Es wird angenommen, dass das Influenzavirus-Glykoprotein Hämagglutinin (HA) für seine Funktion sowohl bei der Virusfreisetzung als auch bei der Fusion von viraler und zellulärer Membran mit Cholesterin- und Sphingolipidreichen Domänen, sogenannten Membran-Rafts, assoziiert sein muss. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Membran-Raft-Affinität von HA in lebenden Zellen mittels FLIM-FRET gemessen werden. Dabei wurde mit Hilfe der Fluroreszenz-Lebenszeit-Messung (FLIM) der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von fluoreszenzmarkiertem HA auf einen etablierten Raft-Marker bestimmt. Diese Messungen zeigten, dass beide Proteine in gemeinsamen Klustern in der Plasmamembran vorkommen. Durch Cholesterinentzug und durch den Einsatz von Cytochalasin D, welches die Mikrofilamente zerstört, konnte diese Klusterbildung reduziert werden. Demnach tragen sowohl die Membran-Rafts als auch das Aktinnetzwerk zu dieser Klusterbildung bei. Mittels FLIM-FRET konnte zusätzlich bestätigt werden, dass die Signale für die Detergenslöslichkeit von HA in Triton-Extraktionsexperimenten, die Palmitylierung und die stark hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der Transmembrandomäne (TMD), auch im lebenden System eine wichtige Rolle spielen. Zusätzlich konnten biochemische Experimente zeigen, dass die hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der HA-TMD den intrazellulären Transport, nach der Trimerbildung, entscheidend verzögern. Diese Verzögerung ist vermutlich auf einer erschwerten Integration dieser Proteine in die Membran-Rafts begründet. Die virale Fusion mit der Wirtszellmembran wird durch eine pH5-Behandlung vermittelte Konformationsänderung von HA ausgelöst. FLIM-FRET-Messungen zeigten für die pH5-Konformation von HA eine verglichen mit der pH7-Konformation verringerte Klusterbildung mit dem Raft-Marker. Somit ist offensichtlich, dass die Membranfusion-vermittelnde HA-Konformation eine verringerte Raft-Affinität besitzt. Diese verringerte Raft-Affinität könnte eine wichtige Rolle bei der Störung der Lipide an der Fusionsstelle spielen und somit die Bildung und/oder Vergrößerung der Fusionspore erleichtern. / It has been supposed that the hemagglutinin (HA) of influenza virus is recruited to cholesterol- and sphingolipid-enriched domains, also named membrane-rafts, to accomplish its function in virus budding and membrane fusion. This study aimed at verifying the affinity of HA for membrane-rafts in living cells using fluorescence-lifetime imaging microscopy to measure Förster’s resonance energy transfer (FLIM-FRET). FLIM-FRET revealed strong clustering between a fluorescence-tagged HA-protein and a well-established raft-marker in CHO cells. Clustering was significantly reduced when rafts were disintegrated by cholesterol depletion and when microfilaments were disrupted with cytochalasin D. Thus, membrane-rafts as well as the actin meshwork contribute synergistically to clustering. Clustering was also reduced by the removal of the known signals for the association of HA with detergent-resistant-membranes, the palmitoylation and the first amino acids in the transmembrane region (TMR). Since these mutations are obviously important for the raft-association of HA their function during the transport through the ER and the Golgi-complex was studied. These investigations showed that the exchange of the first three amino acids of the HA-TMR led to a decelerated transport after trimer-formation of the protein, probably due to retarded integration of these proteins into membrane-raft domains. Mediating viral fusion with the host cell membrane requires an irreversible conformational change of HA. FLIM-FRET studies of this low pH conformation unveiled that the clustering with the raft-marker is decisively reduced compared to the pre-fusion conformation of the protein. It might be assumed that the fusion-mediating conformation of HA reduces the proteins affinity for membrane-rafts. Therefore it is likely that this reduced affinity for rafts after the conformational change is relevant to cause perturbation of lipids at the fusion site and thereby facilitating the formation and/or enlargement of the fusion pore.

Zusammenfassung Zur Freisetzung ihres Genoms in das Innere der Wirtszelle müssen Hüllviren ihre Membran mit der Membran der Wirtszelle verschmelzen. Diese Fusion wird durch eine Konformations- umwandlung der Ektodomäne viraler Glykoproteine ausgelöst. Die Kenntnis der drei- dimensionalen Struktur der vollständigen Ektodomäne in der fusionsaktiven Konformation ist Voraussetzung für das Verständnis des Fusionsmechanismus. Die Fusion von Influenza mit entsprechenden Targetmembranen wird durch eine durch sauren pH ausgelöste Konformationsänderung des als Trimer vorliegenden Glykoproteins Hämagglutinin (HA) vermittelt. Bis jetzt war die dreidimensionale (Röntgenkristall-) Struktur einer enzymatisch abgespaltenen HA-Ektodomäne nur eines Influenzastammes bei neutralem pH-Wert bzw. von einigen Fragmenten der HA2-Untereinheit bei saurem pH-Wert bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden ein geeigneter Influenzastamm sowie geeignete Untersuchungsbedingungen ermittelt, um die 3D-Struktur des kompletten, nicht enzymatisch vorbehandelten HA sowohl in seiner nativen (bei neutralem pH-Wert vorliegenden) als auch in seiner fusionskompetenten (keinesfalls aber bereits inaktivierten) Struktur mittels Kryo- Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung aufzuklären. Es wurde erstmals die 3D-Struktur des kompletten HA eines anderen Influenzastammes (A/Japan) bei neutralem pH-Wert aufgeklärt und mit der bekannten 3D-Struktur von Influenza X-31 verglichen. Außerdem konnte eine fusionskompetente Form rekonstruiert werden, die im Vergleich zur nativen Konformation deutliche Veränderungen in der 3D-Struktur zeigt, ohne daß sich jedoch die Assoziation der Monomere aufhob. Die Befunde werden unter anderem in Hinblick auf die Bedeutung der HA1-Untereinheit für die Fusion diskutiert. Die vorgestellte Methode scheint geeignet, auch andere Membranproteine bzw. Membranfusion-vermittelnde Proteine in verschiedenen konformeren Zuständen aufzuklären (insbesondere jene, die der Röntgenkristallstrukturanalyse nicht zugänglich sind) und so einen diesen Fusionsprozessen eventuell zugrundeliegenden konservierten Funktionsmechanismus aufzuhellen. / Abstract Envelope viruses enter a host cell via fusion between the viral and endosomal membrane, thereby releasing the nucleocapsid into the cytoplasm. The fusion has been accompanied with an conformational change in the ectodomain of viral glycoproteins. To understand the mechanism leading to fusion the three-dimensional (3D) structure of the complete viral glycoprotein in its fusion competent conformation has to be determined. The Fusion of influenza virus which is triggered at low pH has been associated with an irreversible conformational change in the trimeric glycoprotein hemagglutinin (HA). The three-dimensional (crystal) structure is already known of the enzymatic-cleaved ectodomain of one influenza strain (X-31) at neutral pH or of some fragments of the HA2-subunit at low pH, respectively. In this work a suitable influenza strain as well as suitable experimental conditions for investigations of the 3D-structure of the complete and not enzymatically treated HA at neutral and acidic pH conditions have been determined. An cryo-microscopy/angular reconstitution approach has been employed for the 3D- reconstruction of the intact HA of an different influenza strain (A/Japan). This structure is in excellent agreement with the known X-ray crystallographic structure of the bromelain- cleaved ectodomain of HA from influenza X-31. Moreover, for the very first time the 3D structure of the intact HA of Influenza A/Japan in its fusion competent state (at acidic pH) has been calculated. The differences between the two structures are large compared to the marginal differences between the neutral pH structures by EM and by X-ray crystallography, respectively, although the monomers remain tightly connected. These findings will be discussed especially with regard to the role of the HA1 subunit in the fusion process. The procedure is in general applicable to pursue the 3D-structure of (fusion mediating) proteins in various conformational states (especially of those proteins which are not directly accessible by X-ray crystallography). This approach should offer to elucidate the (eventually conserved) mechanism of membrane fusion.

Der Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, sphingomyelin- und cholesterinreiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen. Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es dient der Bindung an die Wirtszelle und der Fusion mit dem Endosom. Es wird angenommen, dass HA bei der Abschnürung der Viruspartikel von der Zelle mitwirkt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die Virushülle ist mit raftbildenden Lipiden angereichert. Um die Rolle der HA-Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt entwickelt, das den C-Terminus von HA mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz nachgewiesen wurde. Zudem führen ein Cholesterinentzug aus der PM und die Deletion hochkonservierter Palmitylierungsstellen zu einer signifikanten Verringerung selbiger; sehr gering war diese zwischen dem HA-Konstrukt und einem Nicht-Raft-Marker. Darüberhinaus konnte durch ortsspezifische Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten Konstrukte disulfidbrückenverbundene Oligomere bilden, welche Voraussetzung für den Transport der Konstrukte an die PM sind. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes Homo-FRET-Signal, welches die Oligomerisierungshypothese bestätigt. / Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). Assembly of the new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell membrane. Lipid domains or rafts enriched of sphingomyelin and cholesterol were suggested as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA), a homotrimeric glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus, mediates binding of the virus to the host cell and fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play an important role in budding of the viral particles from the host cell. Two observations led to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions, second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts. To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal ectodomain of HA in the PM of mammalian cells. We studied energy transfer (FRET) between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted into cholesterol-dependent lipid domains since cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET efficiency. Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a reduction of FRET efficiency. Site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked oligomers and that oligomerization is fundamental for the transport to the PM. This result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Accordingly, trimerization of full length HA is fundamental for stability and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.

Das Hüllglykoprotein Hämagglutinin (HA) von Influenzavirus ist verantwortlich sowohl für die Bindung als auch für die nachfolgende Fusion der viralen Hülle mit der endosomalen Membran. Eine Analyse der 3D Struktur der HA-Ektodomaine zeigt, dass die Stabilität des Proteins sowohl durch kovalente als auch durch nicht-kovalente Wechselwirkungen bedingt ist. Die Konformationsänderung von HA bei saurem pH-Wert weißt auf eine mögliche Rolle von Protonierungseffekten auf ionisierbare Aminosäuren hin. Untersuchungen zur Bedeutung geladener Aminosäuren und Salzbrücken für die Struktur des HA wurden auf der Grundlage von ‚site directed mutagenesis’ durchgeführt. Der Einfluss der Mutationen auf die Konformationsänderung und die Fusionsaktivität von HA wurden durch einen Proteinase K-Assay bzw. Fluoreszenzmikroskopie erfasst. Die Ergebnisse beider Methoden wurden miteinander korreliert. Abgesehen von der Mutante R109E zeigten Wildtyp-HA und alle anderen Mutanten eine vergleichbare Oberflächenexpression. Die beobachteten Unterschiede in der pH-Abhängigkeit der Konformationumwandlung zwischen Wildtyp-HA und HA-Mutanten zeigen, daß eine Zerstörung von Salzbrücken und ggf. eine Erhöhung der elektrostatischen Abstoßung an den betrachteten Kontakstellen sehr wahrscheinlich eine Herabsetzung der energetischen Barriere der Konformationsumwandlung verursacht. Dieser Ergebnisse erklären die molekularen Grundlagen des erhöhten pH-Schwellwertes der HA-Konformationsumwandlung von Amantadin-resistenten Influenzaviren. Im Gegensatz wurde für Mutanten, die die Stabilität von HA erhöhten, keine Konformationsumwandlung bei einem pH-Wert beobachtet, der typisch für die Konformationumwandlung von Wildtyp-HA war. Aminosäuren, die denen dieser stabiliserenden Mutationen entsprachen, wurden in einer natürlichen Influenzavirusvariante – A/JPN/305/57 – gefunden. Die Bedeutung von Ladungen für die Stabilität der HA-Ektodomaine wird dadurch unterstrichen, dass eine Konservierung einer positiven Ladung und insbesondere eines Argininrestes in der Position 109 (Nummerierung auf der Basis von HA X31) für alle Influenzaviren A und B gefunden wurde. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass sehr wahrscheinlich eine komplexe Salzbrücke an der Kontaktfläche zwischen HA1 und HA2 für alle Influenzaviren A evolutionär konserviert ist. / Hemagglutinin (HA), a major envelope glycoprotein is responsible for fusing viral and endosomal membranes during influenza virus entry. The analysis of 3D crystal structure of the HA ectodomain shows that the stability of protein is maintained by both non-covalent and covalent interactions. The conformational change of HA at low pH indicates a role for protonation effects of the ionisable amino acids. Structural investigations were done using “site directed mutagenesis” in order to conceive the importance of charged amino acids and more emphatically the involvement of salt bridges. The effect of mutations on the conformational change and fusion activity was probed by proteinase K assay and fluorescence microscopy respectively. It was observed that HA-wt and all the mutants except R109E showed comparable surface expression. The difference in pH threshold between the HA-wt and the mutants showed that breakage of salt bridge and further incorporation of repulsion at the considered interfaces would lower the energy barrier requirements for the conformational change. The results explain the molecular basis of the higher pH threshold for naturally occurring amantadine resistant mutants. On the other hand, mutants designed to stabilise the HA were resistant to conformational changes at those pH values which typically trigger the conformational change of HA-wt. Coincidentally these mutations were found to be existing in the natural variant of H2 Japan subtype (A/JPN/305/57). Interestingly, the study shows that a positive charge and, more specifically, an Arg residue at position 109 (numbering based on X-31 strain) is conserved in all of the influenza A and B viruses underlining the relevance of electrostatic interactions for the HA stability. Aptly a complex salt bridge at the interface of HA1 and HA2 is probably conserved evolutionarily in all the members of influenza A virus.

Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. / A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.

Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus ist eine mögliche Zielstruktur für antivirale Therapeutika. Aus der Menge experimenteller HA-Inhibitoren stechen die kürzlich beschriebenen Q-beta-Sialoside aufgrund ihrer hohen Affinität und akkuraten, multivalenten Abbildung der Rezeptorbindungsstellengeometrie hervor. Anknüpfend an diese Eigenschaften beschreibt die vorliegende Arbeit die Erweiterung der Q-beta-Sialosidplattform durch neuartige Varianten und Anwendungsgebiete. Verschiedene Strategien für die Entfernung von Lipopolysacchariden aus Kapsidproben wurden untersucht, wobei sich das Verfahren der Cloud Point als am besten geeignet herausstellte. Das gereinigte Material war geeignet für in vivo Versuche. Teilsialylierte Kaspidvarianten wurden auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und im Vergleich der Ergebnisse mit statistischen Berechnungen Hinweise auf einen vorherrschend trivalenten Bindungsmodus zwischen Q-beta-Sialosiden und HA gefunden. Die Arbeit beinhaltet die ersten Beispiele heterobifunktionaler Q-beta-Sialoside, die verschiedene Sialinsäureliganden oder Kombinationen aus Zuckern und Fluoreszenzfarbstoffen aufweisen. Die fluoreszenzmarkierten Kapside wurden in Mukus-Mobilitätsstudien angewendet und ihre Undurchgängigkeit der äußeren Mukusbarriere visualisiert. Mehrere Sialinsäureester wurden als potenzielle ladungsmaskierte Liganden für erhöhte Mukusgängigkeit untersucht. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung eines peptidbasierten HA-Inhibitors. Eine Gruppe von aus HA-bindenden Antikörpern und Lactoferrin abgeleiteten Peptiden wurde mit Hilfe der mikroskaligen Thermophorese auf ihre Affinität zu HA oder Influenza A/X31 (H3N2) getestet. Die vorläufigen Resultate weisen auf eine gute Bindung mehrerer Kandidaten hin. Multivalente Peptid-Polymer-Konjugate wurden auf Basis von linearem Polygylcerol niedrigen Molekulargewichts synthetisiert, jedoch zeigte keines eine Inhibierung der getesteten Influenzastämme. / The influenza virus hemagglutinin (HA) attracts much attention as a target widely unexploited by licensed therapeutics. From the numerous experimental HA inhibitors, the recently reported Q-beta sialosides stand out through their affinity and accurate, multivalent reflection of the receptor binding site geometry. Building upon these characteristics, this work expands the variety of the Q-beta sialoside platform with novel variants and explores new areas of application. Several strategies were compared to remove lipopolysaccharides from capsid preparations, determining cloud point extraction as the most suitable. The purified material shown to be suitable for in vivo experiments. The inhibitory activities of partially sialylated capsids were compared to statistical models to obtain evidence for the prevalence of trivalent interactions between Q-beta sialosides and HA. Moreover, this work contains the first examples of heterobifunctional Q sialosides, bearing multiple sialic acid (SA) ligands or combinations of sugars and fluorescent dyes. Fluorescently labeled Q-beta sialosides were applied in mucus mobility studies to visualize their entrapment in the outer mucus layer. Several SA esters were examined as potential masked-charge ligands to increase mucus permeation. A second focal point of the thesis was the design of a novel, peptide-based HA inhibitor. A library of peptides derived from HA-binding antibodies and lactoferrin was investigated using microscale thermophoresis for binding to recombinant HA or influenza A/X31 (H3N2) concentrate. Preliminary results indicated good affinity for some candidates. Multivalent polymer-peptide conjugates of several peptides were synthesized by immobilization on low molecular weight linear polyglycerol. However, none of the conjugates was able to inhibit influenza strains A/X31 (H3N2) or A/PR8 (H1N1) in a hemagglutination inhibition test.

Der Eintritt von Influenza A Viren in Wirtszellen erfolgt anhand des Hämagglutinin (HA) Proteins. Neueste Entwicklungen zielen darauf ab, die fusionsinduzierende Konformations-änderung des HA und damit die Freisetzung des viralen Genoms in die Wirtszelle zu inhibieren. Der Fusionsprozess ist pH-abhängig da nur bei einem niedrigen pH-Wert (~5.0-6.0) die Protonierung bestimmter Reste innerhalb des HA eine Konformationsänderung, und somit die Membranfusion, auslöst. Die Identifizierung von konservierten, titrierbaren Resten und die Aufklärung der Strukturveränderungen im HA ermöglichen eine gezielte Entwicklung neuer antiviraler Medikamente. In dieser Arbeit wurden bestimmte Histidine im HA mittels umfassender experimenteller und theoretischer Methoden als potentielle pH-Sensoren untersucht. Dabei konnte das Histidin an Position 184 als wichtiger Schalter der pH-induzierten Konformationsänderung identifiziert werden. Außerdem bewirkte der Austausch des geladenen Rests an Position 216 in der Nähe des His184 eine Veränderung der pH-Abhängigkeit des H5 HA aufgrund der Beeinflussung des pKa-Werts des His184. Da die Mutation R216E im HA des hochpathogenen H5N1 Virus in allen Isolaten während der Vogelvirenseuche im Jahr 2003/04 detektiert wurde, deutet das Ergebnis daraufhin, dass diese Mutation zur Entstehung des hochvirulenten Vogelvirus und dessen Adaptierung an den Menschen beigetragen hat. In diesem Zusammenhang wurde auch der Einfluss der pH-Abhängigkeit des HA auf die Fusion und Infektiosität von Viren in lebenden Zellen getestet. Eine destabilisierende Mutation im HA eines rekombinanten WSN-H3 Virus reduzierte dessen Infektions- und Replikationseffizienz in MDCK-Zellen, was auf den endosomalen pH-Wert dieser Zellen zurückgeführt werden konnte. Die Messung der Virus-Endosom-Fusionskinetik in lebenden Zellen machte außerdem die Bedeutung der pH-Abhängigkeit des HA für den Zeitpunkt der Membranfusion und dessen Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion deutlich. / The entry of influenza A virus into host cells is established by the hemagglutinin (HA) protein. New antiviral strategies aim to inhibit the fusion inducing conformational change of HA and thereby liberation of the viral genome into the cell. This process is strictly pH dependent since the conformational change of HA initiating the fusion of membranes only occurs upon protonation of yet unknown residues within HA at low pH (~5.0-6.0). The identification of conserved titrable residues and better understanding of the sequential structural rearrangements within HA may facilitate the development of new broad-spectrum antivirals. In the present work His184 and His110 were characterized as potential pH sensors by a comprehensive mutational and computational analysis. The results suggest that His184, but not His110, is an important regulator of HA conformational change at low pH. Furthermore, an exchange of charge at position 216 in vicinity to His184 was shown to alter the pH dependence of conformational change and of fusion in correlation to the known pKa dependence of histidines on neighboring residues. The result advocates that the mutation R216E, which emerged in the highly pathogenic H5 HA in 2003-2004, contributed to an altered acid stability of H5 HA via its effect on His184 and thus to the adaptation of avian H5N1 viruses to the human host. Therefore, the role of an altered acid stability of HA for viral fusion and infectivity in living cells was assessed. Recombinant viruses containing a destabilizing mutation in the HA protein were found to have a reduced infectivity and replication efficiency in MDCK cells compared to the respective wild type. Studying virus-endosome fusion kinetics in these cells we could resolve a significant difference in the timing of fusion induction suggesting that the time-point of fusion is a critical determinant of viral infection efficiency which depends on the endosomal acidification as well as on the acid stability of HA.

Das Prinzip der Multivalenz ist in der Natur allgegenwärtig, welches auch von Influenza-Viren genutzt wird, um über ihre Oberflächenproteine an epitheliale Wirtszellen zu binden. Diese Interaktion bietet einen interessanten Ansatzpunkt für multivalente Inhibitoren, wenn es gelingt, die Bedingungen für eine effiziente Wechselwirkung mit dem Virus zu entschlüsseln. Hierzu wurde in dieser Arbeit eine Charakterisierung des Hämagglutinin-Trimers (HA) auf viralen Partikeln mittels Kohlenhydrat-Nukleinsäuregerüsten und Kohlenhydrat-Polyethylenglykol (PEG)-Gerüsten vorgenommen. Distanz-Affinitäts-Beziehungen für die Interaktion des trimeren HA mit den bivalenten Präsentationen des Sialyl-LacNAc zeigten, dass bivalente PEG-Konjugate nicht in der Lage sind, eine bivalente Verstärkung der Wechselwirkungen mit der löslichen HA-Ektodomäne oder mit HA auf der viralen Oberfläche herbeizuführen, wobei die räumliche Rasterung mit PNA∙DNA-Gerüsten eine bimodale Distanz-Affinitäts-Beziehung ergab. Ein Affinitätsmaximum in einem Abstand von 52 - 59 Å wurde einer simultanen Bindung an zwei kanonische Bindungsstellen eines HA-Trimers zugeordnet, wobei ein zweites Affinitätsmaximum bei 26 Å auf die Existenz einer sekundären Bindungsstelle hindeutet. In dieser Arbeit wurde erstmals die multivalente Präsentation von Glykoliganden auf langen repetitiven DNA-Templaten demonstriert. Es wurden Nukleinsäure-Komplexe erhalten die eine vollständige Inhibierung der Virus-induzierten Hämagglutination bei einer Konzentration von 10^(-9) M des Templats erzielten, was einer 10^7-fachen Verstärkung bezogen auf den monovalenten Zucker entspricht. Neben einer hochpotenten Inhibition offenbarten distanzoptimierte bivalente und multivalente Binder auf Nukleinsäuregerüsten auch subtypspezifische Inhibition. / The principle of multivalency is omnipresent in nature, which is also used by influenza viruses to bind to epithelial host cells via their surface proteins. This interaction offers an interesting starting point for multivalent inhibitors if the conditions for an efficient interaction with the virus can be deciphered. For this purpose, the hemagglutinin trimer (HA) on viral particles was characterized using carbohydrate-nucleic acid scaffolds and carbohydrate-polyethylene glycol (PEG) scaffolds. Distance-affinity relationships for the interaction of the trimeric HA with the bivalent presentations of the sialyl-LacNAc showed that bivalent PEG conjugates are not capable of a bivalent enhancement of the interactions with the soluble HA ectodomain or with HA on the viral surface, whereby the spatial screening with PNA∙DNA scaffolds resulted in a bimodal distance-affinity relationship. An affinity maximum at a distance of 52 - 59 Å was assigned to simultaneous binding to two canonical binding sites of an HA trimer, with a second affinity maximum at 26 Å indicating the existence of a secondary binding site. In this work the multivalent presentation of carbohydrate ligands on long repetitive DNA templates was demonstrated for the first time. Nucleic acid complexes were obtained which achieved a full inhibition of the virus-induced hemagglutination at a concentration of 10^(-9) M of the template, which corresponds to a 10^7-fold increase in relation to the monovalent sugar. In addition to a highly potent inhibition, distance-optimized bivalent and multivalent binders on nucleic acid structures also revealed subtype-specific inhibition.