Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen von Virulenz-assoziierten Genen in den Pathogenen Francisella novicida und Streptococcus pyogenes zu untersuchen. Kapitel eins befasst sich mit der Regulation des Virulenzfaktors Streptolysin S (SLS) von S. pyogenes. Wir untersuchten die Rolle der Ribonuklease (RNase) Y in der transkriptionellen und posttranstrikptionellen Regulation des Gens sagA. RNase Y begünstigte die Produktion einer kleinen RNA (sRNA) vom sagA Transkript, war jedoch nicht an der posttranskriptionellen Regulierung der sagA RNA beteiligt. Dennoch förderte RNase Y die Transkription von sagA indirekt. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die 5′- untranslatierte Region (UTR) der sgaA RNA eine Sekundärstruktur besitzt, die möglicherweise einen Liganden bindet und damit die Zugänglichkeit der ribosomalen Bindungsstelle beeinflusst. Die Deletion einzelner Abschnitte der 5′ UTR hat einen negativen Effekt auf die sagA Expression. Wir haben eine Methode entwickelt um die Aktivität von Riboswitches, (u.a. die sagA 5‘ UTR) zu analysieren und konnten damit drei putative Riboswitches in S. pyogenes validieren. In Kapitel zwei charakterisierten wir den Mechanismus mit dem CRISPR-Cas9 aus F. novicida (FnoCas9) die Expression bakterieller Lipoproteine (BLPs) unterdrückt, um dem Immunsystem des Wirtes zu entgehen. Wir zeigen, dass FnoCas9 eine duale Funktion besitzt, die es dem Protein ermöglicht nicht nur DNA zu schneiden, sondern auch Transkription zu regulieren. In dieser erstmals beschriebenen Aktivität bindet FnoCas9 an den tracrRNA:scaRNA Duplex, wodurch der Protein-RNA Komplex an einen DNA Abschnitt hinter dem Promoter der blp Gene bindet und somit deren Transkription verhindert. Diese Bindungsstelle besitzt ein protospacer-adjacent motif (PAM) und eine scaRNA-komplementäre Sequenz, an die der FnoCas9-RNA Komplex bindet, allerdings nicht schneidet. Dieses System könnte in Zukunft das Repertoire an CRISPR-basierten Anwendungsmöglichkeiten erweitern. / The aim of this thesis was to study regulatory mechanisms of virulence-related genes in the bacterial pathogens Francicella novicida and Streptococcus pyogenes. Chapter one focuses on the regulation of the virulence factor streptolysin S (SLS) in S. pyogenes. First, we investigated the role of the ribonuclease (RNase) Y in the transcriptional and post-transcriptional regulation of SLS-coding gene, sagA. We found that RNase Y promotes the production of a small RNA (sRNA) from the sagA transcript but we observed no regulation at the post-transcriptional level. Yet, RNase Y promotes sagA transcription indirectly and affects hemolysis levels. We next showed that the sagA 5′ untranslated region (UTR) contains a secondary structure that is is possibly modulated by direct binding to a ligand and may affect the accessibility to the ribosomal binding site (RBS). Our results indicate that removing fragments of the 5′ UTR has a negative effect on sagA expression. We developed a method for testing the activity of putative riboswitches, including sagA 5′ UTR. Using this method, we validated three predicted riboswitches in S. pyogenes. In chapter two, we characterized the mechanism by which F. novicida CRISPR-Cas9 (FnoCas9) represses the expression of bacterial lipoproteins (BLPs), allowing evasion of the host immune system. We show that FnoCas9 is a dual-function protein that, in addition to its canonical DNA nuclease activity, evolved the ability to regulate transcription. In this newly-described mechanism, the non-canonical RNA duplex tracrRNA:scaRNA guides FnoCas9 to the DNA target located downstream of the promoter of the BLP-coding genes, causing transcriptional interference. The endogenous targets contain a protospacer-adjacent motif (PAM) and a sequence that is complementary to scaRNA, promoting FnoCas9 binding but not DNA cleavage. Engineering this system expands the toolbox of CRISPR applications by allowing repressing other genes of interest.

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein grampositives Bodenbakterium. Es kann in der Rhizosphäre das Wachstum von Pflanzen fördern und durch die Produktion von Sekundärmetaboliten phytopathogene Organismen hemmen. Aus der Genomanalyse und den dazugehörigen Arbeiten war bekannt, dass Bacillus amyloliquefaciens FZB42 nicht-ribosomal je drei antimikrobielle Polyketide und Lipopeptide herstellt, sowie zwei Siderophore und das Dipeptid Bacilysin. Für Bacillus typische Lantibiotika oder große Bacteriocine wurden nicht gefunden. In dieser Arbeit wird erstmalig gezeigt, dass Bacillus amyloliquefaciens FZB42 auf ribosomale Weise antibakterielle Peptide herstellt. Zwei bisher unbekannte Bacteriocine, Amylocyclicin A und Plantazolicin, und deren dazugehörigen Gencluster konnten identifiziert und charakterisiert werden. Amylocyclicin A ist ein unmodifiziertes Peptid, dessen N- und C-Terminus kovalent verbunden sind. Es wurde der Gruppe I der zirkulären Bacteriocine zugeordnet, dessen Mitglieder sich durch schwache Homologie untereinander, aber durch wahrscheinlich ähnliche 3D-Strukturen auszeichnen. Die Masse beträgt 6381 Da und die Substanz ist stark aktiv gegen grampositive Bakterien. Das Biosynthesecluster umfasst sechs Gene für die Synthese, den Export, die Zyklisierung und die Immunität. Plantazolicin ist ein hydrophobes, stark modifiziertes Peptid aus der TOMM-Gruppe, einer Gruppe aus Microcin B17-ähnlichen Peptiden, die nach neueren Erkenntnissen verbreiteter ist, als bisher bekannt. Plantazolicin ist schwach aktiv gegen grampositive Bakterien und besitzt die Masse 1335 Da. Das Biosynthesecluster umfasst zwölf Gene, mit allen nötigen Genen für Synthese, Modifikation, Regulation, Immunität und Export. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is a Gram-positive, plant-associated bacterium, which stimulates plant growth and produces secondary metabolites that suppress soil-borne plant pathogens. Five gene clusters direct the non-ribosomal synthesis of the cyclic lipopeptides surfactin, bacillomycin, fengycin, an unknown peptide and the iron-siderophore bacillibactin. Three gene clusters direct the non-ribosomal synthesis of the antibacterial acting polyketides macrolactin, bacillaene and difficidin; in addition to the non-ribosomal synthesis of the antibacterial dipeptide bacilysin. Genes involved in ribosome-dependent synthesis of lantibiotics and other peptides are scarce. Only two incomplete gene clusters directing immunity against mersacidin and subtilin were found. In this work two ribosomally synthesized antibacterial peptides, amylocyclicin A and plantazolicin, and their corresponding gene clusters were identified. Amylocyclicin A is a circular peptide with a mass of 6381 Da and strong activity against Gram-positive bacteria. Six genes are responsible for the synthesis, maturation, export and immunity of this peptide belonging to group I of circular bacteriocins. Plantazolicin is a strongly modified hydrophobic peptide bearing a molecular mass of 1,335 Da and displaying antibacterial activity toward closely related Gram-positive bacteria. Essential modification contains the incorporation of azole heterocycles, which derive from Cys, Ser, and Thr residues of the precursor peptide and addition of two methyl groups. Twelve genes are responsible for synthesis, modification, export and immunity of this peptide belonging to the TOMM group of thiazol/oxazol modified microcins.