Im Bereich der Biosensorik nehmen Sensoren auf der Grundlage lebender Zellen eine besondere Rolle ein: Mit ihrer Hilfe ist es möglich ohne großen technischen Aufwand die Bioverfügbarkeit eines spezifischen Analyten zu detektieren. Aufgrund ihrer Robustheit und der Einfachheit der Kultivierung eignet sich die Hefe S. cerevisiae in besonderem Maß zur Generierung von Ganzzellsensoren. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes dieses eukaryotischen Mikroorganismus ist die Möglichkeit der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf höhere Organismen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung hefebasierter Ganzzellsensoren für die Detektion von Essigsäure. Als Referenzanwendung diente der Biogasprozess, denn dort ist die Essigsäure sowohl ein Zwischenprodukt als auch ein Indikator für Prozessstörungen. Zur Optimierung der Produktion und einer besseren Steuerung von Biogasanlagen ist daher eine kontinuierliche Überwachung der Essigsäurekonzentration im Prozess sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit 5`-YGP1, 5`-TPO2 und 5`-YRO2 drei Essigsäure-spezifische Promotoren identifiziert werden. Durch Kopplung mit einem rot-fluoreszierenden Protein entstanden Reportergenkonstrukte, die in Hefezellen verbracht wurden. Entsprechende Transformanden wurden initital charakterisiert. Das Reportergenkonstrukt 5`-YGP1-tRFP erwies sich aufgrund der Stärke und des Verlaufs des Fluoreszenzsignals für die Generierung eines Ganzzellsensors als besonders geeignet. Die erzeugten rekombinanten Hefen fluoreszierten in Anwesenheit von Essigsäure abhängig von der eingesetzten Konzentration der Säure in einem Bereich von 1,5 bis 35 mM. Beispielsweise konnte bei Zugabe von 30 mM Essigsäure eine bis zu 20-fache Induktion der Fluoreszenzsignale beobachtet werden. Im weiteren Verlauf erfolgten unter anderem Analysen zur Regeneration des entwickelten hefebasierten Sensors. Die Regenerationszeit betrug ca. 8 h. Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Möglichkeit einer Mehrfachanwendung besteht. Zur Optimierung des Sensors wurde der Einsatz von Stämmen, bspw. mit der Deletion spezifischer Transporter zum Import von Essigsäure bzw. dem Export von Acetationen, untersucht. Hinsichtlich einer erhöhten Signalstärke oder kürzeren Reaktionszeit war jedoch kein Einfluss einer Deletion nachweisbar. Zur Untersuchung der Querempfindlichkeit wurden andere, ebenfalls im Biogasprozess vorkommende, flüchtige Fettsäuren getestet. Dabei konnte die Spezifität des entsprechenden Ganzzellsensors für die Essigsäure gezeigt werden. Testungen von Realproben aus dem Biogasprozess, die vom Projektpartner bereitgestellt worden waren, verliefen vielversprechend. Für den Einsatz von Ganzzellsensoren in der Praxis ist eine lange Standzeit von Vorteil. Aus diesem Grund wurde im weiteren Verlauf der Arbeit dazu übergegangen, Reportergenkonstrukte stabil im Genom der Hefe zu integrieren um die Langzeitstabilität dieser generierten Ganzzellsensoren zu untersuchen. Durch Paarung und Sporulation wurden Sporen erzeugt, aus denen nach der Lagerung über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten vegetative Hefezellen erfolgreich reaktiviert werden konnten. Dabei fluoreszierten die Ganzzellsensoren in Anwesenheit von Essigsäure mit der gleichen Stärke und Konzentrationsabhängigkeit wie zu Beginn der Lagerung. Durch den Einsatz des auf dem Hefe-Pheromonsystem basierenden Verstärkersystems für zelluläre Signale, welches bereits in der Arbeitsgruppe etabliert ist, konnte das nach der Integration abgeschwächte Fluoreszenzsignal erfolgreich 30 bis 40-fach amplifiziert werden.

Whole-cell sensors represent an emerging branch in biosensor development since they obviate the need for enzyme/antibody purification and provide the unique opportunity to assess global parameters such as genotoxicity and bioavailability. Yeast species such as Saccharomyces cerevisiae are ideal hosts for whole-cell sensor applications. However, current approaches almost exclusively rely on analyte-induced expression of fluorescent proteins or luciferases that imply issues with light scattering and/or require the supply of additional substrates. In this study, the yeast α-factor mating pheromone, a peptide pheromone involved in cell-cell communication in Saccharomyces cerevisiae, was utilized to create the whole-cell sensor read-out signal, in particular by employing engineered sensor cells that couple the response to a user-defined environmental signal to α-factor secretion. Two novel immunoassays - relying on hydrophobin-based surface engineering - were developed to quantify the α-factor. Hydrophobins are amphiphilic fungal proteins that self-assemble into robust monolayers at hydrophobic surfaces. Two recombinant hydrophobins, either lacking (EAS) or exposing the α-factor pheromone (EAS-α) upon self-assembly, were used to functionalize polystyrene supports. In a first approach (competitive immunoassay), pheromone-specific antibodies initially bound to the functionalized surface (due to the α-factor exposed by the hydrophobin layer) were competitively detached by soluble α-factor. In a second approach, the antibodies were first premixed with pheromone-containing samples and subsequently applied to functionalized surfaces, allowing for the attachment of antibodies that still carried available binding sites (inverse immunoassay). Both immunoassays enabled quantitative assessment of the yeast pheromone in a unique but partially overlapping dynamic range and allowed for facile tuning of the assay sensitivity by adjustment of the EAS-α content of the hydrophobin layer. With a limit of detection of 0.1 nM α-factor, the inverse immunoassay proved to be the most sensitive pheromone quantification assay currently available. Due to the high stability of hydrophobin monolayers, functionalized surfaces could be reused for multiple consecutive measurements. Favorably, both immunoassays proved to be largely robust against the changes in the sample matrix composition, allowing for pheromone quantification in complex sample matrices such as yeast culture supernatants. Hence, these immunoassays could also be applied to study the pheromone secretion of wild-type and engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Additionally, a proof-of-concept whole-cell sensor for thiamine was developed by combining the hydrophobin-based immunoassays with engineered sensor cells of Schizosaccharomyces pombe modulating the secretion of the α-factor pheromone in response to thiamine. Since this read-out strategy encompasses intrinsic signal amplification and enables flexible choice of the transducer element, it could contribute to the development of miniaturized, portable whole-cell sensors for on-site application.

Whole-cell sensors represent an emerging branch in biosensor development since they obviate the need for enzyme/antibody purification and provide the unique opportunity to assess global parameters such as genotoxicity and bioavailability. Yeast species such as Saccharomyces cerevisiae are ideal hosts for whole-cell sensor applications. However, current approaches almost exclusively rely on analyte-induced expression of fluorescent proteins or luciferases that imply issues with light scattering and/or require the supply of additional substrates. In this study, the yeast α-factor mating pheromone, a peptide pheromone involved in cell-cell communication in Saccharomyces cerevisiae, was utilized to create the whole-cell sensor read-out signal, in particular by employing engineered sensor cells that couple the response to a user-defined environmental signal to α-factor secretion. Two novel immunoassays - relying on hydrophobin-based surface engineering - were developed to quantify the α-factor. Hydrophobins are amphiphilic fungal proteins that self-assemble into robust monolayers at hydrophobic surfaces. Two recombinant hydrophobins, either lacking (EAS) or exposing the α-factor pheromone (EAS-α) upon self-assembly, were used to functionalize polystyrene supports. In a first approach (competitive immunoassay), pheromone-specific antibodies initially bound to the functionalized surface (due to the α-factor exposed by the hydrophobin layer) were competitively detached by soluble α-factor. In a second approach, the antibodies were first premixed with pheromone-containing samples and subsequently applied to functionalized surfaces, allowing for the attachment of antibodies that still carried available binding sites (inverse immunoassay). Both immunoassays enabled quantitative assessment of the yeast pheromone in a unique but partially overlapping dynamic range and allowed for facile tuning of the assay sensitivity by adjustment of the EAS-α content of the hydrophobin layer. With a limit of detection of 0.1 nM α-factor, the inverse immunoassay proved to be the most sensitive pheromone quantification assay currently available. Due to the high stability of hydrophobin monolayers, functionalized surfaces could be reused for multiple consecutive measurements. Favorably, both immunoassays proved to be largely robust against the changes in the sample matrix composition, allowing for pheromone quantification in complex sample matrices such as yeast culture supernatants. Hence, these immunoassays could also be applied to study the pheromone secretion of wild-type and engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Additionally, a proof-of-concept whole-cell sensor for thiamine was developed by combining the hydrophobin-based immunoassays with engineered sensor cells of Schizosaccharomyces pombe modulating the secretion of the α-factor pheromone in response to thiamine. Since this read-out strategy encompasses intrinsic signal amplification and enables flexible choice of the transducer element, it could contribute to the development of miniaturized, portable whole-cell sensors for on-site application.