Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen von Virulenz-assoziierten Genen in den Pathogenen Francisella novicida und Streptococcus pyogenes zu untersuchen. Kapitel eins befasst sich mit der Regulation des Virulenzfaktors Streptolysin S (SLS) von S. pyogenes. Wir untersuchten die Rolle der Ribonuklease (RNase) Y in der transkriptionellen und posttranstrikptionellen Regulation des Gens sagA. RNase Y begünstigte die Produktion einer kleinen RNA (sRNA) vom sagA Transkript, war jedoch nicht an der posttranskriptionellen Regulierung der sagA RNA beteiligt. Dennoch förderte RNase Y die Transkription von sagA indirekt. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die 5′- untranslatierte Region (UTR) der sgaA RNA eine Sekundärstruktur besitzt, die möglicherweise einen Liganden bindet und damit die Zugänglichkeit der ribosomalen Bindungsstelle beeinflusst. Die Deletion einzelner Abschnitte der 5′ UTR hat einen negativen Effekt auf die sagA Expression. Wir haben eine Methode entwickelt um die Aktivität von Riboswitches, (u.a. die sagA 5‘ UTR) zu analysieren und konnten damit drei putative Riboswitches in S. pyogenes validieren. In Kapitel zwei charakterisierten wir den Mechanismus mit dem CRISPR-Cas9 aus F. novicida (FnoCas9) die Expression bakterieller Lipoproteine (BLPs) unterdrückt, um dem Immunsystem des Wirtes zu entgehen. Wir zeigen, dass FnoCas9 eine duale Funktion besitzt, die es dem Protein ermöglicht nicht nur DNA zu schneiden, sondern auch Transkription zu regulieren. In dieser erstmals beschriebenen Aktivität bindet FnoCas9 an den tracrRNA:scaRNA Duplex, wodurch der Protein-RNA Komplex an einen DNA Abschnitt hinter dem Promoter der blp Gene bindet und somit deren Transkription verhindert. Diese Bindungsstelle besitzt ein protospacer-adjacent motif (PAM) und eine scaRNA-komplementäre Sequenz, an die der FnoCas9-RNA Komplex bindet, allerdings nicht schneidet. Dieses System könnte in Zukunft das Repertoire an CRISPR-basierten Anwendungsmöglichkeiten erweitern. / The aim of this thesis was to study regulatory mechanisms of virulence-related genes in the bacterial pathogens Francicella novicida and Streptococcus pyogenes. Chapter one focuses on the regulation of the virulence factor streptolysin S (SLS) in S. pyogenes. First, we investigated the role of the ribonuclease (RNase) Y in the transcriptional and post-transcriptional regulation of SLS-coding gene, sagA. We found that RNase Y promotes the production of a small RNA (sRNA) from the sagA transcript but we observed no regulation at the post-transcriptional level. Yet, RNase Y promotes sagA transcription indirectly and affects hemolysis levels. We next showed that the sagA 5′ untranslated region (UTR) contains a secondary structure that is is possibly modulated by direct binding to a ligand and may affect the accessibility to the ribosomal binding site (RBS). Our results indicate that removing fragments of the 5′ UTR has a negative effect on sagA expression. We developed a method for testing the activity of putative riboswitches, including sagA 5′ UTR. Using this method, we validated three predicted riboswitches in S. pyogenes. In chapter two, we characterized the mechanism by which F. novicida CRISPR-Cas9 (FnoCas9) represses the expression of bacterial lipoproteins (BLPs), allowing evasion of the host immune system. We show that FnoCas9 is a dual-function protein that, in addition to its canonical DNA nuclease activity, evolved the ability to regulate transcription. In this newly-described mechanism, the non-canonical RNA duplex tracrRNA:scaRNA guides FnoCas9 to the DNA target located downstream of the promoter of the BLP-coding genes, causing transcriptional interference. The endogenous targets contain a protospacer-adjacent motif (PAM) and a sequence that is complementary to scaRNA, promoting FnoCas9 binding but not DNA cleavage. Engineering this system expands the toolbox of CRISPR applications by allowing repressing other genes of interest.

Der Transkriptionsfaktor CEBPA reguliert Differenzierung und Proliferation in verschiedenen Zelltypen und spielt eine herausragende Rolle in der Hämatopoese. Die CEBPA RNA kann in die lange P42-Isoform oder die N-terminal verkürzte P30-Isoform translatiert werden. Während P42-CEBPA differenzierungsinduzierend wirkt, ist P30 als Inhibitor von P42 und als Onkogen in akuter myeloider Leukämie beschrieben. Die Modularität und Multifunktionalität von CEBPA, die ihn zahlreichen Studien beobachtet wurde, lässt sich möglicherweise durch differentielle Protein–Protein-Interaktionen erklären. Zahlreiche post-translationale Modifikationen (PTMs) und die intrinsisch ungeordnete, flexible Struktur von CEBPA stellen jedoch eine Herausforderung für traditionelle Ansätze in Proteininteraktionsstudien dar. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer, alternativer Ansatz präsentiert, der auf einem in vitro Proteininteraktions-screen auf einer Peptidmatrix (PRISMA) und Biotinligase proximity labelling (BioID) in lebenden Zellen basiert. In einem PRISMA-screen wurden 120 CEBPA Peptide auf Proteininteraktionen mit Proteinextrakt aus myeloiden Zellen untersucht. Im Screen wurden 40 verschiedene CEBPA PTMs inkludiert, unter anderem auch die hier erstmals neu beschriebenen Methylierungen der CEBPA Argininreste R12 und R142. Daten aus dem PRISMA-screen wurden mit BioID Experimenten in myeloiden Zellen validiert, um eine Proteininteraktionslandkarte von CEBPA zu generieren, die 52 bekannte und 68 neue CEBPA Proteininteraktoren umfasst. Hotspots für Proteininteraktionen fallen in evolutionär konservierte CEBPA Regionen und der Vergleich des Bindungsprofils mit publizierten Daten zeigt Ähnlichkeiten zu verwandten Transkriptionsfaktoren der CEBP Familie. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Multifunktionalität von CEBPA von multivalenten Proteininteraktionen in Abhängigkeit von PTMs koordiniert wird, um CEBPA mit dem epigenetischen und transkriptionellen Apparat der Zelle verknüpfen. / The pioneering transcription factor CEBPA plays a lineage-instructing role during haematopoiesis and also regulates proliferation and differentiation in many other cell types. The CEBPA RNA can be translated into a full length (P42-CEBPA) or N-terminally truncated isoform (P30-CEBPA). While P42 induces differentiation in various cell types, the P30 isoform is mostly regarded as a dominant inhibitor of P42-CEBPA and acts as an oncogene in acute myeloid leukaemia. Protein interactions may be the key to explaining the functional plasticity and modularity of CEBPA that has been demonstrated in diverse experimental settings. However, the disordered structure and the numerous post-translational modification sites (PTMs) of CEBPA pose a challenge to traditional protein interaction studies. In the present work, a novel alternative approach is presented that combines an in vitro protein interaction screen on a peptide matrix (PRISMA) with biotin ligase proximity labelling (BioID) in living cells. To this end, 120 CEBPA peptides were probed for protein interactions with PRISMA. The screen comprised 40 different PTMs, including newly identified CEBPA arginine methylation sites. PRISMA data was validated with BioID experiments and generated a detailed CEBPA protein interaction map in myeloid cells. The interactome presented here contains 52 known and 68 novel CEBPA interactors that can now be mapped across the CEBPA sequence in a PTM dependent fashion. Hotspots of protein interaction correlated with conserved regions and comparison with previously published data revealed related binding profiles of homologous CEBP regions. Taken together, the data indicates that the functional plasticity of CEBPs is orchestrated by multivalent protein interactions and PTMs to configure a dynamic CEBP hub that interacts with many partners of the transcriptional and epigenetic machinery.

Bakterien haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt, um sich an ständig wechselnde Umweltbedingungen anzupassen, darunter auch post-transkriptionelle regulatorische Mechanismen. Die Genexpression kann hierbei durch gezielten Abbau oder Stabilisierung von RNA durch Ribonukleasen (RNasen) reguliert werden. RNasen weisen je nach Spezies allerdings unterschiedliche Effekte auf Genexpression und bakterielle Physiologie, sowie verschiedene Strategien der Substraterkennung auf. Dies zeigt, dass unser Verständnis des RNA-Abbaus bei weitem nicht vollständig ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die Eigenschaften und Funktionen der endoRNase Y des humanpathogenen Bakteriums Streptococcus pyogenes zu studieren. Um Einblick in Funktion und Spezifität dieser RNase zu gewinnen, wurden deren genomweite Schnittpositionen (“targetome”) mit Hilfe von RNA-Sequenzierung identifiziert. Zur weiteren Analyse des RNase Y-abhängigen RNA-Abbaus wurde dieses Ergebnis mit dem “targetome” der drei 3′-5′-Exoribonukleasen (ExoRNasen) PNPase, YhaM und RNase R verglichen. Schließlich wurden die Anforderungen für die Prozessierung durch RNase Y und deren Rolle in der Regulation von Virulenzgenen in vivo anhand der speB mRNA, die einen wichtigen Virulenzfaktor codiert, untersucht. Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass RNase Y Substrate bevorzugt nach einem Guanosin schneidet und dieses Nukleosid essenziell für die Prozessierung der speB mRNA in vivo ist. Obwohl RNase Y die speB mRNA schneidet, unterstützen die Daten ein Modell nach dem RNase Y die Expression von speB auf transkriptioneller Ebene reguliert. Mit Hilfe des “targetome”-Vergleichs konnten wir ferner zeigen, dass RNase Y den RNA-Abbau in S. pyogenes initiiert und die dabei generierten 3′-Enden der RNA hauptsächlich von den 3′-5′-exoRNasen PNPase und/oder YhaM prozessiert werden. Zusammenfassend erweitern diese Erkenntnisse unser Verständnis der Funktionalität von RNase Y und des RNA-Abbaus in Gram-positiven Bakterien. / Bacteria have developed a plethora of strategies to cope with constantly changing environmental conditions, including post-transcriptional regulatory mechanisms. With this regard, regulation of gene expression can be achieved by either the rapid removal or stabilization of RNA molecules by ribonucleases (RNases). RNases exhibit species-specific effects on gene expression, bacterial physiology and different strategies of target recognition, indicating that our understanding of the RNA degradation machinery is not yet complete. The aim of this thesis was to investigate the features and functions of endoRNase Y from the strict human pathogen Streptococcus pyogenes. To gain insight into the role and specificity of this RNase, we identified RNase Y cleavage positions (i.e. targetome) genome-wide by RNA sequencing. Next, to investigate the RNA degradation pathway depending on RNase Y, we compared the RNase Y targetome with the ones of the three 3′-to-5′ exoribonuclease (exoRNases), namely PNPase, YhaM and RNase R. Finally, to dissect the requirements for RNase Y processing and to decipher the role of RNase Y in virulence gene regulation, we studied the impact of RNase Y on speB mRNA, encoding a major virulence factor. This study reveals that RNase Y preferentially cleaves RNAs downstream of a guanosine and for the first time we were able to show that the presence of a guanosine residue is essential for the processing of speB mRNA, in vivo. Although RNase Y cleaves the speB mRNA, our data underpin a model in which RNase Y-mediated regulation of speB expression occurs at the transcriptional level. Using the targetome comparative approach, we demonstrated that RNase Y initiates RNA decay in S. pyogenes and that the RNase Y-generated RNA 3′ ends are usually further trimmed by PNPase and/or YhaM. Overall, these findings increase our understanding of RNase Y functionality and RNA degradation in Gram-positive bacteria.

Die hoch abundante sRNA 6S RNA reguliert in Prokaryoten durch Bildung eines stabilen Riboproteinkomplexes mit der RNA Polymerase maßgeblich die globale Genexpression zur Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde die regulative Funktion von 6S RNA in Cyanobakterien am Beispiel des Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 beleuchtet. Die Analysen zeigten, dass die 6S RNA-Transkriptmenge sowohl unter phototrophen als auch unter photoheterotrophen Bedingungen in der stationären Wachstumsphase abnahm. Zudem wurden physiologische Untersuchungen einer 6S RNA-Deletionsmutante (delta_ssaA) und einer Überexpressionsmutante unter diversen Stressbedingungen durchgeführt. Während für delta_ssaA eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress gemessen wurde, war die Thermotoleranz in den Mutanten nicht beeinträchtigt. Ferner wurde für delta_ssaA eine verlangsamte Regeneration nach Stickstoffmangel ermittelt, die sich phänotypisch durch eine verzögerte Reassemblierung der Phycobilisomen und des Glykogenabbaus sowie durch eine verminderte photosynthetische Aktivität äußerte. Vergleichende Microarray-Analysen zeigten, dass sich die Genexpression in delta_ssaA unter Stickstoffmangel kaum vom Wildtyp unterschied. Hingegen waren während der Regeneration Gene kodierend für die ATP-Synthase, ribosomale Proteine, Photosynthese-Komplexe und Phycobilisomen in delta_ssaA signifikant negativ exprimiert. Zudem wurde eine charakteristische Expressionskinetik für die sRNA SyR11 ermittelt. In vivo-pulldown-Analysen der RNA Polymerase zeigten, dass 6S RNA während der Regeneration die Rekrutierung des Hauptsigmafaktors SigA begünstigt und die Dissoziation von Sigmafaktoren der Gruppe 2 beschleunigt. Derweil blieb das 6S RNA-Transkriptlevel unter Stickstoffstress nahezu konstant. Ein Nachweis von in vivo-synthetisierten pRNA-Transkripten blieb negativ. Die Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der funktionellen Bedeutung von 6S RNA für die Adaptation an Stressbedingungen in Cyanobakterien diskutiert. / The highly abundant sRNA 6S RNA extensively regulates the global gene expression for adaptation to changing environmental conditions in many prokaryotes by forming stable complexes with the RNA polymerase. In this work, Synechocystis sp. PCC 6803 was used as a model organism to study the regulative function of 6S RNA in cyanobacteria. A decline in 6S RNA transcript levels during stationary phase was measured under phototrophic and photoheterotrophic conditions. Physiological studies were carried out under various stress conditions using a 6S RNA deletion mutant (delta_ssaA) and an overexpression mutant. Delta_ssaA exhibited increased sensitivity toward oxidative stress, whereas the thermo-tolerance of the cells was not affected in the mutant strains. The recovery from nitrogen depletion was considerably delayed in delta_ssaA compared to the wild type. This phenotype was physiologically characterized by a decelerated phycobilisome reassembly and glycogen degradation as well as reduced photosynthetic activity in delta_ssaA. Comparative transcriptome analysis verified these observations. While under nitrogen depletion similar gene expression patterns were measured in delta_ssaA and wild type, genes encoding ATP synthase, ribosomal proteins, photosystem components and phycobilisomes were significantly negatively affected in the mutant strain during recovery. Furthermore, a distinctive accumulation kinetics was found for the sRNA SyR11. In vivo pulldown analyses of the RNA polymerase revealed a promoting effect of 6S RNA on the recruitment of the housekeeping sigma factor SigA as well as on the complex dissociation of group 2 sigma factors. Meanwhile, the 6S RNA transcript level remained nearly constant during nitrogen deficiency and the detection of in vivo synthesized pRNA transcripts was negative. The results are discussed regarding the functional role of 6S RNA for the adaptation to stress conditions in cyanobacteria.

RNA-Bindungsproteine spielen Schlüsselfunktionen bei der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression. Durch Bindung an RNA steuern sie die RNA-Aufbereitung, den Transport, die Stabilität und die Translation. In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung bakterieller post-transkriptioneller Mechanismen erzielt. Es wird immer deutlicher, dass diese Regulierungsebene auch bei der Pathogenese und Antibiotikaresistenz eine wichtige Rolle spielt. Die Analyse von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) auf Proteomebene wurde durch die (m)RNA-interactome-capture Technologie vorangetrieben, die den Teil des Proteoms isoliert, welcher mit polyadenylierter (m)RNA vernetzt ist. Dies hat zur Identifizierung von Hunderten von neuen RBPs in einer Vielzahl von eukaryontischen Arten, vom Menschen bis zur Hefe, geführt. Allerdings fehlt die Poly-Adenylierung in der funktionellen RNA von Bakterien und anderen Klassen von -eukaryontischen- regulatorischen RNAs. Ziel dieser Arbeit war es, diese Einschränkung durch die Entwicklung einer neuartigen und unvoreingenommenen Methode zur Aufreinigung von UV-vernetzten RNPs in lebenden Zellen zu überwinden: PTex (Phenol-Toluol-Extraktion). Das Reinigungsprinzip basiert ausschließlich auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften von vernetzten RNPs gegenüber ungebundenen Proteinen oder RNA; es ist dabei unparteiisch gegenüber spezifischen RNAs oder Proteinen und ermöglicht somit erstmals eine systemweite Analyse von nicht-poly-(A)-RNA-interagierenden Proteinen sowohl in eukaryontischen (HEK293) als auch in prokaryontischen (Salmonella Typhimurium) Zellen. / RNA binding proteins play key functions in post-transcriptional regulation of gene expression. By binding to RNA, they control RNA editing, transport, stability and translation. In the last decade, significant advances have been made in the elucidation of bacterial post-transcriptional mechanisms. It is becoming increasingly clear that this layer of regulation also plays an important role in pathogenesis and antibiotic resistance. The analysis of RNA-protein complexes (RNPs) at the proteome level has been driven by the (m)RNA interactome capture technology which isolates the proteome cross-linked to poly-adenylated (m)RNA. This has resulted in the identification of hundreds of novel RBPs in a diversity of eukaryotic species ranging from humans to yeast. However, poly-adenylation is absent in functional RNA from bacteria and other classes of -eukaryotic- regulatory RNAs. This work was aimed to overcome that limitation by developing a novel and unbiased method for the purification of UV-cross-linked RNPs in living cells: PTex (Phenol Toluol extraction). The purification principle is solely based on physicochemical properties of cross-linked RNPs versus unbound proteins or RNA, and it is impartial towards specific RNA or proteins; enabling for the first time a system-wide analysis of non-poly(A) RNA interacting proteins in both eukaryotic (HEK293) and prokaryotic (Salmonella Typhimurium) cells.

Die Genexpression wurde bisher hauptsächlich auf Transkriptions- und Proteinebene untersucht, wobei der Einfluss der Translation, die die Proteinhäufigkeit direkt beeinflusst, weitgehend außer Acht gelassen wurde. Um diese Rolle besser zu verstehen, habe ich Ribosomen-Profiling-Daten (Ribo-seq) verwendet, um die Translationsregulation zu untersuchen und neue Translationsvorgänge in 65 linksventrikulären Proben von DCM-Patienten im Endstadium und 15 Nicht-DCM-Kontrollen zu identifizieren. Dieser Datensatz half dabei, die Transkriptions- und Translationsregulation zwischen erkrankten und nicht betroffenen menschlichen Herzen zu sezieren und enthüllte Gene und Prozesse, die rein unter Translationskontrolle stehen. Darüber hinaus habe ich neue kardiale Proteine vorhergesagt, die von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) und zirkulären RNAs (circRNAs) translatiert werden. Computergestützte Analysen dieser evolutionär jungen Proteine legten eine Beteiligung an verschiedenen molekularen Prozessen nahe, mit einer besonderen Anreicherung für den mitochondrialen Energiestoffwechsel. Schließlich identifizierte ich RNA-bindende Proteine (RBPs), deren Expression die Menge der Ziel-mRNA oder die Frequenz der Translationseffizienz (TE) beeinflusst. Für eine Untergruppe von 21 RBPs habe ich die Regulation auf beiden quantitativen Merkmalen beobachtet, was zu einer unterschiedlichen mechanistischen Basis der Expressionskontrolle für unabhängige Gensätze führte. Obwohl die genaue Umschaltung der RBP-Funktion wahrscheinlich durch eine Kombination von mehreren Faktoren erreicht wird, haben wir für drei Kandidaten eine starke Abhängigkeit von der Zielgenlänge und der 5'-UTR-Struktur beobachtet. Diese Arbeit präsentiert einen Katalog von neu identifizierten Translationsereignissen und einen quantitativen Ansatz zur Untersuchung der Translationsregulation im gesunden und kranken menschlichen Herzen. / Gene expression has primarily been studied on transcriptional and protein levels, largely disregarding the extent of translational regulation that directly influences protein abundance. To elucidate its role, I used ribosome profiling (Ribo-seq) data, obtained through ribosome profiling, to study translational regulation and identify novel translation events in 65 left ventricular samples of end-stage DCM patients and 15 non-DCM controls. This dataset helped dissect transcriptional and translational regulation between diseased and unaffected human hearts, revealing genes and processes purely under translational control. These would have remained undetected by only looking at the transcriptional level. Furthermore, I predicted novel cardiac proteins translated from long non-coding RNAs (lncRNAs) and circRNAs. Computational analysis of these evolutionary young proteins suggested involvement in diverse molecular processes with a particular enrichment for mitochondrial processes. Finally, I identified RNA-binding proteins (RBPs) whose expression influences target mRNA abundance or translational efficiency (TE) rates. For a subset of 21 RBPs, I have observed regulation on both quantitative traits, which resulted in different mechanistic basis expression control for independent sets of genes. Though the precise switch in RBP function is likely achieved by a combination of multiple factors, for three candidates we have observed a strong dependency on target length and 5’ UTR structure. This work presents a catalogue of newly identified translation events and a quantitative approach to study translational regulation in the healthy and failing human heart.