Myosin II, das Motorprotein des kardialen Muskels, besteht aus zwei schweren und vier leichten Ketten. Der Hebelarmbereich der schweren Myosinkette (MyHC) enthält das IQ-Konsensus-Motiv für die Bindung der essentiellen leichten Myosinkette (ELC), welche wesentlich für eine normale Kraftentwicklung des Myosinmoleküls ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf, mit hypertropher Kardiomyopathie assoziierte, Mutationen im humanen essentiellen ventrikulären leichten Myosinketten (hVLC1)-Gen (MYL3) untersucht (E56G, A57G, E143K, M149V, R154H). Von keiner dieser Mutationen war der Pathomechanismus bekannt. Ziel der Arbeit war es, die Effekte der Mutationen im MYL3-Gen auf Proteinstruktur und Funktion zu untersuchen und daraufhin einen möglichen Pathomechanismus zu formulieren. Dazu erfolgten Strukturanalysen (CD-Spektren, Schmelzkurven, FLIM), Versuche auf Protein- und Zellebene (Protein-Protein-Interaktionsstudien, Sorting Assay) sowie Untersuchungen in vitro (Zell-Verkürzungsmessungen, isoliert perfundierte Herzen nach Langendorff) und in vivo (Echokardiographie) im transgenen Mausmodell. / Myosin II, the motor protein of cardiac muscle, is composed of two heavy chains (MyHC) and four non-covalently linked light chains (MLC). The lever arm of the MyHC contains the IQ motif that binds the essential myosin light chain (ELC), which is necessary for the normal force production of the myosin molecule. Five with HCM associated mutations in the human ventricular essential myosin light chain (hVLC1) -gen (MYL3) were investigated in this study (E56G, A57G, E143K, M149V, R154H). The pathomechanisms of the mutations were not known. Aim of the study was i) to test the hypothesis that mutations in the ventricular essential myosin light chain affect the protein structure, the binding to the IQ motif of MyHC and the force production of the myosin molecule as well as ii) to postulate an accompanying pathomechanism. Structural analyses (circular dichroism, melting curves, fluorescence lifetime imaging microscopy), functional investigations (surface plasmon resonance spectroscopy, sorting assay) and in vivo (echocardiography) and in vitro studies in a transgenic mouse model were performed.

Die Atmung und das Herz-Kreislauf-System interagieren als zwei in Reihe angeordnete funktionelle Einheiten. Die gleichsinnige Kontrolle beider Systeme bildet die Grundlage homöostatischer Bedingungen im Organismus. Neurophysiologische Studien geben Hinweise auf die Existenz eines gemeinsamen neuronalen kardiorespiratorischen Netzwerkes, welches im ventrolateralen Teil der Medulla oblongata gelegen ist. Da zentrale Mechanismen der Regulation einer direkten Untersuchung nicht zugänglich sind, erweisen sich die linearen und nichtlinearen Verfahren der Zeitreihenanalyse als hilfreich, um Erkenntnisse von der Arbeitsweise des kardiorespiratorischen Kontrollsystems zu gewinnen. Grundlage der Studie bildet eine Datenbank polygraphischer Messungen (einschließlich EKG, thorakales und abdominales Respirogramm, Elektrookulogramm und Aktogramm), die an 42 gesunden Kindern, 11 Mädchen und 31 Knaben im Alter von 12 bis 15 Jahren erhoben wurde. Die Messungen erfolgten über 24 Stunden hinweg, während folgender Vigilanzstadien: ruhiger Wachzustand, REM- und nonREM-Schlaf. Die spektralen Charakteristika der Herzfrequenzvariabilität wurden berechnet, um die sympatho-vagale Einflußnahme auf den Nodus sinusoidalis kennzeichnen zu können. Die lineare Intensität der kardiorespiratorischen Beziehung wurde aus den Kohärenzspektren abgeleitet. Um nichtlineares Verhalten erfassen zu können, wurden der größte Lyapunov-Exponent und die Korrelationsdimension der Herzfrequenz, sowie die Korrelationsdimension des Atemsignals bestimmt. Die Analyse der Herzfrequenzvariabilität ergab für die Gesamtleistung die höchsten Werte innerhalb der REM-Phasen, im Wachzustand lagen diese deutlich niedriger und während des nonREM-Schlafes waren sie am kleinsten. Dieses Verhalten wurde im wesentlichen bestimmt von Änderungen der Spektralleistung im niederfrequenten Bereich. Die Komplexität der Herzfrequenz, die sich mit der Korrelationsdimension schätzen läßt, zeigte eine deutliche Abnahme im Schlaf. Dagegen erwies sich der Lyapunov-Exponent als weniger sensitiv bezüglich der Vigilanz. Die kardiorespiratorische Kohärenz ließ eine strenge Abhängigkeit vom Vigilanzstadium erkennen mit hohen Werten im nonREM-Schlaf und dem Minimum innerhalb der REM-Phasen. Im Gegensatz zur Komplexität der Herzfrequenz erreichte die Komplexität der Atmung die niedrigsten Werte in den REM-Phasen. Mit den Ergebnissen der Spektralanalyse lassen sich vigilanzstadienspezifische Einstellungen in der vegetativen Kontrolle der Herzfrequenz abgrenzen. Die nichtlinearen Verfahren offenbaren niederdimensionale deterministisch-chaotische Strukturen der Herzfrequenz. Die Zahl unabhängiger Mechanismen, die Anteil an der kardiorespiratorischen Regulation haben, ist im Wachzustand am größten. Diese Änderungen lassen das Gesamtsystem in Abhängigkeit von der Vigilanz verschiedene Arbeitspunkte einnehmen. / Breathing and blood flow interact as two, in series coupled units. To adapt heart beat and oxygen supply, a common coordination is required. Concluded from neurophysiological investigations, there is evidence for the existence of one cardiorespiratory network located in the ventrolateral part of the medulla. Since the physiological mechanisms inside the complex regulatory network are not readily accessible, linear and non-linear methods of time series analysis are a useful approach to investigate cardiorespiratory control. To study normal regulation, 42 healthy children, 11 girls and 31 boys (12-15 yr.), were investigated throughout 24 hours under different states of vigilance: wakefulness at rest, REM, and nonREM-sleep. All participants underwent polygraphic measurements, including ECG, thoracic and abdominal respirograms, electrooculogram, and actogram. To estimate the sympatho-vagal drive to the sinus node, the parameters of heart rate power spectra were calculated. The linear intensity of cardiorespiratory coupling was concluded from the coherence spectra. As to non-linear properties of heart rate, the largest Lyapunov exponents as well as the correlation dimension were determined. Similarly, the correlation dimension of the respiratory signals was evaluated. The total power of the heart rate spectrum was found to be greatest during REM, it decreased during wakefulness and was low in nonREM-sleep. These variations are mainly accounted for by low frequency power. The "complexity" of heart rate, as indicated by the correlation dimension, is diminished during sleep phases, whereas the Lyapunov exponents are less affected. The cardiorespiratory coherence is strongly modulated by vigilance with an increase during nonREM and lowest values during REM. The complexity of respiration was also affected by vigilance. A different behavior of heart rate complexity was found during REM-phases. Concluded from spectral analysis, a specific setting of autonomic heart rate regulation for each vigilance stage can be suggested. A low dimensional deterministic chaos is present in heart rate time series. More independent control loops were found to be active during wakefulness. Revealed by parameters of the non-linear dynamics, different stages of vigilance determine different operating points in the cardiorespiratory coordination.

Die Zebrafischmutation heart and mind (had), welche die alpha1B1-Untereinheit der Na+,K+ ATPase betrifft, verzögert die Streckung des Herzschlauches und führt zu weiteren Entwicklungsanomalien, die an andere Zellpolaritätsmutanten wie nagie oko (nok) und heart and soul (has) erinnern. In dieser Arbeit habe ich die Funktion und Regulation von Had/Na+,K+ ATPase während der Herzmorphogenese des Zebrafisches und seine möglichen Interaktionen mit Has/Prkci und Nok/Mpp5 untersucht. In konnte nachweisen, dass genetische Interaktionen zwischen had und nok in der Aufrechterhaltung von Zonula-Occludens-1-(ZO-1)-positiven Adhäsionsbändern Adhäsionsbändern in myokardialen Zellen während der Herzentwicklung nachweisen. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen Nok/Mpp5 und Had/Na+,K+ ATPase zur Aufrechterhaltung der myokardialen ZO-1-Adhäsionsbändern die Funktion der Na-Pumpe erfordert und dass die korrekte Ionengradienten zur Aufrechterhaltung der myokardialen Integrität beiträgt. Meine Ergebnisse zeigen eine Phosphorylierung des N-terminalen Endes von Had/ Na+,K+ ATPase durch PKCs. PKCs wurden bereits mit der Regulation der Na-Pumpen-Funktion durch Phosphorylierung von N-terminalen Resten in Verbindung gebracht. Meine Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass dieser Mechanismus im Zebrafisch konserviert ist. Die Analyse der subzelluläre Lokalisation einer Phosphorylierungs-defizienten Form von Had/Na+,K+ ATPase legt nahe, dass während Herzschlauch-elongation die Had/Na+,K+ ATPase-Aktivität an der Zellmembran durch die Phosphorylierung an einer amino-terminalen Amino-säure reguliert wird. Frühere Studien legen nahe, dass die Herzmorphogenese durch direkte Phosphorylierung von Has/Prkci-Zielen gesteuert wird. Die Identifikation von Has/Prkci-Phosphorylierungs-Zielen könnte dazu beitragen, Herzmorphogenese besser zu verstehen. Aus diesem Grund wurde ein chemisch-genetischer Ansatz entwickelt, um direkte Phosphorylierungs-Ziele von Has/Prkci zu identifizieren. / The zebrafish heart and mind (had) mutation which disrupts the alpha1B1 subunit of Na+,K+ ATPase causes heart tube elongation defects and other developmental abnormalities that are reminiscent of several epithelial cell polarity mutants including nagie oko (nok) and heart and soul (has). In this work, I investigated the function and regulatory mechanisms of Had/Na+,K+ ATPase during zebrafish cardiac morphogenesis, as well as its´ possible interactions with Has/Prkci and Nok/Mpp5. In this study, I demonstrate genetic interactions between had and nok in maintaining Zonula occludens-1 (ZO-1) positive junction belts within myocardial cells during heart development. My results strongly suggest that the interaction between Nok/Mpp5 and Had/Na+,K+ ATPase in the maintenance of myocardial ZO-1 junction belts requires the Na pump function and that the correct ionic balance contributes to the maintenance of myocardial integrity. My results show phosphorylation of the N-terminal intracellular tail of Had/Na+,K+ ATPase by PKCs. PKCs have previously been implicated in the regulation of the Na pump function via phosphorylation of N-terminal residues. Therefore, my results raise the possibility that this mechanism is conserved in the zebrafish embryo. The analysis of the subcellular distribution of a phosphorylation-deficient form of Had/Na+,K+ ATPase suggests that, during heart tube elongation, Had/Na+,K+ ATPase activity is regulated at the membrane via phosphorylation at an amino-terminal site. Previous studies suggest that heart morphogenesis is driven via direct phosphorylation of Has/Prkci targets. Therefore, identification of Has/Prkci phosphorylation targets would contribute to better understand cardiac morphogenesis. For this purpose, a chemical genetic approach was designed to identify Has/Prcki direct phosphorylation targets.

In dieser Studie sind die Massenvolumina und die Innenvolumina rechter und linker Ventrikel von 36 Patienten (15 Frauen und 21 Männer, im Alter zwischen 24 und 82 Jahren, mittleres Alter 54 Jahre) mittels transösophagealer Echokardiographie (TEE, HP SONOS 1500 mit einen rotierenden 5Mhz Schallkopf) und Magnetresonanztomographie (MRT, 1,5T Ganzkörper-MRT - ACS, Philips. T1-gewichtete Turbo-Gradientenecho-Sequenz) untersucht worden. Ziel ist es beide Untersuchungsmethoden auf Übereinstimmungen und Unterschiede bei Messung von Massenvolumina und Innenvolumina beider Ventrikel unter Berücksichtigung von Sinusrhythmus (26 Ventrikel) und Vorhofflimmern (18 Ventrikel) zu überprüfen. Dabei werden sowohl die Innenvolumina, die freien Wände und die Septen jeweils in der Enddiastole und in der Endsystole verglichen als auch die abgeleiteten Parameter, Ejektionsfraktionen und Schlagvolumina. Beide Methoden werden mit der Scheibchen-Summationsmethode aus jeweils vier Einzelmessungen verglichen. Die graphische und statistische Auswertung erfolgt mittels Bland-Altmann-Plot. Im T-Test für unverbundene Stichproben stellt sich kein signifikanter Unterschied zwischen linken und rechten sowie zwischen großen und kleinen Ventrikeln heraus. Es besteht ein signifikanter Unterschied zwischen Ventrikeln mit Vorhofflimmern und Sinusrhythmus, so dass wir hier einen Vergleich aufstellen. Die enddiastolischen Messungen der Innenvolumina und freien Wände zeigen deutliche Diskrepanzen der Ventrikel mit Sinusrhythmus und Vorhofflimmern - um etwa das Doppelte der Standardabweichung und des systematischen Fehlers. Die enddiastolischen Septen sind annährend gleich gut dargestellt. In der Endsystole liefern die Messungen der Innenvolumina, der freien Wände und der Septen annähernd gleiche Ergebnisse wie in der Enddiastole. Die errechneten Ejektionsfraktionen haben sowohl bei Sinusrhythmus als auch bei Vorhofflimmern gleich gut Standardabweichungen und systematische Fehler. Ähnlich verhält es sich bei den Daten der Schlagvolumina. Absolut betrachtet liefern beide volumetrischen Messmethoden bei Ventrikeln mit Sinusrhythmus und Vorhofflimmern akzeptable Ergebnisse, da die Differenzen nur wenige Milliliter betragen. / This study compares the feasibility of calculating the masses and the inner volumes the of right and left heart ventricles in 36 patients (15 female and 21 male, ages between 24 and 82 years, mean 54 years) with transesophageal echocardiography (TEE, HP SONOS 1500 with a rotating 5Mhz transducer) and cardiac MRI (1,5Tesla whole body MRI, ACS Philips with a Synergy Cardiac Coil, T1-Turbo Gradient Echo). We want to compare both methods in calculating the inner volumes, the septal and the free myocardial masses in endsystolic and enddiastolic phases as well as the ejection fraction (EF) and the stroke volume (SV) in ventricles with sinusrhythm (n=26) and with atrial fibrillation (n=18). Both methods are evaluated by a disc-summation method from a mean value of four different measurement. The statistic analysis is done with a Bland-Altmann-Plot. The T-test shows no significant difference between big and small or right and left ventricular masses, but it shows a significant difference in the measured data of ventricles with sinusrhythm and those with atrail fibrillation. A subgroup analysis is performed on the latter. The standard error of mean and the systemic mistake of the inner- and myocardial-volumes differ about double the size with ventricles in atrial fibrillation from those with sinusrhythm. The septal volumes show no differences in both subgroups. The endsystolic measurements are about equal from those in the enddiastolic phase. The EF and the SV have equal standard error of means and systemic mistakes in both subgroups of sinusrhythm and atrial fibrillation. In conclusion both methods are equally reliable in the volumetric measurement of ventricles with sinusrhythm and atrial fibrillation, because the absolute value differs just a few milliliters.

Die Genexpression wurde bisher hauptsächlich auf Transkriptions- und Proteinebene untersucht, wobei der Einfluss der Translation, die die Proteinhäufigkeit direkt beeinflusst, weitgehend außer Acht gelassen wurde. Um diese Rolle besser zu verstehen, habe ich Ribosomen-Profiling-Daten (Ribo-seq) verwendet, um die Translationsregulation zu untersuchen und neue Translationsvorgänge in 65 linksventrikulären Proben von DCM-Patienten im Endstadium und 15 Nicht-DCM-Kontrollen zu identifizieren. Dieser Datensatz half dabei, die Transkriptions- und Translationsregulation zwischen erkrankten und nicht betroffenen menschlichen Herzen zu sezieren und enthüllte Gene und Prozesse, die rein unter Translationskontrolle stehen. Darüber hinaus habe ich neue kardiale Proteine vorhergesagt, die von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) und zirkulären RNAs (circRNAs) translatiert werden. Computergestützte Analysen dieser evolutionär jungen Proteine legten eine Beteiligung an verschiedenen molekularen Prozessen nahe, mit einer besonderen Anreicherung für den mitochondrialen Energiestoffwechsel. Schließlich identifizierte ich RNA-bindende Proteine (RBPs), deren Expression die Menge der Ziel-mRNA oder die Frequenz der Translationseffizienz (TE) beeinflusst. Für eine Untergruppe von 21 RBPs habe ich die Regulation auf beiden quantitativen Merkmalen beobachtet, was zu einer unterschiedlichen mechanistischen Basis der Expressionskontrolle für unabhängige Gensätze führte. Obwohl die genaue Umschaltung der RBP-Funktion wahrscheinlich durch eine Kombination von mehreren Faktoren erreicht wird, haben wir für drei Kandidaten eine starke Abhängigkeit von der Zielgenlänge und der 5'-UTR-Struktur beobachtet. Diese Arbeit präsentiert einen Katalog von neu identifizierten Translationsereignissen und einen quantitativen Ansatz zur Untersuchung der Translationsregulation im gesunden und kranken menschlichen Herzen. / Gene expression has primarily been studied on transcriptional and protein levels, largely disregarding the extent of translational regulation that directly influences protein abundance. To elucidate its role, I used ribosome profiling (Ribo-seq) data, obtained through ribosome profiling, to study translational regulation and identify novel translation events in 65 left ventricular samples of end-stage DCM patients and 15 non-DCM controls. This dataset helped dissect transcriptional and translational regulation between diseased and unaffected human hearts, revealing genes and processes purely under translational control. These would have remained undetected by only looking at the transcriptional level. Furthermore, I predicted novel cardiac proteins translated from long non-coding RNAs (lncRNAs) and circRNAs. Computational analysis of these evolutionary young proteins suggested involvement in diverse molecular processes with a particular enrichment for mitochondrial processes. Finally, I identified RNA-binding proteins (RBPs) whose expression influences target mRNA abundance or translational efficiency (TE) rates. For a subset of 21 RBPs, I have observed regulation on both quantitative traits, which resulted in different mechanistic basis expression control for independent sets of genes. Though the precise switch in RBP function is likely achieved by a combination of multiple factors, for three candidates we have observed a strong dependency on target length and 5’ UTR structure. This work presents a catalogue of newly identified translation events and a quantitative approach to study translational regulation in the healthy and failing human heart.

Ahnak ist ein ubiquitäres Protein, das an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. In der Herzmuskelzelle ist Ahnak überwiegend am Sarkolemma lokalisiert und bindet an Aktin und an die regulatorischen Beta2-Untereinheit des L-Typ-Kalzium-Kanals. Das Ziel dieser Arbeit war die Funktion von Ahnak im Herzen mit Hilfe eines Knock-out-Maus-Modells und in Bindungsstudien zu untersuchen. Morphologische Untersuchungen zeigten, dass das Längenwachstum adulter Kardiomyozyten bei Ahnakdefizienz signifikant reduziert war. Die Kontraktionseigenschaften adulter isolierter Ahnak-defizienter Kardio-myozyten (im Alter von 6 Monaten) waren ebenfalls verändert. Die Kontraktions- und Relaxaktionsgeschwindigkeiten waren erhöht. Eine Erhöhung des diastolischen Kalzium-Spiegels zeigten die Kardiomyozyten schon im Alter von 3 Monaten. Diese beobachteten phänotypischen Veränderungen lassen vermuten, dass die Aktivität des L-Typ-Kalzium-Kanals erhöht ist. In dieser Arbeit konnte das PXXP-Motiv, in der C-terminalen Ahnak-Domäne, als die hochaffine Beta2-Bindungsstelle (KD ~ 60 nM) identifiziert werden. Substitution von Prolin gegen Alanin verringerte zwar die Bindung zur Beta2-Untereinheit dramatisch (KD ~ 1 µM), hob sie aber nicht auf. In weiteren Bindungsstudien zeigte sich, dass die natürlich vorkommende Missensmutation I5236T die Bindung zur regulatorischen Beta2-Untereinheit verstärkte, dagegen verminderte die PKA-abhängige Phosphorylierung der beiden Proteinpartner die Bindung. Experimente am ganzen isoliert perfundierten Herzen zeigten, dass Ahnak-Knock-Out-Herzen geringer Beta-adrenerg stimulierbar waren. Ahnak scheint wie eine physiologische Bremse des kardialen Kalzium-Kanals zu wirken. / Ahnak is an ubiquitous protein with in unique structure, which has been implicated in cell type specific functions. In cardiomyocytes, ahnak is predominantly localized at the sarcolemma and is associated with actin and with the regulatory beta2 subunit of the L-type calcium-channel. The aim of this work was to unravel the function of ahnak in the heart, using a knock-out-mouse model and binding studies. Morphological studies showed a significant decrease in the cell-length of ahnak deficient cardiomyocytes. The contractile parameters of isolated adult ahnak deficient cardiomyocytes (in the age of 6 month) were altered. The development of tension and relaxation were increased. An increase of diastolic calcium was already observed at the age of 3 month. In general the observed phenotypic changes suggested an increased activity of the L-type calcium-channel. In this study, a PXXP-motif, which locates in ahnaks C-terminus, was identified as the high affinity beta2 subunit binding site (KD ~ 60 nM). Substitution of both proline residues by alanine reduced, but did not abolish the binding (KD ~ 1 µM). Further binding studies revealed that the natural occurring ahnak missense mutation I5236T increases the binding affinity to the regulatory beta2 subunit. By contrast PKA dependant phosphorylation of both protein partners decreases the interaction. In studies with isolated perfused working heart preparations, the ahnak deficient hearts were less beta-adrenergic stimulated than hearts from wild type. Taken together ahnak seems to be a physiological brake of the cardiac calcium-channel.