In dieser Arbeit sollte eine Derivatisierungsmethode entwickelt werden, die die duale Quantifizierung funktioneller Gruppen an Oberflächen mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Fluoreszenz ermöglicht. Verschiedene Farbstoffe, die robuste Fluoreszenzeigenschaften mit hohen Fluorgehalten für XPS kombinieren, wurden auf ihre selektive Reaktion mit Aminogruppen getestet und der Prototyp einer tiefergehenden Analyse auf einer Oberfläche unterzogen. Durch Fluoreszenzlöschung konnten die Möglichkeiten der bimodalen Analyse nur begrenzt abgeschätzt werden, obwohl in XPS und Fluoreszenz intensive Signale gemessen wurden. Die Herstellung der Modelloberflächen mittels Gasphasenabscheidung von Silanen konnte durch Kontaktwinkelmessungen schrittweise optimiert werden. Die Kombination zweier Monoalkoxysilane ermöglichte die Herstellung von Oberflächen mit variabler Funktionalgruppendichte. Nach Reaktion mit dem dualen Marker ließen sich die Messungen aus XPS und Fluoreszenz mindestens über eine Größenordnung korrelieren. Durch Synchrotron-XPS (SR-XPS) und Röntgenfluoreszenz unter Totalreflektion (TXRF) konnte eine absolute und rückführbare Quantifizierung erzielt werden. Weitere Modelloberflächen auf Basis von Trialkoxysilanen zeigten, dass bei anwendungsnahen Proben Fluoreszenzlöschung auftritt. Diese konnte in einem gewissen Maße mittels Fluoreszenzlebensdauer berechnet werden. Darüberhinaus konnte mit der Photometrie eine unabhängige Methode gefunden werden, die die Quantifizierung des Farbstoffs an der Oberfläche in hoher Präzision ermöglicht und mit Hilfe der XPS auch der funtionellen Gruppen. Die Cavity Ring-Down Spektroskopie (CRDS) wurde als Laserbasierte Methode zur empfindlichen und ortsaufgelösten Messung der Absorption auf transparenten Substraten untersucht und erste vielversprechende Ergebnisse gewonnen. Weiterhin wurde ein modulares Farbstoffsystem entwickelt, das sowohl Variation der spektralen als auch der Bindungseigenschaften erlaubt. / This work aimed on the development of dual-mode labelling method that combines X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) with fluorescence measurements for surface functional group quantification. Label dyes combining robust fluorescence properties with high fluorine contents were investigated towards their selective reaction with surface amino groups and the lead candidate subjected to detailed analysis on a surface. Fluorescence quenching precluded a detailed investigation of the capabilities of dual-mode labelling, despite providing sufficient signal in XPS and fluorescence scanning. The fabrication of surfaces using vapour deposition (VD) of silanes in toluene was optimized under aid of contact angle measurements. Binary mixtures of mono-alkoxy silanes were used to prepare surfaces with variable functional group density. Treatment with the label dye showed that XPS and fluorescence provide a linear overlap in signal generation over at least one order of magnitude. The combination of synchrotron radiation XPS (SR-XPS) and total reflection X-ray fluorescence spectroscopy (TXRF) provided an absolute and traceable quantification . Different model surfaces based on trialkoxy silanes showed strong fluorescence quenching. A fluorescence lifetime based correction was developed to account for such quenching effects. Additionally, the application of spectrophotometry provided a independent method of quantification for the surface bound dye and in combination with information obtained from XPS, to determine the surface functional group density. With cavity ring-down spectroscopy (CRDS), a laser based technique for highly sensitive and spatially resolved absorption measurements on transparent substrates could be developed and applied in a proof-of-concept. A modular system for the fabrication of label dyes with adjustable spectral properties and different binding sites was investigated using prototype candidates to prove the general applicability of such systems.

Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fluoreszierende Sphingomyelin-Analoga zu Studium der sauren Sphingomyelinase (ASM) synthetisiert. Ausgehend von L-Serin wurde ein Sphingosin-Derivat mit natürlicher Stereochemie dargestellt. Anschließend wurde mittels Phosphorodichloridat-Chemie eine Aminoethylphosphat-Gruppe installiert. Zweifache Fluoreszenzmarkierung ergab Sonden mit der Fähigkeit zu Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Diese wurden als Substrate der ASM akzeptiert und erlaubten die Verfolgung der Enzymaktivität in vitro. Durch die Analyse der photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore wurde das allgemeine Konzept der Phasentrennungs-gestützten Signalverstärkung (PS) abgeleitet. Dieses Konzept wurde erfolgreich bestätigt durch die Synthese einer 30-mal leistungsfähigeren zweiten Generation der FRET-Sonde. Ein homogener Assay wurde entwickelt, der die Quantifizierung der ASM-Aktivität erlaubte. Unter Verwendung von gereinigter rekombinanter humaner ASM, HeLa-Zelllysaten oder Lysaten von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Enzymquelle wurde ausschließlich unter den von der ASM bevorzugten Bedingungen eine vollständige und spezifische Hydrolyse der Sonde beobachtet. Des Weiteren erlaubte die Sonde die Detektion relativer Unterschiede der Aktivität der ASM in kultivierten MEFs mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonenanregung (2PE). / Fluorescent sphingomyelin analogues have been synthesized to probe the acid sphingomyelinase (ASM). Starting from L-serine, a sphingosine with natural stereochemistry was synthesized. Subsequently, phosphorodichloridate chemistry was used to install an aminoethyl phosphate moiety. Dual fluorescent labeling afforded probes capable of Förster resonance energy transfer (FRET). They were recognized as substrates of ASM and allowed for monitoring of the enzyme’s activity in vitro. Through analysis of the fluorophores’ photophysical properties, the general concept of partition aided amplification of a FRET probe’s signal (PS) was developed. This concept was successfully confirmed by the synthesis of a second-generation probe with 30-fold improved response. A homogenous assay was developed, which allowed for a quantitation of ASM activity. Using either purified recombinant human ASM, or lysates of HeLa cells or mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as an enzyme source, complete and specific cleavage was observed exclusively under conditions preferred by ASM. Furthermore, the probe enabled the detection of relative levels of ASM activity in cultivated MEFs using fluorescence microscopy with two-photon excitation (2PE).

Aufkonversions-Nanokristalle (UCNC) zeichnen sich als einzigartige Lumineszenzreporter aus, die Nah-infrarotes Anregungslicht in Photonen höherer Energie umwandeln. Für die gezielte Anpassung von Eigenschaften, bedarf es ein tiefes Verständnis der Prozesse der Aufwärtskonversionslumineszenz (UCL) und deren Abhängigkeit von Material und Partikeldesign. Diese Doktorarbeit untersucht die UCL-Prozesse von Yb3+,Er3+ dotierten SrF2-UCNC und zielt darauf ab, die UCL-Eigenschaften der bisher unterschätzten kubischen Wirtsgitter zu verstehen und zu steigern. Hierbei wird die fluorolytische Sol-Gel-Synthese als neuartige Syntheseroute für UCNC vorgestellt. Vorteile wie ausgezeichnete Reproduzierbarkeit, viele Freiheitsgrade bei der Temperaturbehandlung und Partikelgestaltung werden anhand von SrF2 UCNC demonstriert. Die UCNC wurden mittels UCL-Spektren, UCL-Quantenausbeuten, leistungsdichte-abhängiger relativer spektraler Verteilung sowie der Lumineszenzabklingkinetiken unter Einbeziehung kristalliner Eigenschaften wie der Kristallphase, der Kristallitgröße, der Gitterparameter und der Teilchengröße untersucht. Die Abhängigkeit der UCL-Eigenschaften von der Dotierungsmenge wurde mit einer umfassenden Dotierungsreihe beschrieben und der optimale Dotierungsbereich (Yb3+,Er3+) von kleinen, ungeschalten SrF2-UCNC eingegrenzt. Bei der Studie dotierter Kerne mit passivierenden Schalen wurde der Einfluss von Temperaturbehandlung auf die UCL-Mechanismen und die Kern-Schale-Vermischung untersucht. Anhand von unterschiedlich kalzinierten UCNC Pulvern wurde die Empfindlichkeit der UCL gegenüber der Änderung kristalliner Eigenschaften, wie Kristallphase, Kristallinität, und Kristallitgröße betrachtet. Zusammen liefern die Dotierungs-, die Kern-Schale- und die Kalzinierungsstudie wertvolle Einblicke in das gitterspezifische Verhalten der UCL-Eigenschaften als Funktion der Energiemigration und der Kristalleigenschaften. / Upconversion nanocrystals (UCNC) represent a unique type of luminescence reporters that convert near-infrared excitation light into higher energy photons. Tailoring UCNC with specific luminescence properties requires an in-depth understanding of upconversion luminescence (UCL) processes and their dependence on material and particle design. This Ph.D. thesis focuses on the UCL processes of Yb3+,Er3+ doped SrF2-UCNC and aims to understand and enhance the UCL properties of the previously underestimated cubic host lattices. Herein, fluorolytic sol-gel synthesis is introduced as a novel synthetic route for UCNC. Advantages such as excellent reproducibility, high flexibility in temperature treatment and particle design are demonstrated using SrF2 UCNC. The UCNC were characterized by UCL spectra, UCL quantum yields, excitation power density-dependent relative spectral distribution, and luminescence decay kinetics involving crystalline properties such as crystal phase, crystallite size, lattice parameters, and particle size. The dependence of UCL properties on doping amount was described in a comprehensive doping study, and the optimal doping range (Yb3+,Er3+) of small, unshelled SrF2-UCNC was identified. In a core-shell study of doped core UCNC with passivating shells, the influence of temperature treatment on UCL mechanisms and core-shell mixing was investigated. Further, using different calcined UCNC powders, the sensitivity of UCL to the change of crystalline properties, such as crystal phase, crystallinity, and crystallite size, was assessed. Together, the doping, core-shell, and calcination studies provide valuable insight into the lattice-specific behavior of UCL properties as a function of energy migration and crystal properties.