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Chemische Synthese & funktionelle Analyse von immobilisierten Protein-DomänenZitterbart, Robert 26 July 2017 (has links)
Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind.
In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren.
Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert. / Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks.
In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface.
By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.
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Auxiliar-vermittelte Peptidfragmentverknüpfung: Synthese und Anwendung leistungsfähiger Nα-Auxiliare für die erweiterte native chemische PeptidligationLoibl, Simon 23 January 2018 (has links)
Chemoselektive Peptidfragmentverknüpfungsmethoden sind ein zentrales Element der chemischen Peptid- und Proteinsynthese. Auf der Suche nach einem „universellen Werkzeug für die Peptidligation“ wurde in den vergangenen zwei Jahrzenten eine Vielzahl unterschiedlicher Hilfsmolekülen (Auxiliare) entwickelt. Trotz des enormen Forschungaufwandes blieben bisher verfügbare Nα-Auxiliare jedoch in ihrer Anwendung auf glycinhaltige Ligationsstellen beschränkt. Im Fall der häufig verwendeten säurelabilen Nα-Auxiliare müssen zudem starke Säuren oder Supersäuren eingesetzt werden, um das Hilfsmolekül nach der Peptidligation zu entfernen. Dabei wurde häufig die Spaltung der zuvor aufgebauten Amidbindung als unerwünschte Nebenreaktion beobachtet.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese von acht Nα-Auxiliaren erarbeitet und deren Anwendung in der erweiterten nativen chemischen Ligation untersucht. Dabei konnten sechs Hilfsmoleküle identifiziert werden, welche die Auxiliar-Abspaltung unter mild-basischen Bedingungen ermöglichten. Von besonderer Bedeutung war das 2-Mercapto-2-phenethyl-Grundgerüst, welches im Gegensatz zu bisher beschriebenen Nα-Auxiliaren erstmals den Zugang zu sterisch anspruchsvollen Verknüpfungstellen, jenseits von Glycin, gestattete. Der Nutzen des Auxiliars wurde in die chemische Totalsynthese zweier antimikrobieller Peptide demonstriert. Durch die Verwendung eines 13C-markierten Hilfsmoleküls konnte der Mechanismus der radikalischen Auxiliar-Abspaltungsreaktion in NMR-Experimenten detailliert untersucht werden. Zusätzlich wurde das 2-Mercapto-2-phenethyl-Auxiliar in einer neuen Methode der chemischen Proteinsynthese eingesetzt, welche die gewünschten Proteine ohne eine einzige HPLC-Reinigung in reiner Form lieferte. Im letzen Teil der Arbeit wurde mit dem 2-Selenol-2-phenethyl-Grundgerüst erstmals die Anwendung eines Selenol-funktionalisierten Nα-Auxiliars beschrieben. Das Hilfsmolekül ermöglichte besonders schnelle Verknüpfungsreaktionen und konnte zudem rasch mit hoher Selektivität entfernt werden. / Chemoselective ligation methods are an essential element of chemical peptide and protein synthesis. The search of a „universal tool for peptide ligation“ led to a range of different ligation auxiliaries over the last two decades. Despite the intense research in this field established Nα-auxiliaries remained limited to glycine-containing ligation sites. Furthermore, the application of frequently used acid-labile Nα-auxiliaries requires strong acids or superacids to remove the auxiliary after the ligation reaction. Under these harsh acidic conditions the cleavage of the established amide bond has been observed as an undesired side-reaction.
This work describes the synthesis of eight Nα-auxiliaries and their application in extended native chemical ligation. Six helping molecules were identified enabling auxiliary cleavage under mild-basic conditions. Perhaps most important and in contrast to previously reported Nα-auxiliaries, the 2-mercapto-2-phenethyl group facilitated access to sterically demanding ligation sites, beyond glycine. The synthetic utility of the auxiliary was demonstrated by the chemical total synthesis of two antimicrobial peptides. The application of a 13C-labelled scaffold allowed a detailled study oft the radical auxiliary cleavage reaction by NMR-spectroscopy. Additionally, the 2-mercapto-2-phenethyl auxiliary was utilised for a novel method of chemical protein synthesis, which delivered the desired proteins without a single HPLC-purification in high purity. Finally, a selenol-functionalized Nα-auxiliary is described for the first time by introducing the 2-selenol-2-phenethyl mojety. This scaffold enabled execptionally rapid peptide ligations and is readily removed with high selectivity.
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