Die autosomal-dominant vererbte Familiäre Hypercholesterinämie ist durch eine exzessive Erhöhung der LDL-Serumcholesterinspiegel gekennzeichnet und bedingt aufgrund einer prämaturen Atherosklerose den frühzeitigen Tod der Patienten. Da ursächlich ein defekter LDL-Rezeptor (LDL-R) zugrundeliegt, der durch Mutationen im Bereich des LDL-R-Gens hervorgerufen wird, kommt der Gentherapie als potentieller Behandlungsmöglichkeit ein besonderer Stellenwert zu. Diese Arbeit untersuchte den Einfluß einer Virusdosiseskalation auf Cholesterinsenkung und Langzeitexpression im adenoviral vermittelten LDL-R-Gentransferversuch im Kaninchenmodell. Hierfür wurden 7 Watanabe Heritable Hyperlipidemic Kaninchen, welche an einer vergleichbaren kongenitalen Hypercholesterinämie durch einen LDL-R-Defekt leiden, mit unterschiedlichen Dosierungen eines Adenovirus des Serotyps 5 therapiert, der die Gensequenz für den humanen LDL-R enthielt. Vor und nach Therapie wurden Bestimmungen der Serumcholesterinkonzentrationen und LDL-Stoffwechselkinetiken mit 125I-LDL sowie semiquantitative szintigraphische Auswertungen durch 111In-LDL-Scans durchgeführt. Hierbei mußte festgestellt werden, dass die adenoviral vermittelte transgene Expression des LDL-R durch die Bestimmung des Serumcholesterins nicht korrekt wiedergegeben wird. Denn zum einen konnte bei der Bestimmung des Serumcholesterins ein dosisabhängiger Effekt beobachtet werden, dieser zeigte sich bei den Stoffwechselkinetiken mit 125I-LDL und bei den Scanuntersuchungen mit 111-In-LDL jedoch nicht. Zum anderen kam es innerhalb von 12-18 Tagen nach Gentransfer zu einem Wiedererreichen der Serumcholesterinausgangswerte, wohingegen die in vivo-Stoffwechselkinetiken eine erhöhte Abbaurate radiomarkierter LDL und die Szintigraphie eine LDL-R-Expression über die gesamte Dauer des Experimentes von 120 Tagen belegten. / Familial hypercholesterolemia is an autosomal dominantly inherited disease characterized by an exzessive elevation of serum LDL cholesterol which leads to premature atherosclerosis and an early death of the patients. As the reason is a defective LDL receptor (LDLR) caused by mutations in the gene encoding LDLR, gene therapy plays an increasingly important role as a treatment possibility. This paper examined the influence of an escalation of the virus dose on the cholestorol reduction and long-term expression in the adenovirally mediated LDLR gene therapy experiment using a rabbit animal model. To facilitate this 7 Watanabe Heritable Hyperlipidemic rabbits, suffering from an equivalent congenital hypercholesterolemia due to a LDLR defect, were treated with different doses of a serotype 5 adenovirus which contained the gene sequence of the human LDLR. Pre and post gene therapy measurements of the serum cholesterol levels and kinetics of LDL metabolism with 125I-LDL were performed, as well as semiquantitative scintigraphic analysis of 111In-LDL scans. The finding was that the adenovirally mediated transgene expression of the LDLR was not correctly reflected by the measurement of the serum cholesterol levels. This was because of a dose dependant effect concerning the measurements of the serum LDL cholesterol levels, which did not appear regarding the kinetics of LDL metabolism with 125I-LDL and the scans with 111In-LDL. Moreover, the serum cholesterol levels reached their initial value within 12-18 days post gene transfer whilst the in vivo-kinetics of LDL metabolism showed an increased catabolic rate of radiolabeled LDL and the scintigraphy indicated a LDLR expression for the whole period of the experiment lasting 120 days.

In Zellkulturexperimenten wurden die Effekte von Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin, Pravastatin und dem Proteasomhemmer Lactacystin suf zwei Endothelzelllinien (CPAE und Ea.hy926) und primäre vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) bezüglich ihres Verhaltens auf die Morphologie, die Proliferation, die Viabilität und die Proteasomaktivität untersucht. Sowohl die Statine als auch Lactacystin induzierten vergleichbare morphologische Veränderungen und beeinflussten die Proliferation von CPAE-Zellen. In den eigenen Versuchen konnten durch Statine induzierte Effekte durch Mevalonat revertiert werden. Die durch Lactacystin verursachten Veränderungen wurden durch Mevalonsäure nicht beeinflusst. Wie erwartet hemmte Lactacystin in den untersuchten CPAE-Zellen signifikant die proteasomale Aktivität. Im Gegensatz dazu blieb die Proteasomaktivität nach einer Statinbehandlung unbeeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in den Ea.hy926 und den VSMCs deutlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sogar hohe Dosen der Statine die Aktivität der gereinigten 20S Proteasomen nicht modulieren. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlußfolgern, dass die ähnlichen biologischen Effekte der Statine und des Lactacystins nicht über einen gemeinsamen Mechanismus der Proteasominhibition funktionieren. / The effect of simvastatin, atrovastatin and pravastatin as well as of the proteasom inhibitor beta-clasto lactacystin was studied on morphology, proliferation viability and on proteasomaö activityin two mammalian endothelial cell lines (CPAE and Ey.hy926) and in primary vascular smooth muscle cells (VSMCs). Both statins and lactacystin induced comparable morphological changes and attenuated proliferation of CPAE. Whereas the statin-induced effects were reversed by mevalonic acid, however, the lactacystin-induced alterations were not influenced by mevalonic acid. As expected, lactacystin caused a significant loss of proteasomal activity measured in the extracts of trested cells. The extracts of statin-treated CPAEs exhibited unchanged activities. This result was also confirmed in Ea.hy926 cells and in primary rat VSMCs. It is shown, that even high dosis of statins do not modulate the activity of purified human 20S proteasomes. The conclusion was that similar biological effects of statins and the well known proteasome inhibitor lactacystin in vascular cells are not caused by a common inhibitory mechanism ofaction on the proteasome.

Diese Dissertation befasst sich mit der Dynamik von Lipidtropfen (LDs), die der Speicherung von Lipiden (hauptsächlich Triacylglycerol, TAG) dienen. Das epidemische Auftreten von Adipositas und der sogenannten Fettleber (Steatose) hat das wissenschaftliche Interesse an der Regulation der zellulären Speicherung in LDs stark beflügelt. Es gibt inzwischen zahlreiche Publikationen zu einzelnen Aspekten der Bildung, des Wachstums und des Abbaus von Lipidtropfen. Ein detailliertes mathematisches Modell, das diese Einzelergebnisse in ein konsistentes Bild zusammenfügt, gibt es allerdings nicht. Die Aufstellung, Validierung und Anwendung eines umfassenden mathematischen Modells der Dynamik von LDs steht daher im Mittelpunkt dieser Arbeit. Dieses Modell umfasst unter anderem die Aufnahme von freien Fettsäuren aus dem Blutplasma, die Veresterung zu TAG, die Bildung, das Wachstum und die Lipolyse von Lipidtropfen, die durch etliche regulatorische Oberflächenproteine (ROPs) gesteuert werden. Eine wesentliche Frage im Zusammenhang mit der Entstehung einer Fettleber gilt den Mechanismen, die den heterogenen Fetteinlagerungen in der Leber zugrunde liegen. Eigene Experimente mit humanen Hepatomzellen (PLC) zeigten, dass eine Heterogenität in der TAG-Speicherung auch in isolierten Zellen existiert, wenn man sie einer Fettsäurebelastung unterwirft. Modellsimulationen zeigen, dass Schwankungen in der Expression zentraler regulatorischer Proteine bereits eine Heterogenität bis zu 50% erklären können. Unter der Annahme, dass eine solche Variabilität der Genexpression auch im intakten Organ vorliegt, prognostiziert das Modell eine Variation im TAG-Gehalt einzelner Zellen um einen Faktor drei bis sechs. Zusammenfassend ist zu sagen, dass der Modellansatz zahlreiche experimentelle Ergebnisse von einzelnen Prozessen im zellulären TAG-Metabolismus und im Metabolismus der LD-Dynamik in ein konsistentes, neuartiges und dynamisches Modell eines metabolischen Netzwerks integriert. / This dissertation occupies with the dynamics of lipid droplets (LDs) serving as lipid deposit transporting, mainly triacylglycerol (TAG). The epidemic occurrence of obesity and steatosis has inspired strongly the scientific interest in regulation of hepatic TAG accumulation. There are now numerous publications regarding individual aspects of formation, maturation and lipolysis of LDs. However, a detailed computational model putting together this fractional knowledge is lacking so far. I focus on development, validation and implementation a kinetic model encompassing the pathways of the fatty acids (FFA) and TAG metabolism and the main molecular processes governing the dynamics of LDs. Experiments with primary human hepatocytes incubated with an excess of FFA show a large heterogeneity of TAG content and LD size distribution. Intriguingly, a large cell-to-cell heterogeneity with respect to the number and size of LDs has been found in various cell types. These findings suggest that the extent of cellular lipid accumulation is not only determined by the imbalance between lipid supply and utilization but also by variations in the expression of regulatory surface proteins and metabolic enzymes. To better understand the relative regulatory impact of individual processes involved in the cellular TAG turnover we varied randomly the expression of RSPs and metabolic enzymes. A random fold change by a factor of about 2 in the activity of RSPs was sufficient to reproduce the large diversity of droplet size distributions. Under the premise that the same extent of variability of RSPs holds for the intact organ, our model predicts variations in the TAG content of individual hepatocytes by a factor of about three to six depending on the nutritional regime. Taken together, our modeling approach integrates numerous experimental findings on individual processes in the cellular TAG metabolism and LD dynamics metabolism to a consistent state-of-the-art dynamic network model.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.