Reversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht. / Reversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.

In dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine sequenzspezifische Hybridisierung von zwei Peptid-PNA-Konjugaten an einem komplementären DNA-Templat die Bildung eines neuen Peptids auslösen kann, welches proapoptotische Eigenschaften besitzt. Dazu binden zwei kurze PNA-Oligomere an einem komplementären DNA-Templat und ermöglichen dadurch den Transfer einer Aminoacylgruppe. In den vorgestellten Untersuchungen trug ein Oligomer einen Alaninrest, welcher C-terminal als Thioester gebunden war. An das zweite PNA-Oligomer war ein Peptid mit N-terminalem Cysteinrest geknüpft. Mittels einer Cystein-vermittelten Transferreaktion wurde die Aminoacyleinheit auf das Akzeptor-Konjugat übertragen und es entstand das freie PNA-Oligomer sowie ein neues Peptid. Die so generierten Peptid-PNA-Konjugate waren so konstruiert, dass sie an BIR3 binden und damit dessen Interaktion mit Caspase-9, einem Schlüsselenzym der Apoptose, entgegenwirken konnten. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem die DNA-gesteuerte Transferreaktion mit der Aktivierung der Caspase-9 aus dem inhibitorischen Komplex mit BIR3 in HEK293-Zelllysat kombiniert wurde. Als Vorbereitung für eine intrazelluläre Anwendung der Nukleinsäuretemplat-katalysierten Peptidsynthese wurde zunächst die Stabilität der Konjugate in Zelllysat untersucht und weiterhin eine Synthesestrategie zur PEGylierung der verwendeten Peptid-PNA-Konjugate entwickelt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem DNA-gesteuerten Aminoacyltransfer zum ersten Mal eine Methode aufgezeigt wurde, welche die in Nukleinsäuren kodierte Information für die Generierung eines Wirkstoffes nutzt, der die Aktivität eines Proteins kontrollieren kann. Die Synthese des aktiven Peptidwirkstoffes gelang in der komplexen Umgebung von Zelllysat, erfolgte sequenzspezifisch und in Gegenwart substöchiometrischer Konzentrationen des Templats. / In this thesis it was investigated, whether the sequence specific hybridisation of two peptide-PNA conjugates could trigger the formation of a new peptide with proapoptotic properties. The method draws upon a nucleic acid-templated reaction, in which two short PNA oligomers bind adjacently on a complementary DNA template enabling the transfer of an amino acyl group. In the presented study one oligomer carried an alanine residue that was C-terminally attached to the PNA sequence via a thioester linkage. The second PNA oligomer conferred a peptide with an N-terminal cysteine residue and served as acceptor. In a cysteine mediated transfer reaction an amino acyl moiety was transferred to the acceptor conjugate yielding a free PNA oligomer and a new peptide. The generated peptide-PNA conjugates were designed to bind BIR3 protein and therefore interrupt its interaction with caspase-9 a key enzyme of apoptosis. In a cell free functional assay, which included recombinant BIR3 protein and HEK293 cell lysate, the peptide-PNA conjugates formed upon the DNA-triggered peptide synthesis acted as BIR3 antagonists and allowed reactivation of inhibited initiator caspase-9 as well as of the executioner caspase-3. Preliminary studies for future intracellular applications of this method included the investigation of the stability of the peptide-PNA conjugates in cell lysate and the development of a synthetic strategy for the PEGylation of the conjugates. With the DNA-triggered peptide synthesis via aminoacyl transfer we introduced a method, which allows for the translation of nucleic acid information into the output of molecules that interfere with disease-related protein-protein interactions. The synthesis of the active peptide drug proceeds sequence specifically and shows turnover in template even in a complex biomolecular environment such as cell lysate.

Peptide bilden eine einzigartige Klasse von Biomolekülen. Auf Grund ihrer komplexen Struktur sind sie in der Lage hochspezifisch an Zielmoleküle zu binden und können darüber hinaus bioaktive Eigenschaften aufweisen. In dieser Dissertation wurden verschiedene Anwendungen, für die biologisch aktive Peptide genutzt werden können untersucht und darüber hinaus die Konjugation ungeschützter Peptide an funktionelle Gerüstmoleküle betrachtet. Die spezifischen Bindungseigenschaften eines Hemagglutinin bindenden Peptids konnten durch deren multivalente Präsentation auf einem Polymer-Nanopartikel genutzt werden, um einen hochwirksamen Virus-Eintritts-Blocker zu synthetisieren. Außerdem wurde in dieser Dissertation eine neuartige chemoselektive Konjugation zwischen ungeschützten zyklischen Peptiden und Proteinen erforscht, basierend auf der Staudinger Phosphonite Reaktion. Die kovalente Bindung zwischen Proteinen und Peptiden ermöglichte die zellulären Aufnahme und zytosolische Verteilung des konjugierten Proteins. Die neuartige Staudinger induzierte Thiol Addition konnte darüber hinaus für die intramolekulare Makrozyklisierung von Peptiden eingesetzt werden, wodurch die biologische Aktivität der Peptide gesteigert wurde. Dies konnte anhand von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden, als auch in der Stabilisierung der helikalen Struktur eines peptidischen Protein-Protein-Interaktions Inhibitors gezeigt werden. Des weiteren wurde eine bioreversible chemoselektive Konjugationsmethode untersucht, basierend auf der O-Alkylierung von Carbonsäuren, um eGFP mit zyklischen zellpenetrierenden Peptiden zu markieren. Erste Schritte zur Evaluierung der entstandenen Konjugate wurden unternommen. Zusammengenommen konnte die Vielfältigkeit bioaktiver Peptide in mehreren Anwendungen gezeigt werden, mit besonderem Augenmerk auf die Erweiterung der Konjugationsmethoden für ungeschützte Peptide an funktionale Trägermoleküle. / Synthetic peptides are a unique class of biomolecules. Due to their complex structure they can bind targets in a highly specific manner and can furthermore exhibit unique properties. Even though they are complex in structure, they are straightforward synthetically accessible. This thesis evolves around the many different aspects, in which biological active peptides can be used, from specific binders to cell penetration tags. Furthermore, the site specific and chemoselective conjugation of an unprotected peptide to a functional scaffold has been addressed. The binding properties of peptides could be used to generate a highly potent virus entry blocker from a viral-membrane-protein binding peptide, which was displayed multivalently on a polymeric nanoparticle. Furthermore, this thesis explored a novel chemoselective reaction, based on the Staudinger phosphonite reaction to conjugate cyclic peptides to eGFP. The covalent attachment of the peptidic ligand promoted efficiently the cellular uptake of protein and its cytosolic distribution. The novel Staudinger induced thiol addition cascade was further successfully used in an intramolecular reaction to macrocyclize peptides in order to induce bioactivity. This could be shown for the synthesis of cyclic cell penetrating peptides, as well as to stabilize the helical structure of a peptidic protein-protein interaction inhibitor. Furthermore, a bioreversible chemoselective conjugation based on a diazo building block, was used to label eGFP with cyclic cell penetrating peptides. First steps to evaluate the potency in vitro were undertaken. Taken together, the versatility of bioactive peptides was demonstrated in multiple applications and the tools to conjugate unprotected peptides to functional scaffolds was extended by the Staudinger induced thiol addition.

Diese Arbeit beschreibt die Kombination von Phagen-Display-Biopanning und Illumina Next-Generation DNA-Sequencing (NGS) zur Identifizierung peptidbasierter Adhäsionsdomänen für Polypropylen (PP). Eine Biopanning-Runde gefolgt von NGS liefert PP-bindende Peptide, die durch Sanger-Sequenzierung nicht erkennbar sind. NGS bietet den Vorteil eines enorm umfangreichen Datensatzes, welcher tiefgreifende Sequenzanalysen erlaubt. Die selektierten Sequenzen werden als wasserbasierte Primer für PP–Metallhaftung zur Vorbehandlung von PP-Oberflächen eingesetzt und erhöhen die Haftfestigkeit um 100 % gegenüber nicht vorbehandeltem PP. / This thesis describes the combination of phage display biopanning and Illumina Next-Generation DNA-Sequencing (NGS) to identify peptide-based adhesion domains for polypropylene (PP). One round of biopanning followed by NGS yields PP-binding peptides that are undetectable by Sanger sequencing. NGS has the advantage of an extensive data set, which allows in-depth sequence analysis. The selected peptide sequences are then used as water-based primers for PP metal adhesion for the pretreatment of PP surfaces and increase the adhesion by 100% compared to non-pretreated PP.

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert. / Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.

Die im Jahre 1963 von Robert Bruce Merrifield vorgestellte festphasengebundene Peptidsynthese beeinflusste in hohem Maße verschiedene Bereiche der Naturwissenschaften. Doch trotz zahlreicher neuer Entwicklungen hat sich in der das Prinzip der eingesetzten Trägermaterialien nicht grundlegend geändert. Geringfügig quervernetzte Polystyrol-Harze sind immer noch die meist verwendeten Trägermaterialien in der standardisierten Peptidsynthese. In dieser Arbeit wurden superparamagnetische Kern-Schale-Nanopartikel entwickelt und erstmals deren Einsatz als neues Trägermaterial für die Synthese von Peptiden, Peptid-Polymer-Konjugaten und Oligonucleotiden demonstriert. Unter Verwendung einer mikrowellenunterstützten Syntheseroute gelang es zunächst superparamagnetische Magnetitpartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 6 nm darzustellen. Anschließend wurde ein neu entwickelter mikrowellenunterstützter Stöber-Prozess zur Herstellung von Magnetit-Silica-Kern-Schale-Nanopartikel angewendet, welche im dritten Schritt mit Aminopropyltrimethoxysilan funktionalisiert wurden. Es wurden hochpräzise, monodisperse Kern-Schale-Nanopartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 69 nm und einem Beladungswert von 0.11 mmol/g erhalten, welche in durchgeführten Stabilitätstests hervorragende Ergebnisse zeigten und als neue Trägermaterialien für festphasengebundenen Synthesen getestet wurden. Die erforderliche Produktaufreinigung erfolgte durch ein externes Magnetfeld, durch welches die Partikel reversibel sedimentierbar sind. Erste Studien der Synthese einer 4-mer-Peptidsequenz zeigten Ausbeuten von über 70% und mit herausragender Reinheit von über 95%. Besonders eindrucksvolle Ergebnisse erzielten die Partikel bei der Synthese von Peptid-Polymer-Konjugaten, bei denen die Ligationsreaktionen mit vorher nicht dokumentierten Umsatzraten verliefen. Außerdem konnte die Anwendbarkeit bei der Synthese eines Trinucleotids nachgewiesen werden. / In 1963 Merrifield introduced the method of solid-phase supported synthesis and thus revolutionized peptide synthesis. In spite of several new developments, the main principle of established solid supports has not changed much. Still lightly cross linked poly(styrene) resins dominate the used supports. This work reports on surface amino functionalized, superparamagnetic nanoparticles with a protective silica shell to be applicable as colloidal supports for organic synthesis of peptides, peptide polymer conjugates and oligonucleotides. A microwave supported synthesis route lead to superparamagnetic magnetite particles with an average particle diameter of 6 nm. Subsequently a new developed microwave assisted Stöber process was used to build up magnetite-silica-core-shell-nanoparticles, which were functionalized in a third step with aminopropyltrimethoxysilane. Defined monodisperse core-shell nanoparticles were obtained with an average diameter of 69 nm and a concentration of free amino groups of 0.11 mmol/g, which showed excellent results in conducted stability tests and were used as new support materials for solid-supported syntheses. Convenient magnetic sedimentation proved to ensure ease of purification after each reaction step. Initial studies of a synthesis of a tetramer peptide sequence showed yields of more than 70% and an outstanding purity of more than 95%. The particles also showed impressive results in the synthesis of peptide-polymer conjugates, in which the ligation reactions proceeded conversion rates, which had not been published before. In addition, the applicability of the particles was demonstrated in the synthesis of a trinucleotide.

Das Verständnis natürlicher biologischen Materialien für die Entwicklung neuer biomimetischer Materialien ist von großem Interesse in der Chemie und den Materialwissenschaften. In vielen komplexen biomolekularen Materialien ist die Etablierung der Struktur-Funktionsbeziehungen von Proteinbausteine notwendig, um die Eigenschaften der daraus aufgebauten weichen, biologischen Materialien zu verstehen, wie z. B. die extrazelluläre Matrix. Inspiriert durch bekannte Faltungsmotive von ECM-Proteinen, wurden vereinfachte Modellpeptide entwickelt, um deren Funktion zu untersuchen oder diese als biomimetische Bausteine für synthetische Biomaterialien zu verwenden. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von hybriden Hydrogelen, die aus einem synthetischen Polymer und ECM-inspirierten Modellpeptiden zusammengesetzt sind. Insbesondere Kollagen-mimetische Peptide und Coiled-Coil-formende Peptide wurden benutzt, um das biokompatible und hydrophile Polymer Polyethyleneglykol zu vernetzen. Dabei wurde von der Fähigkeit dieser Peptide zur dynamischen Selbstassemblierung Gebrauch gemacht. Unter Verwendung von Kollagen-mimetischen Peptiden mit langsamer Dissoziationskinetik wurden Hydrogele synthetisiert, die weichen, glasartigen Materialien mit einem gestauchten exponentiellen Relaxationsverhalten entsprechen und auch einen Alterungsprozess zeigen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Netzwerkkonnektivität ein bis dato selten gebrauchter Designparameter ist, um die rheologischen Eigenschaften von Hydrogelen nach Wunsch zu kontrollieren. Die Kombination molekular einstellbarer Vernetzer mit einem Fluoreszenz-Reportersystem, welches deren Zustand auslesen kann, kann detaillierte Einblicke in das Reaktionsvermögen solcher Netzwerke auf mechanische Stimuli ermöglichen. Das Verständnis molekularer Prozesse erlaubt langfristig die Synthese von ECM-inspirierten Biomaterialien, deren Eigenschaften nach Wunsch einstellbar sind und die selbst ihren mikroskopischen und mesoskopischen Zustand anzeigen. / Understanding natural biological materials for the development of novel biomimetic materials has drawn enormous attention from the areas of chemistry and material science. In many complex biomolecular materials, establishing molecular structure-function relationships of proteins forms the basis for understanding the emerging properties of various biological soft materials, such as the extracellular matrix (ECM). Inspired by common association motifs of ECM proteins, simplified model peptides have been developed for functional studies and as biomimetic building blocks for synthetic biomaterials. The aim of this thesis was to utilize ECM-inspired and molecularly controlled model peptides for the synthesis of peptide-polymer hybrid hydrogels. Specifically, collagen-mimetic peptides (CMPs) and coiled coil (CC)-forming peptides were utilized to crosslink the biocompatible and hydrophilic polymer poly(ethylene glycol) (PEG), making use of the ability of these peptides to dynamically self-assemble. Employing CMPs with slow dissociation kinetics, hydrogels have been synthesized that resemble soft glassy materials with compressed exponential relaxation and aging. Furthermore, network connectivity has been shown to be an underutilized design parameter for tuning the rheological properties of hydrogels. Combining molecularly controlled crosslinks with a fluorescence reporter system that allows to read out crosslink status will ultimately allow for more detailed insights into the response of such networks to mechanical perturbation and thus aid the synthesis of ECM-inspired biomaterials with tunable and self-reporting properties.

Nukleinsäuretemplatkontrollierte Reaktionen, die häufig auf Ligations- oder Transferreaktionen basieren, unterliegen dem Effekt der Produktinhibierung. Dadurch können besonders niedrige Templatmengen nur schwer detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine grundlegend neue Kategorie templatkontrollierter Reaktionen etabliert werden: templatkontrollierte Spaltungsreaktionen. Dazu wurde ein spaltbarer Linker auf N-Alkylpicoliniumbasis (NAP) entwickelt, der mit einfachen, orthogonalen Konjugationsmethoden (SPAAC, Maleimid-Thiol-Konjugation oder via Amidbinungsknüpfung) sowohl in PNA- als auch in DNA-Strukturen inkludiert werden kann. Die Templat-vermittelte Photoreduktion induziert eine C-O-Bindungsspaltung des Linkers. Daraus resultieren Produkte, die eine geringere Templataffinität besitzen als das Edukt, sodass die Reaktion keiner Produktinhibierung unterliegt. Dies konnte zum Beispiel mittels Triplex-bildender, spaltbarer PNA-Sonden realisiert werden, die eine rasche Spaltungsgeschwindigkeit aufweisen. Hierzu bindet die spaltbare PNA-Sonde auf dem Templat benachbart zu einer mit einem Ruthenium(II)-Komplex modifizierten Assistenzsonde, die die Photoreduktion lichtkontrolliert induzieren kann. In einem alternativen Ansatz wurde die Fluorophor-induzierte Photolyse von NAP-Derivaten näher untersucht und führte letztlich zur Entwicklung eines selbst-spaltenden Molecular Beacons (iMB). Dieser verhält sich wie ein konventioneller iMB, wodurch eine neue Klasse an Molecular Beacons vorgestellt werden konnte. Die templatkontrollierte Photolyse konnte nicht nur in wässrigem Milieu, sondern auch in komplexen Umgebungen wie Zellkulturmedium, Zelllysat und RNA-Extrakt durchgeführt werden. / Nucleic acid templated reactions, which are often based on ligation or transfer reactions, are limited by the phenomenon of product inhibition. As a result, the usage of catalytical amounts of target are up to date only applicable to a limited extend. In this work, a fundamentally new category of nucleic acid templated reactions could be established: nucleic acid templated cleavage reactions. For this purpose, a cleavable linker based on N-alkylpicolinium (NAP) was developed, which can be included in both PNA and DNA structures using simple, orthogonal conjugation methods (SPAAC, maleimide-thiol conjugation or via amide bond formation). A template-mediated photoreduction induces the C-O bond cleavage of the linker. The target affinity of the cleavage products is lower than the parental oligonucleotide prior to cleavage, hence providing a thermodynamical driving force for amplified nucleic acid detection. This could be realized, for example, using triplex-forming, cleavable PNA probes which have a fast cleavage rate. In a first approach various triplex-forming PNA probes were developed that would undergo a photo-reductive C-O-bond cleavage upon irradiation when placed on a template adjacent to an assistant probe equipped with a sensitizer (Ruthenium(II)-complex). In an alternative approach, the fluorophore-induced photolysis of NAP derivatives was investigated and ultimately led to the development of a self-immolative Molecular Beacon (iMB). The iMB behaves like a conventional MB, therefore a new class of Molecular Beacons was introduced. The template-controlled photolysis can be performed not only in aqueous environments, but also in various complex environments such as cell culture medium, cell lysate or RNA extract.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Durchführung sowie die Untersuchung ausgewählter Verfahrenswege zur chemischen und thermischen Vernetzung von Polysacchariden und Proteinen aus nachwachsenden Rohstoffen. Darüber hinaus wurden Hypothesen zu den Anwendungsmöglichkeiten der untersuchten vernetzten Polymere erstellt. Hierfür wurden mit analytischen Methoden die physiko-chemischen sowie die technofunktionellen Eigenschaften der Rohstoffe und der vernetzten Biopolymeren untersucht. Verglichen wurden z.B. die IR-Spektren der Ausgangsmaterialien mit denen des vernetzten Biopolymers. Mittels Reaktivextrusion wurden Formkörper hergestellt, deren Eigenschaften durch den Einsatz von geeigneten Weichmachern beeinflusst werden können. Die Temperatur des Extruders sollte möglichst niedrig gehalten werden, d.h. geringer als 90 °C, um unerwünschte Bräunungsreaktionen zu vermeiden. Bei den chemischen Vernetzungen wurden fünf verschiedene Vernetzungsmittel eingesetzt: Glutaraldehyd, Maleinsäureanhydrid, Maleinsäurediethylester, Bernsteinsäureanhydrid und Methylendiphenyldiisocyanat. Die Proben aus der Vernetzung mit Glutaraldehyd weisen einen wasserbindenden Charakter auf und können beispielsweise Einsatz als Hydrogele finden. Die mit Diisocyanaten vernetzten Proben härten im Wasser und können als Füllmaterial Einsatz in der Bauindustrie finden. Aufgrund der starken Vernetzung sind die Proben unlöslich und für die meisten erfolgt der Zersetzungsprozess ab 200 °C. Im Sinne einer Werkstoffbeschreibung wurden alle Proben als Duroplaste eingestuft, da sie keine thermoplastische Eigenschaft aufweisen. Mit dieser Arbeit werden Grundlagen für die Erforschung von Verfahrenswegen für die chemische sowie für die thermische Vernetzung von Polysacchariden und Proteinen gelegt. Die gewonnenen Erkenntnisse können für weitere Arbeiten genutzt werden. / In the present work, the possibilities of conjugation or interactions between polysaccharides, especially hemicelluloses and proteins from different sources of renewable raw materials have been investigated. Sources of polysaccharides are oat spelts xylan and maize spindles. Proteins like acid casein from cow milk and cruciferin, a rapeseed protein isolate, from the canola plant have been used. For the chemical crosslinking, homo-bifunctional reagents (crosslinkers) like glutaraldehyde, maleic anhydride, maleic acid diethyl ester, succinic anhydride, and methylene diphenyl diisocyanate were used. These reagents can react with functional groups of the biopolymers- the hydroxyl groups in the hemicelluloses and amino groups in the proteins. For a thermolinked conjugation of the biopolymers, the reactive extrusion was used as mechanical technique. Both types of biopolymers were successfully blended in a mini-Extruder to form sticks. The plastics characteristics of the sticks could be influenced by the addition of suitable softeners. The extrusion temperature must be kept as low as possible, to avoid the appearance of unwanted brown reactions. To investigate the conjugation of the polysaccharides with casein or cruciferin, the IR spectra of the raw materials with those of the crosslinked biopolymers were compared. Application possibilities of the resulted crosslinked biopolymers have been proposed. Most of the samples are insoluble due to the strong networking after the crosslinking reactions. Their thermal decomposition starts at temperatures around 200 °C. All the samples have been classified as duroplasts since they do not exhibit a thermoplastic characteristic. The work complements basic research about chemical and thermal conjugation between polysaccharides and proteins from renewable raw materials.

Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.