In dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine sequenzspezifische Hybridisierung von zwei Peptid-PNA-Konjugaten an einem komplementären DNA-Templat die Bildung eines neuen Peptids auslösen kann, welches proapoptotische Eigenschaften besitzt. Dazu binden zwei kurze PNA-Oligomere an einem komplementären DNA-Templat und ermöglichen dadurch den Transfer einer Aminoacylgruppe. In den vorgestellten Untersuchungen trug ein Oligomer einen Alaninrest, welcher C-terminal als Thioester gebunden war. An das zweite PNA-Oligomer war ein Peptid mit N-terminalem Cysteinrest geknüpft. Mittels einer Cystein-vermittelten Transferreaktion wurde die Aminoacyleinheit auf das Akzeptor-Konjugat übertragen und es entstand das freie PNA-Oligomer sowie ein neues Peptid. Die so generierten Peptid-PNA-Konjugate waren so konstruiert, dass sie an BIR3 binden und damit dessen Interaktion mit Caspase-9, einem Schlüsselenzym der Apoptose, entgegenwirken konnten. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem die DNA-gesteuerte Transferreaktion mit der Aktivierung der Caspase-9 aus dem inhibitorischen Komplex mit BIR3 in HEK293-Zelllysat kombiniert wurde. Als Vorbereitung für eine intrazelluläre Anwendung der Nukleinsäuretemplat-katalysierten Peptidsynthese wurde zunächst die Stabilität der Konjugate in Zelllysat untersucht und weiterhin eine Synthesestrategie zur PEGylierung der verwendeten Peptid-PNA-Konjugate entwickelt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem DNA-gesteuerten Aminoacyltransfer zum ersten Mal eine Methode aufgezeigt wurde, welche die in Nukleinsäuren kodierte Information für die Generierung eines Wirkstoffes nutzt, der die Aktivität eines Proteins kontrollieren kann. Die Synthese des aktiven Peptidwirkstoffes gelang in der komplexen Umgebung von Zelllysat, erfolgte sequenzspezifisch und in Gegenwart substöchiometrischer Konzentrationen des Templats. / In this thesis it was investigated, whether the sequence specific hybridisation of two peptide-PNA conjugates could trigger the formation of a new peptide with proapoptotic properties. The method draws upon a nucleic acid-templated reaction, in which two short PNA oligomers bind adjacently on a complementary DNA template enabling the transfer of an amino acyl group. In the presented study one oligomer carried an alanine residue that was C-terminally attached to the PNA sequence via a thioester linkage. The second PNA oligomer conferred a peptide with an N-terminal cysteine residue and served as acceptor. In a cysteine mediated transfer reaction an amino acyl moiety was transferred to the acceptor conjugate yielding a free PNA oligomer and a new peptide. The generated peptide-PNA conjugates were designed to bind BIR3 protein and therefore interrupt its interaction with caspase-9 a key enzyme of apoptosis. In a cell free functional assay, which included recombinant BIR3 protein and HEK293 cell lysate, the peptide-PNA conjugates formed upon the DNA-triggered peptide synthesis acted as BIR3 antagonists and allowed reactivation of inhibited initiator caspase-9 as well as of the executioner caspase-3. Preliminary studies for future intracellular applications of this method included the investigation of the stability of the peptide-PNA conjugates in cell lysate and the development of a synthetic strategy for the PEGylation of the conjugates. With the DNA-triggered peptide synthesis via aminoacyl transfer we introduced a method, which allows for the translation of nucleic acid information into the output of molecules that interfere with disease-related protein-protein interactions. The synthesis of the active peptide drug proceeds sequence specifically and shows turnover in template even in a complex biomolecular environment such as cell lysate.

Das fibrillen-bildende beta2-Mikroglobulin (b2M) und das CRF1-Mimetikum mit verzweigter Rückgratstruktur können als „schwierige“ Proteine betrachtet werden, deren Darstellung sich eignet, gegenwärtige Möglichkeiten und Grenzen der Proteinsynthese zu ermitteln. Die Proteine sollen zu spektroskopischen Untersuchungen von Proteinfaltung bzw. Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Versuche zur Chemosynthese von b2M über drei Segmente führten per NCL zwar zu linearen Produkten mit korrekter Primärstruktur, aber wiederholt wurden zwei, mittels HPLC trennbare Proteine erhalten, deren enzymatische Spaltung zu identischen Fragmenten führte. Eine Isomerisierung (wie z.B. Epimerisierung) als Ursache für die Bildung der zwei Produkte konnte ausgeschlossen werden. Mittels CD- und FTIR-Spektroskopie wurden für beide Produkte beta- Faltblatt-Strukturen ermittelt, die sich sowohl untereinander als auch vom rekombinanten Protein unterschieden. Die „fehlgefalteten“ Syntheseprodukte konnten nicht entfaltet und anschließend in die „korrekte“ Struktur des rekombinanten b2M überführt werden. Es ist denkbar, dass die beobachtete „Fehlfaltung“, deren Ursache nicht geklärt werden konnte, für vom b2M ausgelöste Amyloidosen verantwortlich ist. Das CRF1-Modell, das aus drei zyklischen Peptiden und einem Protein mit Disulfidbrücken besteht, welche auf einem linearen Peptid-Templat verankert sind, wurde durch ein zyklisches Templat zur strukturellen Einschränkung modifiziert. Durch das zyklische Templat ergaben sich keine Syntheseprobleme, aber interessanterweise führte die Zyklisierung des Templats zu einer signifikant höheren Affinität für den Agonisten Urocortin-I im funktionellen Assay. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein zyklisches Rezeptor-Loop-Peptid mittels EPL im mg-Maßstab erhalten werden kann, was künftig die Synthese isotopenmarkierter Analoga für Struktur-Untersuchungen ermöglicht. / The fibril forming beta2-microglobulin (b2m) and the CRF1 mimic with branched peptide backbone could be considered as “difficult” proteins, whose synthesis is suited for determining present possibilities and limits of protein synthesis. The proteins shall be used for spectroscopic analysis of protein misfolding or ligand-receptor-interaction, respectively. Efforts of the chemosynthesis of b2m over three segments may lead via NCL to linear products with correct primary structure, but two, via HPLC isolatable proteins were repetitively susbstained, whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) as reason for the formation of the two products could be excluded. By means of CD and FTIR spectroscopy for both products beta-sheet structure were determined, which differ among themselves as well as from the recombinant protein. The “misfolded” synthetic product could not be unfolded und subsequently converted into the “correct” structure of the recombinant b2m. It is possible that the observed “misfolding”, whose cause could not be clarified, is reasonable for the amyloidosis induced by b2m. The CRF1 model that consists of three cyclic peptides and one protein with disulfid bridges coupled to a linear peptide template, was modified for structural constraints by a cyclic template. In consequence of the cyclic template no synthetic problems aroused, although the cyclisation of the template leads interestingly to a significant higher affinity for the antagonist urocortin-I in the functional assay. Furthermore, it was shown that a cyclic receptor loop peptide could be received via EPL in mg scale, what in future enables the synthesis of isotopically labeled analogs for structure investigations.

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert. / Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.

Diese Arbeit untersucht den Einfluss verschiedener physikalischer Parameter auf das Verhalten von Frequenz-abstimmbaren External-Cavity Quantenkaskadenlasern (EC-QCLs) theoretisch und experimentell. Diese beinhalten unter anderen die Antireflexschicht, die Art der Optiken, die geometrischen und die mechanisch/strukturellen Eigenschaften. Dies wurde erreicht durch Aufbau dreier sehr unterschiedlicher EC-Konfigurationen, der Diskussion und dem Vergleich ihrer Leistungsmerkmale und ihrer Vor- und Nachteile für verschiedene Anwendungen unter hauptsächlicher Verwendung von QCLs desselben Wafers der Vergleichbarkeit wegen. Für den letzten Teil dieser Arbeit wurde ein neuer Typus EC-QCL mit vielversprechenden Eigenschaften entwickelt, sodass wir glauben er hat das Potential das Littrow Design langfristig abzulösen. Dieses selbststabilisierende Design verwendet einen Retroreflektor als externen Reflektor. Für die Demonstration dieses Konzepts war die Entwicklung eines Tuning-Elements in Form eines Winkel-verstimmbaren Mittinfrarot-Bandpass-Interferenzfilters mit sehr hohem Gütefaktor vonnöten. Für das Design des Filters wurden Materialien mit sehr strengen Toleranzen bezüglich ihrer physikalischen und optischen Eigenschaften auf Basis von theoretischen Überlegungen ausgewählt und eine Fabrikationsmethode mit hochoptimierten Prozessparametern entwickelt. Die ersten Filter auf Basis von Yttriumfluorid/Yttriumoxid/Germanium/Silizium haben eine Transmissionsbandbreite von 0.14% der Zentralwellenlänge und eine maximale Transmission von etwa 60%. Die EC Konfiguration resultierte in verminderter Empfindlichkeit gegenüber Mechanischen Störungen des Reflektors um zwei Größenordnungen. Das Design behebt die grundsätzliche Limitierung des Littrow Designs bezüglich Miniaturisierung, da kein großer Strahldurchmesser vonnöten ist um kleine Bandbreiten des Littrowgitters zu erreichen. / This thesis thoroughly investigates theoretically and experimentally the effects many physical parameters have on the performance of Tunable External-Cavity Quantum-Cascade Lasers (EC-QCLs). These include, among others, the anti-reflection coating, the type of optics, and the geometrical as well as mechanical and structural properties of the EC setup. This was done by assembling three very different EC setups and comparing and discussing their performance, as well as advantages and disadvantages for different purposes using mainly QCLs from the same original wafer for better comparability. For the last part of this thesis, a new type of EC-QCL configuration was developed with properties so promising that we believe it has the potential to replace the Littrow Cavity in the long term. This is an alignment-stabilized and interference filter-tuned design using a retroreflector as the external reflector. For the demonstration of this concept, development of the tuning element in the form of an angle-tunable high-Q mid-infrared bandpass filter was necessary. For the design of the filter, materials with very strict tolerances on the physical and optical properties were selected from theoretical considerations and a fabrication method with highly optimized process parameters was developed. The first filters on the basis of yttrium fluoride/yttrium oxide/germanium/silicon have a transmission bandwidth of 0.14% of the central wavelength and a peak transmission of approximately 60%. The EC configuration resulted in a sensitivity reduction to mechanical perturbations of the reflector by two orders of magnitude, with a calculated potential for three orders of magnitude using optimized optics. This design lifts the fundamental constraint on miniaturization imposed on the Littrow design that requires large beam diameters to ensure a small bandwidth of the Littrow grating.

Obwohl Identitätsentwicklung und Ablösung-Individuation in Eltern-Kind Beziehungen als verbundene Aufgaben psychosozialer Reifung gelten, sind sie in der psychologischen Forschung relativ unabhängig voneinander behandelt worden. Darüber hinaus sind Langzeitstudien im jungen Erwachsenenalter selten, obwohl sich hier Autonomie und Identität voll entwickeln und qualitative Veränderungen in Eltern-Kind Beziehungen stattfinden. Aus diesem Grund umfasst die vorliegende Dissertation eine differenzierte, dynamisch-entwicklungsbezogene Integration von Eltern-Kind Beziehungen und Identitätsentwicklung im Übergang zum Erwachsenenalter, die sequentielle und reziproke Zusammenhänge zwischen Komponenten, Mechanismen, die diese Zusammenhänge erklären und Determinanten interindividueller Entwicklungsunterschiede beschreibt. In einer längsschnittlichen Untersuchung an Studierenden, wurden die vorgeschlagenen Zusammenhänge getestet. Zusammenhänge zwischen agentischen Eigenschaften, reifer Verbundenheit mit Eltern und Identitätssicherheit zeigten das vorhergesagte Muster reziproker Verstärkung, indiziert durch die Vorhersage eines Anstiegs in Verbundenheit durch Selbstwirksamkeitsüberzeugungen und reziproke Assoziationen zwischen Verbundenheit und Sicherheit bezüglich / Identifikation mit Identitäts-Commitments. Abgelöstheit von Eltern und Identitätsunsicherheit waren relativ unabhängig voneinander. Es wurde argumentiert, dass eine situationsspezifischere Messung eventuell stärkere Zusammenhänge hervorbringt, da stressvolle Situationen kurzfristige Selbstunsicherheiten erzeugen und Annährungsverhalten auslösen. Es wurden Vorschläge gemacht, wie zukünftige Forschung auf diesen Ergebnissen aufbauen könnte, indem sie die vorgeschlagenen Sequenzen und Mechanismen unter Nutzung von Langzeitstudien mit multiplen Messzeitpunkten über Adoleszenz und junges Erwachsenenalter hinweg testet und Eltern als interaktive Agenten mit eigenen Identitäts- und Ablösungsthematiken einbezieht. / Although identity development and separation-individuation in parent-child relationships are widely perceived as related tasks of psychosocial maturation, they have been treated relatively independently in psychological research. Furthermore, longitudinal investigations in young adulthood are very scarce although this is the age period where autonomy and personal identity fully develop and significant, qualitative changes in parent-child relationships take place. Therefore, the present dissertation covers the proposition of a differentiated, dynamic-developmental integration of parent-child relationships and identity development in the transition to adulthood that describes sequential and reciprocal associations between components of identity and relationships, mechanisms that could explain these associations, and determinants of interpersonal differences in development. In a 2-Wave longitudinal study on young adult students, the proposed longitudinal associations were tested. Associations between personal Agency, Mature Connectedness with parents, and Identity certainty showed the predicted pattern of reciprocal reinforcement, indicated by the prediction of an increase in Mature Connectedness by self-efficacy beliefs and by reciprocal associations between Mature Connectedness and certainty about and identification with identity commitments. Separateness and identity uncertainty were relatively independent. It was argued that a more situation-specific and short-termed measurement might provide stronger association because stressful situations might cause momentary self-uncertainty and trigger affiliation-seeking. Recommendations were offered on how future research might extend upon these results by testing the proposed sequences and mechanisms using longitudinal studies with multiple assessment points across the adolescent and young adult years and by incorporating parents as interactive agents with their own identity and separation issues.

Native chemische Ligation ist heutzutage die Methode der Wahl für die chemische Synthese von Proteinen. Die Voraussetzung der Methode: ein Cystein Rest am N-Terminus, gilt als größter Nachteil der Methode. N-alpha-Auxiliare werden seit mehreren Jahren als Cystein-Surrogat verwendet, um diese Einschränkungen zu überwinden. Aufgrund zahlreicher Einschränkungen haben sich die Auxiliare als Standard Methode nicht durchgesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neue Klase N-alpah-Auxiliare entwickelt. Die Auxiliare sind einfach zu synthesieren, können direkt auf den Festphasen in das Peptid eingeführt und unter milden basischen Bedingungen wieder abgespalten werden. Modelversuche wurden durchgeführt um ihr Eigenschaften hinsichtlich der native chemische Ligation und Abspaltung zu evaluieren. Daraufhin wurden die Auxiliare für die Synthese der antimikrobiellen Domäne des Dermicidin Proteins verwendet. Die chemische Ligation an der festen Phase hat in den letzten Jahren erheblich an Popularität gewonnen. Die Methode profitiert von der einfachen Reinigungseigenschaften der Festphasensynthese und erlaubt die sequenzielle Verknüpfung von mehreren Peptidfragmenten zu den gewünschten Zielproteinen mit hohen Reinheiten. Im zweiten Teil der Dissertation wurde das Konzept der chemische Festphasen Ligation mit der Hilfe eines „Second Generation“ Auxiliar über die Cysteinchemie hinaus erweitert. Durch Auxiliar-unterstüzte Festphase Ligation“ wurde die variable tandem repeats Domäne des MUC1 Proteins hergestellt. / Native chemical ligation continues to lead as the method of choice for the total chemical synthesis of proteins. Despite the methods broad use the method requirement for a terminal cysteine residue remains its biggest disadvantage. N-alpah-auxiliaries have long been used to overcome this inherent hindrance by acting as cysteine mimics. The method however has still not achieved broad use due to several key issues. In the first part of the thesis a new class of N-alpha-auxiliaries is presented. The auxiliaries are straightforwardly synthesized, readily introduced onto the peptide building blocks and cleaved under mild basic conditions. Model tests were carried out to evaluate the auxiliaries’ characteristics and their removal chemistry was developed. Finally, the auxiliary was utilized for the synthesis of the antimicrobial C-terminal domain of Dermicidine. Solid phase chemical ligation has grown in popularity in the recent years. Benefitting from the solid-phase inherent purification characteristic it allows for multiple peptide fragments to be ligated in a sequential fashion to yield the full length protein target in high purity. In the second part of the dissertation the concept of solid phase chemical ligation is expanded beyond the cysteine junction using a “second generation” auxiliary. MUC1 protein variable tandem repeats domain was synthesized using auxiliary-assisted solid phase chemical ligation.

Peptide bilden eine einzigartige Klasse von Biomolekülen. Auf Grund ihrer komplexen Struktur sind sie in der Lage hochspezifisch an Zielmoleküle zu binden und können darüber hinaus bioaktive Eigenschaften aufweisen. In dieser Dissertation wurden verschiedene Anwendungen, für die biologisch aktive Peptide genutzt werden können untersucht und darüber hinaus die Konjugation ungeschützter Peptide an funktionelle Gerüstmoleküle betrachtet. Die spezifischen Bindungseigenschaften eines Hemagglutinin bindenden Peptids konnten durch deren multivalente Präsentation auf einem Polymer-Nanopartikel genutzt werden, um einen hochwirksamen Virus-Eintritts-Blocker zu synthetisieren. Außerdem wurde in dieser Dissertation eine neuartige chemoselektive Konjugation zwischen ungeschützten zyklischen Peptiden und Proteinen erforscht, basierend auf der Staudinger Phosphonite Reaktion. Die kovalente Bindung zwischen Proteinen und Peptiden ermöglichte die zellulären Aufnahme und zytosolische Verteilung des konjugierten Proteins. Die neuartige Staudinger induzierte Thiol Addition konnte darüber hinaus für die intramolekulare Makrozyklisierung von Peptiden eingesetzt werden, wodurch die biologische Aktivität der Peptide gesteigert wurde. Dies konnte anhand von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden, als auch in der Stabilisierung der helikalen Struktur eines peptidischen Protein-Protein-Interaktions Inhibitors gezeigt werden. Des weiteren wurde eine bioreversible chemoselektive Konjugationsmethode untersucht, basierend auf der O-Alkylierung von Carbonsäuren, um eGFP mit zyklischen zellpenetrierenden Peptiden zu markieren. Erste Schritte zur Evaluierung der entstandenen Konjugate wurden unternommen. Zusammengenommen konnte die Vielfältigkeit bioaktiver Peptide in mehreren Anwendungen gezeigt werden, mit besonderem Augenmerk auf die Erweiterung der Konjugationsmethoden für ungeschützte Peptide an funktionale Trägermoleküle. / Synthetic peptides are a unique class of biomolecules. Due to their complex structure they can bind targets in a highly specific manner and can furthermore exhibit unique properties. Even though they are complex in structure, they are straightforward synthetically accessible. This thesis evolves around the many different aspects, in which biological active peptides can be used, from specific binders to cell penetration tags. Furthermore, the site specific and chemoselective conjugation of an unprotected peptide to a functional scaffold has been addressed. The binding properties of peptides could be used to generate a highly potent virus entry blocker from a viral-membrane-protein binding peptide, which was displayed multivalently on a polymeric nanoparticle. Furthermore, this thesis explored a novel chemoselective reaction, based on the Staudinger phosphonite reaction to conjugate cyclic peptides to eGFP. The covalent attachment of the peptidic ligand promoted efficiently the cellular uptake of protein and its cytosolic distribution. The novel Staudinger induced thiol addition cascade was further successfully used in an intramolecular reaction to macrocyclize peptides in order to induce bioactivity. This could be shown for the synthesis of cyclic cell penetrating peptides, as well as to stabilize the helical structure of a peptidic protein-protein interaction inhibitor. Furthermore, a bioreversible chemoselective conjugation based on a diazo building block, was used to label eGFP with cyclic cell penetrating peptides. First steps to evaluate the potency in vitro were undertaken. Taken together, the versatility of bioactive peptides was demonstrated in multiple applications and the tools to conjugate unprotected peptides to functional scaffolds was extended by the Staudinger induced thiol addition.

Die Charakterisierung der Protein-Nanopartikel-Wechselwirkungen in komplexen biomolekularen Systemen wie einer lebenden Zelle ist für die Pharma-, Medizin- und Umweltforschung von entscheidender Bedeutung. In solchen biomolekularen Systemen adsorbieren Proteine leicht auf der Oberfläche von Nanopartikeln, die die Proteinkorona bilden. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung der Proteinkorona in lebenden Zellen, wobei verschiedene analytische Ansätze kombiniert werden. Experimente mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) an reinen Proteinlösungen zeigten die Konzentrationsabhängigkeit der Protein-Gold-Nanopartikel-Wechselwirkungen, die zu unterschiedlichen SERS-Spektren führten und ermöglichten die Bestimmung von Proteinsegmenten, die an Citrat-stabilisierte Gold-Nanopartikel binden. In SERS-Experimenten mit lebenden Zellen wurde die Anwesenheit von Proteinfragmenten in der innersten Schicht der Proteinkorona, die als harte Proteinkorona bezeichnet wird, festgestellt. Eine analytische Methode, die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Hochleistungs-Flüssigchromatographie-gekoppelte Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie kombiniert, wurde entwickelt, um die Bestandteile der Hartproteinkorona zu identifizieren. Die Proteomics-, SERS- und Cryo-Soft-X-Ray-Nanotomographiedaten, wobei letztere Informationen über die dreidimensionale Ultrastruktur der Zelle liefern, zeigen den Aufnahmemechanismus, die Verarbeitung, die Akkumulationsstelle, die molekulare Umgebung und die induzierten zellulären Reaktionen internalisierter Goldnanopartikel. Diese Arbeit validiert die Verwendung von SERS bei der Analyse der Proteinkorona in der Lösung von Modellproteinen und in lebenden Zellen und präsentiert eine geeignete Methode zur Analyse der unveränderten harten Proteinkorona, die in lebenden Zellen gebildet wird. / The characterization of the protein-nanoparticle interactions in complex biomolecular systems such as a living cell is vital for pharmaceutical, medical, and environmental research fields. In such biomolecular systems, proteins readily adsorb on the surface of nanoparticles forming the protein corona. This thesis focuses on the characterization of the protein corona in living cells combining different analytical approaches. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) experiments on pure protein solutions revealed the concentration dependence of the protein-gold nanoparticle interactions resulting in different SERS spectra, and allowed for the determination of protein segments binding to citrate-stabilized gold nanoparticles. In live cell SERS experiments, the presence of protein fragments in the innermost layer of the protein corona, called the hard protein corona, was revealed. An analytical method combining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and high-performance liquid chromatography-coupled electrospray ionization mass spectrometry was developed to identify the constituents of the hard protein corona. The proteomics, SERS, and cryo soft X-ray nanotomography data, the latter providing information of the three dimensional ultrastructure of the cell, reveal the uptake mechanism, processing, accumulation site, molecular environment, and the induced cellular responses of internalized gold nanoparticles. This work validates the use of SERS in the analysis of the protein corona in the solution of model proteins and in living cells, and presents a suitable method for the analysis of the unaltered hard protein corona formed in living cells.

Kovalente posttranslationale Modifikationen (PTMs) beeinflussen die Struktur und Funktion von Proteinen. Zu den bedeutendsten PTMs zählt die Proteinphosphorylierung. Labile Phosphorylierungen an Cystein- und Lysinresten, sowie Pyrophosphorylierungen an Serin- und Threoninbausteinen sind vermehrt in den Fokus der Wissenschaft gerückt. Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Massenspektrometrie (MS) bleibt die Analyse dieser empfindlichen Modifikationen mittels Tandem-MS eine große Herausforderung. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Elektronentransferdissoziation (ETD) in Kombination mit zusätzlicher HCD Aktivierung (EThcD) in der Lage ist, Peptide mit labilen Phosphorylierungen in der Seitenkette unter Erhalt der Modifikation zu fragmentieren. In verschiedenen proteomischen Ansätzen wird demonstriert, dass EThcD eine zweifelsfreie Identifizierung natürlich vorkommender Cysteinphosphorylierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde unter dem Gesichtspunkt der Labilität von Lysinphosphorylierungen ein bottom-up-Phosphoproteomikansatz etabliert. Das MS-Verfahren beruht auf der Generierung eines diagnostischen Phospholysinimmoniumions, welches im zweiten Schritt die Erfassung eines zusätzlichen EThcD-Spektrums desselben Precursorions veranlässt (triggert). Darüber hinaus wird im Zuge dieser Arbeit gezeigt, dass sich pyrophosphorylierte Peptide unter CID-Bedingungen in ihrem Neutralverlustmuster von isobaren diphosphorylierten Peptiden unterscheiden. Dieses Verhalten stellt einen Schlüsselschritt in einer neutralverlustgetriggerten EThcD Methode dar, welche die zweifelsfreie Identifizierung von Pyrophosphorylierungen ermöglicht. Darauf basierend konnten in Hefezellen und humanen embryonalen Nierenzellen die ersten Proteinpyrophosphorylierungen, einer neuen endogenen posttranslationalen Modifikation, nachgewiesen werden. / Covalent posttranslational modifications (PTMs) influence the structure and function of proteins. Protein phosphorylations belong to the most important PTMs. Rarely characterized labile phosphorylations, for instance phosphorylations of cysteine and lysine and pyrophosphorylations of serine and threonine residues got into the focus of science. However, the analysis of those delicate modifications via tandem mass spectrometry remains a challenge. In the present work, it is shown that electron-transfer dissociation (ETD) combined with HCD supplemental activation (EThcD) is able to fragment peptides with labile phosphorylations at the side chains without losing the modification. In several bottom-up proteomic approaches, EThcD allowed the reliable identification of a naturally occurring cysteine phosphorylation. Moreover, methods for identification of lysine phosphorylations were developed. For the proteome wide analysis of lysine phosphorylations, considering the lability, a bottom-up phosphoproteomic approach with a highly selective mass spectrometry method was established. The MS-method relies on the generation of diagnostic phospholysine immonium ions during HCD, which trigger in a second step an additional EThcD spectrum of the same precursor ion. This strategy ensures the confident identification of lysine phosphorylated peptides. Furthermore, the present work shows that isobaric pyro- and diphosphorylated peptides differ in their neutral loss pattern during CID. This behavior was a key step in a specific neutral loss triggered EThcD method, which enabled the reliable identification of pyrophosphorylations. This method allowed the identification of the first protein pyrophosphorylations, a new endogenous PTM, in yeast and human embryonic kidney cells.

Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.