Nukleinsäuren und Peptide erlauben es, Kontrolle über molekulare Prozesse auszuüben. In dieser Arbeit werden strukturgebende Elemente wie Coiled-Coil-Peptide oder PNA∙DNA-Strukturen genutzt, um Rezeptoren auf lebenden Zellen zu markieren und in ihrem Verhalten zu modulieren, oder cytosolische Proteine in ihrem Bindungsverhalten zu steuern. Im ersten Konzept wird die Interaktion des Coiled-Coil-Paars K3/E3 genutzt, um eine Transferreaktion, in welcher eine PNA-Sequenz vom K3-Donor auf den E3-Akzeptor übertragen wird, zu induzieren. Durch die Fusion des Akzeptorpeptids mit einem Rezeptor werden kovalente PNA-Rezeptorkonjugate auf der Oberfläche lebender Zellen geschaffen. Die Reaktion zwischen Thiol und Thioester erlaubt dabei einen schnellen Transfer. So wurden Rezeptoren aus der Familie der GPCR sowie der EGFR mit einem PNA-Strang versehen und durch fluoreszente PNA oder DNA selektiv markiert. Zusätzlich wurden verzweigte DNA-Architekturen mit mehreren Fluorophoren genutzt, um die Helligkeit der Markierung quantitativ zu erhöhen. Die PNA-EGFR-Konjugate wurden durch eine zwei Rezeptoren verbrückende Cy3-DNA adressiert und so zeitgleich markiert und dimerisiert. Dadurch wurde die Rezeptoraktivität gesteigert, was über Western Blot-, Immunofluoreszenz- und Fluoreszenzmikroskopieanalyse belegt wurde. In weiteren Ansätzen wurden Coiled-Coil-Systeme genutzt, um i) parallel zwei verschiedene Akzeptorpeptide mit verschiedenen Fluorophoren zu markieren und ii) Coiled-Coil-Peptide schaltbar zu machen. Durch die asymmetrische Verlängerung von K3/E3-Paaren mit Coiled-Coil-Sequenzen kann die Interaktion der Peptide an und aus geschaltet werden. Dies wurde sowohl in einem Fluoreszenzassay als auch in einer direkten Anwendung an der Syk-Kinase demonstriert. Die Liganden der Kinase wurden an den schaltbaren Peptiden angebracht und so die Affinität zur Syk-Kinase kontrolliert. / Nucleic acids and peptides can be used to obtain control over molecular processes within living cells. In this work, structural elements as coiled-coil peptides or PNA∙DNA-structures were used to label and modulate receptor behavior on living cells and to control ligand binding of cytosolic proteins. For the first concept the K3/E3-coiled-coil peptide pair was used to establish a proximity-guided, covalent transfer of a PNA strand from a K3-donor peptide onto the complementary E3-acceptor peptide. By fusion of the acceptor peptide to a receptor, PNA-receptor-conjugates were generated selectively on living cells. The native chemical ligation type of reaction allowed a fast PNA-transfer within minutes. Receptors from the family of GPCRs and the EGFR were tagged with a PNA-sequence and subsequently labeled by the addition of a fluorescent DNA or PNA. By recruiting branched DNA architectures which were decorated with several fluorophores, the total brightness of the labeling was increased quantitatively. A twice complementary Cy3-DNA was used to simultaneously label and dimerize the EGFR. Thereby, an artificially induced increase in receptor activity could be achieved, which was shown in Western Blot and immunofluorescence analysis as well as in fluorescence microscopy. In two other approaches coiled-coil peptides were used to i) label two different acceptor peptides simultaneously with two different dyes and ii) introduce coiled-coil peptides as part of a dynamic switchable system. Using an asymmetric coiled-coil elongation on the K3/E3 pair the interaction of both can be turned on and off. This was demonstrated in a fluorescence assay and applied to the Syk kinase, were Syk ligands were attached to the switchable peptides. Those ligands were changed from a bi- to a monovalent presentation status and thus the affinity of the Syk kinase towards its ligands can be controlled.

Um die Funktion von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen, ist es unerlässlich ihre Lokalisation und Bewegung im lebenden System durch z.B Fluoreszenz-markierung sichtbar zu machen. Eine ideale Markierungsmethode zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Zielprotein (protein of interest, POI) selektiv und in kurzer Zeit mit einer maßgeschneiderten Reportergruppe ausstattet, ohne die Proteinfunktion und -lokalisation zu beeinflussen. Dabei ist die Größe der Erkennungssequenz von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Markierungsstrategie beschrieben, bei der die Ausbildung eines parallelen Coiled-Coil-Motivs den Transfer einer Reportergruppe auslöst. Untersucht wurde dabei die Übertragung eines Sulfonat-gebundenen Fluorophors auf ein Cystein in der Erkennungssequenz durch nukleophile Substitution. Ebenfalls untersucht wurde der Transfer verschiedener Thioester-verknüpfter Reporter auf ein N-terminales Cystein der Erkennungssequenz durch eine Acyltransferreaktion. Beide Strategien zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und einen geringen Massenzuwachs am Zielprotein aus. Der Acyltransfer mit Arylthioestern zeigte zudem eine bemerkenswerte Reaktivität und erlaubte eine Markierung innerhalb weniger Minuten Reaktionszeit. Die Vielfältigkeit dieser Methode wurde anhand der Fluoreszenzmarkierung von sieben verschiedenen G-Protein gekoppelten Membranrezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen demonstriert. Die markierten Rezeptoren blieben dabei funktional und konnten ihren entsprechenden Liganden mit hoher Affinität binden. / In order to understand the function of proteins in their native environment, it is crucial to visualize their localization and trafficking in living cells by means of e.g. fluorescence labeling. An ideal labeling method adds a custom reporter group to the protein of interest (POI) in a selective and fast manner without disturbing the POIs function and localization. Hence the size of the recognition sequence is of major concern. This work describes the development of a labeling strategy in which the formation of a parallel coiled coil motif triggers the transfer of a reporter group. The transfer of a sulfonate-linked fluorescence dye onto the cysteine-modified recognition sequence via a nucleophilic substitution reaction was tested. Also the transfer of various thioester-linked reporters onto the N-terminal cysteine of the recognition sequence via an acyl transfer reaction was investigated. Both strategies are characterized by a high selectivity and low mass increase at the target protein. The acyl transfer with aryl thioesters also showed a remarkable reactivity and allowed labeling reactions to proceed within minutes. The versatility of this method was demonstrated by applying it to the labeling of seven different G-protein coupled membrane receptors on the surface of living cells. The labeled receptors remained functional and were able to bind their respective ligand with high affinity.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Das Verständnis natürlicher biologischen Materialien für die Entwicklung neuer biomimetischer Materialien ist von großem Interesse in der Chemie und den Materialwissenschaften. In vielen komplexen biomolekularen Materialien ist die Etablierung der Struktur-Funktionsbeziehungen von Proteinbausteine notwendig, um die Eigenschaften der daraus aufgebauten weichen, biologischen Materialien zu verstehen, wie z. B. die extrazelluläre Matrix. Inspiriert durch bekannte Faltungsmotive von ECM-Proteinen, wurden vereinfachte Modellpeptide entwickelt, um deren Funktion zu untersuchen oder diese als biomimetische Bausteine für synthetische Biomaterialien zu verwenden. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von hybriden Hydrogelen, die aus einem synthetischen Polymer und ECM-inspirierten Modellpeptiden zusammengesetzt sind. Insbesondere Kollagen-mimetische Peptide und Coiled-Coil-formende Peptide wurden benutzt, um das biokompatible und hydrophile Polymer Polyethyleneglykol zu vernetzen. Dabei wurde von der Fähigkeit dieser Peptide zur dynamischen Selbstassemblierung Gebrauch gemacht. Unter Verwendung von Kollagen-mimetischen Peptiden mit langsamer Dissoziationskinetik wurden Hydrogele synthetisiert, die weichen, glasartigen Materialien mit einem gestauchten exponentiellen Relaxationsverhalten entsprechen und auch einen Alterungsprozess zeigen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Netzwerkkonnektivität ein bis dato selten gebrauchter Designparameter ist, um die rheologischen Eigenschaften von Hydrogelen nach Wunsch zu kontrollieren. Die Kombination molekular einstellbarer Vernetzer mit einem Fluoreszenz-Reportersystem, welches deren Zustand auslesen kann, kann detaillierte Einblicke in das Reaktionsvermögen solcher Netzwerke auf mechanische Stimuli ermöglichen. Das Verständnis molekularer Prozesse erlaubt langfristig die Synthese von ECM-inspirierten Biomaterialien, deren Eigenschaften nach Wunsch einstellbar sind und die selbst ihren mikroskopischen und mesoskopischen Zustand anzeigen. / Understanding natural biological materials for the development of novel biomimetic materials has drawn enormous attention from the areas of chemistry and material science. In many complex biomolecular materials, establishing molecular structure-function relationships of proteins forms the basis for understanding the emerging properties of various biological soft materials, such as the extracellular matrix (ECM). Inspired by common association motifs of ECM proteins, simplified model peptides have been developed for functional studies and as biomimetic building blocks for synthetic biomaterials. The aim of this thesis was to utilize ECM-inspired and molecularly controlled model peptides for the synthesis of peptide-polymer hybrid hydrogels. Specifically, collagen-mimetic peptides (CMPs) and coiled coil (CC)-forming peptides were utilized to crosslink the biocompatible and hydrophilic polymer poly(ethylene glycol) (PEG), making use of the ability of these peptides to dynamically self-assemble. Employing CMPs with slow dissociation kinetics, hydrogels have been synthesized that resemble soft glassy materials with compressed exponential relaxation and aging. Furthermore, network connectivity has been shown to be an underutilized design parameter for tuning the rheological properties of hydrogels. Combining molecularly controlled crosslinks with a fluorescence reporter system that allows to read out crosslink status will ultimately allow for more detailed insights into the response of such networks to mechanical perturbation and thus aid the synthesis of ECM-inspired biomaterials with tunable and self-reporting properties.