylformamid-co-vinylamin) wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert untersucht, um primäre Aminogruppen auf die Oberfläche der Kohlenstoffspezies einzuführen. Mit einer anschließenden Pfropfreaktion der Aminogruppen tragenden Nanotubes mit Maleinsäureanhydrid-Copolymeren sind eine Vereinzelung und ein Stabilisieren der der Carbon Nanotubes möglich. Durch eine Auswahl an Maleinsäureanhydrid-Copolymeren war nach einer Funktionalisierung der mit PVFA-co-PVAm beschichteten Carbon Nanotubes die Änderung der Oberflächeneigenschatften von hydrophil bis hin zu ultrahydrophob möglich. Die Charakterisierung der Partikel und Nanotubes erfolgte mit Hilfe der Elementaranalyse, BET-Untersuchungen, XPS, Kontaktwinkelmessungen, TGA-Untersuchungen, elektrokinetischer Messungen und REM-Aufnahmen.

Direct Laser Interference Structuring (DLIP) is a manufacturing technology capable to functionalize large areas with high-precision periodic patterns. However, for industrial use of this emerging technology, solutions must be developed for specific requirements. With the objective of optimizing Direct Laser Interference Patterning in terms of process speed, an advanced optical module was developed that permits to superimpose two laser beams obtaining the interference pattern within an elongated area (linear spot) to meet the requirements of high-speed processing. After that, the influence of the process parameters on the quality of the surface patterns produced with the developed optical assembly was determined. It could be shown that the pulse overlap, in contrast to the applied average fluence, has a significant influence on the resulting structure heights of the produced patterns. Furthermore, it became apparent that during the course of the process, the underlying physical process dynamics seem to change, which was indicated by the resulting structure heights variations over the process. The gained findings will make a contribution to improving the quality of surface patterns produced with DLIP and to enabling reliable manufacturing qualities in the future.

Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung von hierarchischen Mikrosieben mit Hilfe des Float-Casting-Verfahrens. Mikrosiebe zählen zu den porösen Membranen und weisen gegenüber anderen Vertretern poröser Membranen einige Besonderheiten auf. Dazu zählt eine Membrandicke kleiner als ihr Porendurchmesser, eine enge Porengrößenverteilung, eine glatte Oberfläche und eine hohe Porosität. Mikrosiebe zeichnen sich auf Grund dieser Eigenschaften durch hohe Trennschärfen und Permeanzen aus und lassen sich leichter reinigen. Der Fokus dieser Arbeit liegt darin, durch Verwendung spezieller Partikel, den Himbeerpartikeln, hierarchisch strukturierte Mikrosiebe zu erhalten. Die hierarchische Struktur besteht dabei aus einer Trennfläche mit Poren kleiner als 300 nm und einem stützenden Teil bestehend aus größeren Poren. Beide sollen in einem Schritt erzeugt werden, um Komplikationen zu umgehen, die bei getrennter Herstellung von Mikrosieb und Stützstruktur entstehen können. Dazu zählen unter anderem sich ausbildende Risse im Mikrosieb beim Transfer auf die Stützstruktur und eine mangelnde Anhaftung zwischen Mikrosieb und Stützstruktur. Die benötigten Himbeerpartikel werden ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert. Es wird diskutiert, welche Anforderungen die Partikel erfüllen müssen, um für die Mikrosiebherstellung geeignet zu sein. Dafür werden verschiedene Ansätze der Himbeerpartikel-Synthese verfolgt. Mit erfolgreich hergestellten Mikrosieben werden Filtrations- und Permeanzversuchen durchgeführt, um ihren Einsatz als Filter zu evaluieren.:1 Einleitung und Motivation 2 Theorie und Grundlagen 2.1 Himbeerpartikel 2.1.1 Synthese von sphärischen Partikeln 2.1.1.1 Stöber-Partikel-Synthese 2.1.1.2 Emulsionspolymerisation 2.1.2 Oberflächenfunktionalisierung von Partikeln 2.1.2.1 Adsorption 2.1.2.2 Kovalente Anbindung 2.1.3 Synthese von Himbeerpartikeln 2.1.3.1 Synthese der Kernpartikel in der Gegenwart von Satellitenpartikeln 2.1.3.2 Synthese der Satellitenpartikel in der Gegenwart von Kernpartikeln 2.1.3.3 Getrennte Synthese von Kern- und Satellitenpartikeln 2.1.3.4 Stabilisierung von Himbeerpartikeln 2.2 Membranen 2.2.1 Filtration mit Membranen 2.2.2 Polymermembranen 2.2.3 Nachteile konventioneller Membranen 2.3 Mikrosiebe 2.3.1 Anwendung von Mikrosieben 2.3.2 Herstellungsmethoden 2.3.3 Float-Casting-Verfahren 2.3.3.1 Benetzungsverhalten von Flüssigkeiten auf Flüssigkeiten 2.3.3.2 Mikrosiebherstellung durch das Float-Casting-Verfahren 2.3.3.3 Stabilisierung von Mikrosieben erhalten aus dem Float-Casting-Verfahren 3 Ergebnisse und Diskussion 3.1 Himbeerpartikel via Pickering-Emulsionen 3.1.1 Synthese von Himbeerpartikeln mit Wachskern 3.1.2 Mikrosiebherstellung mittels Himbeerpartikeln mit Wachskern 3.2 Himbeerpartikel erhalten durch Mikrofluidik 3.2.1 Erzeugung monodisperser Tropfen und Partikel erhalten mittels Mikrofluidik 3.2.2 Himbeerpartikel-Synthese basierend auf PS-Partikeln erhalten mittels Mikrofluidik 3.2.3 Mikrosiebherstellung mit Himbeerpartikeln erhalten mittels Mikrofluidik 3.3 Himbeerpartikel erhalten via Sprühtrocknen 3.3.1 Membranherstellung mit nicht sphärischen Himbeerpartikeln erhalten mittels Sprühtrocknen 3.3.2 Membranherstellung mit sphärischen Himbeerpartikeln erhalten mittels Sprühtrocknen 3.4 Himbeerpartikel via Aufwachsen von Satellitenpartikel und deren Mikrosiebe 3.5 Himbeerpartikel-Synthese basierend auf einer Oberflächen-Reaktion 3.5.1 Himbeerpartikel mit 75-μm-großen Kernpartikeln 3.5.2 Vergleich von einem Epoxid-Silan mit einem Isocyanat-Silan 3.5.3 Nachweis der Oberflächenfunktionalisierung 3.5.4 Vergleich verschiedener Amin-Beschichtungen 3.5.5 Einbetten der Himbeerpartikel in einem Polymerfilm 3.5.5.1 Stabilisierung der Satellitenpartikeln mit Tetraethylorthosilicat 3.5.5.2 Lage der Himbeerpartikel an der Wasser-Luft-Grenzfläche 3.5.5.3 Einfluss des Lösungsmittels auf die Lage der Himbeerpartikel im Polymerfilm 3.5.5.4 Charakterisierung der Trennflächen und Poren 3.5.6 Filtrationsversuche 3.5.7 Permeanz-Versuche 3.5.8 Variation der Größe von Templatpartikeln 4 Zusammenfassung und Ausblick 5 Experimenteller Teil 5.1 Verwendete Chemikalien 5.2 Verwendete Geräte 5.3 Synthese von Kern- oder Satellitenpartikel 5.3.1 Synthese Stöber-Partikel (SiO2-Partikeln) 5.3.2 Erzeugung von Polystyrol-Partikeln mittels Mikrofluidik 5.3.3 Synthese Kern-Schale-Partikel 5.4 Funktionalisierung der Partikel 5.5 Herstellung von Himbeerpartikeln 5.5.1 Aus einer Pickering-Emulsion mit Paraffinwachs und SiO2-Partikeln 5.5.2 Verbinden von Polystyrol-Partikeln erhalten aus der Mikrofluidik mit SiO2-Partikeln 5.5.3 Erzeugen von Polystyrol-Aufwüchsen auf SiO2-Partikeln 5.5.4 Erzeugen von SiO2-Aufwüchsen auf Kern-Schale-Partikeln 5.5.5 Verbinden von Kern- und Satellitenpartikeln über eine Oberflächenreaktion 5.6 Herstellung der Mikrosiebe mit dem Flat-Casting-Verfahren 5.7 Filtration 1 5.8 Permeanz 6 Quellen Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge

In dieser Arbeit wurden Techniken untersucht, die die zur Verfügung stehende Pulsenergie von Hochleistungslasern effektiv nutzen und in einem Schritt eine Vielzahl einzelner periodisch angeordneter Strukturen herstellen. Dazu wird durch optische Strahlformung ein Laserstrahl mit mehreren Intensitätsmaxima hergestellt. Dazu wurden das Direkte Laserinterferenzstrukturieren (DLIP) und die Microlensarray-Strukturierung (MLAS) genutzt. Beide Verfahren bieten die Möglichkeit, großflächig periodische Strukturen in einem einstufigen Verfahren herzustellen. Beim DLIP werden mit einem Laserpuls, aufgrund von Interferenzeffekten mehrere tausend Linien oder Punkte auf bis zu Quadratzentimeter großen Flächen erzeugt. Microlensarrays (MLA) sind optische Elemente mit einer periodischen Linsenanordnung, die mehrere Brennpunkte aus einem einzigen Laserstrahl erzeugen. Durch die Verwendung als Fokussieroptik können einige tausend Laserpunkte mit einem einzigen Puls erzeugt werden. Anhand verschiedener Materialien werden die Möglichkeiten und Grenzen dieser Techniken untersucht und die Qualität der Strukturen im Hinblick auf die geplante Anwendung untersucht. Die für diese Arbeit genutzten Materialien sind ausschließlich nichtmetallische Werkstoffe. Es werden die Keramiken Hydroxylapatit, Aluminium- und Zirkonoxid, die leitfähigen Dünnschichten aluminium- und bordotiertes Zinkoxid und Indiumzinnoxid auf Glassubstrat und der Kunststoff PET untersucht. Hydroxylapatit ist eine Keramik die aufgrund ihrer guten Biokompatibilität in Knochen- und Zahnimplantaten verwendet wird. Eine Oberflächenstrukturierung ermöglicht eine Verbesserung des Zellwachstums. Aluminium- und Zirkonoxid werden ebenfalls in Gelenkimplantaten verwendet jedoch als Gleitfläche. Eine Strukturierung dieser Flächen verringert möglicherweise Reibung und Verschleiß in ähnlicher Weise wie bei Metallen bereits mehrfach gezeigt. Hier werden aufgrund der benötigten Strukturgrößen mit Perioden von mehreren Mikrometern sowohl DLIP als auch MLAS genutzt. Die leitfähigen Schichten und das PET finden vorrangig in optischer Elektronik Anwendung. Diese findet zunehmende Bedeutung in Form von Solarzellen und Lichtemittierenden Dioden. Die periodische Strukturierung des Substrates oder des beschichteten Substrates bringt ein Beugungsgitter in diese Elemente ein. Bestehende Untersuchungen haben bereits einen positiven Effekt von lithografisch hergestellten Beugungsgittern nachgewiesen. In dieser Arbeit wird untersucht, ob DLIP ebenfalls einen positiven Effekt hat.

Detection and quantification of small peptides, such as yeast pheromones, are often challenging. We developed a highly sensitive and robust affinity-assay for the quantification of the α-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae based on recombinant hydrophobins. These small, amphipathic proteins self-assemble into highly stable monolayers at hydrophilic-hydrophobic interfaces. Upon functionalization of solid supports with a combination of hydrophobins either lacking or exposing the α-factor, pheromone-specific antibodies were bound to the surface. Increasing concentrations of the pheromone competitively detached the antibodies, thus allowing for quantification of the pheromone. By adjusting the percentage of pheromone-exposing hydrophobins, the sensitivity of the assay could be precisely predefined. The assay proved to be highly robust against changes in sample matrix composition. Due to the high stability of hydrophobin layers, the functionalized surfaces could be repeatedly used without affecting the sensitivity. Furthermore, by using an inverse setup, the sensitivity was increased by three orders of magnitude, yielding a novel kind of biosensor for the yeast pheromone with the lowest limit of detection reported so far. This assay was applied to study the pheromone secretion of diverse yeast strains including a whole-cell biosensor strain of Schizosaccharomyces pombe modulating α-factor secretion in response to an environmental signal.

Detection and quantification of small peptides, such as yeast pheromones, are often challenging. We developed a highly sensitive and robust affinity-assay for the quantification of the α-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae based on recombinant hydrophobins. These small, amphipathic proteins self-assemble into highly stable monolayers at hydrophilic-hydrophobic interfaces. Upon functionalization of solid supports with a combination of hydrophobins either lacking or exposing the α-factor, pheromone-specific antibodies were bound to the surface. Increasing concentrations of the pheromone competitively detached the antibodies, thus allowing for quantification of the pheromone. By adjusting the percentage of pheromone-exposing hydrophobins, the sensitivity of the assay could be precisely predefined. The assay proved to be highly robust against changes in sample matrix composition. Due to the high stability of hydrophobin layers, the functionalized surfaces could be repeatedly used without affecting the sensitivity. Furthermore, by using an inverse setup, the sensitivity was increased by three orders of magnitude, yielding a novel kind of biosensor for the yeast pheromone with the lowest limit of detection reported so far. This assay was applied to study the pheromone secretion of diverse yeast strains including a whole-cell biosensor strain of Schizosaccharomyces pombe modulating α-factor secretion in response to an environmental signal.

Whole-cell sensors represent an emerging branch in biosensor development since they obviate the need for enzyme/antibody purification and provide the unique opportunity to assess global parameters such as genotoxicity and bioavailability. Yeast species such as Saccharomyces cerevisiae are ideal hosts for whole-cell sensor applications. However, current approaches almost exclusively rely on analyte-induced expression of fluorescent proteins or luciferases that imply issues with light scattering and/or require the supply of additional substrates. In this study, the yeast α-factor mating pheromone, a peptide pheromone involved in cell-cell communication in Saccharomyces cerevisiae, was utilized to create the whole-cell sensor read-out signal, in particular by employing engineered sensor cells that couple the response to a user-defined environmental signal to α-factor secretion. Two novel immunoassays - relying on hydrophobin-based surface engineering - were developed to quantify the α-factor. Hydrophobins are amphiphilic fungal proteins that self-assemble into robust monolayers at hydrophobic surfaces. Two recombinant hydrophobins, either lacking (EAS) or exposing the α-factor pheromone (EAS-α) upon self-assembly, were used to functionalize polystyrene supports. In a first approach (competitive immunoassay), pheromone-specific antibodies initially bound to the functionalized surface (due to the α-factor exposed by the hydrophobin layer) were competitively detached by soluble α-factor. In a second approach, the antibodies were first premixed with pheromone-containing samples and subsequently applied to functionalized surfaces, allowing for the attachment of antibodies that still carried available binding sites (inverse immunoassay). Both immunoassays enabled quantitative assessment of the yeast pheromone in a unique but partially overlapping dynamic range and allowed for facile tuning of the assay sensitivity by adjustment of the EAS-α content of the hydrophobin layer. With a limit of detection of 0.1 nM α-factor, the inverse immunoassay proved to be the most sensitive pheromone quantification assay currently available. Due to the high stability of hydrophobin monolayers, functionalized surfaces could be reused for multiple consecutive measurements. Favorably, both immunoassays proved to be largely robust against the changes in the sample matrix composition, allowing for pheromone quantification in complex sample matrices such as yeast culture supernatants. Hence, these immunoassays could also be applied to study the pheromone secretion of wild-type and engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Additionally, a proof-of-concept whole-cell sensor for thiamine was developed by combining the hydrophobin-based immunoassays with engineered sensor cells of Schizosaccharomyces pombe modulating the secretion of the α-factor pheromone in response to thiamine. Since this read-out strategy encompasses intrinsic signal amplification and enables flexible choice of the transducer element, it could contribute to the development of miniaturized, portable whole-cell sensors for on-site application.