In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.

Die SPOT-Synthese an Zellulosemembranen wurde 1992 als eine hocheffiziente Methode zur parallelen Synthese von Peptiden beschrieben. Die wichtigste Anwendung der so synthetisierten Verbindungen ist das direkte Festphasen-Screening. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, das Anwendungsgebiet der SPOT-Methode von Peptiden auf verschiedene Peptidmimetika auszudehnen und durch Screening entsprechender Bibliotheken bioaktive Substanzen zu identifizieren. (1) Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen Die Ähnlichkeit von Oligo-N-alkylglycinen (Peptoiden) zu Peptiden sowie die Vereinbarkeit ihrer Synthese mit den Bedingungen der SPOT-Technik ließen sie als besonders geeignete Kandidaten für eine Erweiterung der SPOT-Synthese von Peptiden auf Peptidmimetika erscheinen. Die Peptoide wurden nach der 1992 für die Synthese am Harz beschriebenen Sub-Monomer-Methode synthetisiert, bei der die N-Alkylglycin-Monomere zweistufig durch Bromacetylierung und nachfolgende Bromsubstitution durch ein primäres Amin aufgebaut werden. Die Kernaufgabe bei der Anpassung der Synthesebedingungen an Zellulosemembranen war dabei die Entwicklung einer N/O-selektiven Bromacetylierungsmethode, da die Anwesenheit freier Membran-Hydroxyfunktionalitäten ein Reagenz erfordert, welches eine N-Acylierung in Anwesenheit von O-Nukleophilen zuläßt. Durch Untersuchung mehrerer Aktivester der Bromessigsäure konnte gezeigt werden, daß der kristalline Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester im Hinblick auf Ausbeute und N/O-Selektivität optimale Eigenschaften besitzt. Im Anschluß an die Bromacetylierungsmittel wurden 46 primäre Amine auf ihre Anwendbarkeit bei der Synthese von Modell-Tripeptoiden untersucht. Aus den Ergebnissen konnten Gesetzmäßigkeiten abgeleitet werden, die eine Abschätzung der Verwendbarkeit von Aminen für die Peptoidsynthese im Hinblick auf Flüchtigkeit, sterischen Anspruch, Nukleophilie des Stickstoffatoms sowie vorhandene funktionelle Gruppen in Seitenketten ermöglichen. (2) Synthese und Screening von Peptoid-Bibliotheken Unter den optimierten Synthesebedingungen wurden zwei Bibliotheken mit jeweils 8000 Tri- bzw. Hexapeptoiden synthetisiert. Die Trimeren-Bibliothek beinhaltete dabei den gesamten Sequenzraum basierend auf 20 Bausteinen, während die Verbindungen der Hexameren-Bibliothek aus einem wesentlich größeren, auf 40 Bausteinen basierenden Sequenzraum statistisch ausgewählt wurden. Um zu überprüfen, ob sich die Bibliotheken zur "de novo" Auffindung von Protein-Liganden eignen, wurden sie auf Bindung zum monoklonalen Antikörper Tab-2 untersucht. Es konnten in beiden Fällen bioaktive Oligomere identifiziert werden (Trimere: KD >= 87 µM, Hexamere: KD >= 2.7 µM), die sich vom Peptid-Epitop des Antikörpers [VVSHFND] deutlich unterschieden. (3) Rückgratmodifizierte Peptoide Mit dem Ziel, Rückgratmodifikationen in Peptoide einzufügen, wurden neun Biselektrophile im Rahmen eines "chemischen Screenings" zur Synthese eines Modell-Trimers verwendet. Vier der Bausteine waren geeignet und ermöglichten damit die Einführung von beta-Peptoid-, m- und p-Aminomethylbenzoesäure- sowie Carbamat-Einheiten in Peptoide. Beim Versuch, in analoger Weise auch Harnstoffe zugänglich zu machen, wurde unter den Linker-Spaltungsbedingungen eine Cyclisierung zu Hydantoinen beobachtet. Diese interessante Reaktion wurde näher untersucht, um die SPOT-Methode auf die Synthese von Hydantoinen als heterocyclische Struktur zu erweitern. (4) Synthese von Hydantoinen an Zellulosemembranen Die Bildung von Hydantoinen in einer Cyclisierungsreaktion, bei der Ammoniak aus einem Amid freigesetzt wird, wurde an fester Phase noch nicht genutzt, während dieser Reaktionstyp in Lösung bereits intensiv untersucht wurde. Durch eine Optimierung der Cyclisierungsbedingungen ließ sich die zunächst unvollständige Reaktion zur Vollständigkeit bringen. Auch C-substituierte Hydantoine konnten durch Verwendung von alpha-Aminosäureamiden bzw. -tert.-butylestern enantiomerenrein zugänglich gemacht werden. / SPOT-synthesis on cellulose membranes was introduced as a highly efficient method for the parallel synthesis of peptides in 1992. The most important applications of libraries synthesized by SPOT-synthesis are solid phase binding assays. Within this work the extension of the SPOT-method to the synthesis of various peptidomimetics and the identification of bioactive substances by screening of corresponding libraries is described. (1) peptoid synthesis on cellulose membranes The similarity of oligo-N-alkylglycines (peptoids) and peptides as well as the compatibility of their synthesis with the conditions of the SPOT-technique made them ideally suited for the extension of the SPOT-synthesis from peptides to peptidomimetics. The peptoids were synthesized by the sub-monomer approach originally developed for the synthesis on standard resins in 1992. N-alkylglycine monomers are hereby synthesized in a stepwise manner by bromoacetylation and subsequent substitution of the bromine atom by a primary amine. The most critical point in the adaptation of the synthesis conditions was the development of an N/O-selective reagent for bromoacetylation due to the presence of free hydroxyl functionalities of the membrane support requiring a reagent suitable for N-acylation in the presence of O-nucleophiles. Several active esters of bromoacetic acid were synthesized and tested whereby crystalline 2,4-dinitrophenylbromoacetate gave the best results with respect to yield and N/O-selectivity. After optimization of bromoacetylation 46 primary amines were applied to the synthesis of model tripeptoids. Rules for the applicability of amines in peptoid synthesis with respect to volatility, sterical demand, nucleophilicity of the nitrogen atom and compatibility with sidechain functional groups were derived from the results. (2) synthesis and screening of peptoid libraries Two libraries consisting of 8000 tri- and hexapeptoids respectively were synthesized under optimized conditions. The library of trimers displayed the entire sequence space based on 20 building blocks, whereas the sequences of the hexamers were selected statistically from the sequence space based on 40 building blocks. In order to examine the suitability of the libraries for the "de novo" identification of protein ligands they were screened for binding to the monoclonal antibody Tab-2. Bioactive peptoids could be identified in both cases (trimers: KD >= 87 µM, hexamers: KD >= 2.7 µM) both differing significantly from the peptide epitope [VVSHFND]. (3) backbone modified peptoids In order to introduce backbone modifications into peptoids nine biselectrophiles were applied in the synthesis of model trimers in a chemical screening. Four of the building blocks were well suited allowing the incorporation of beta-peptoid, m- and p-aminomethylbenzoic acid and carbamate units into peptoids. When the introduction of urea-units in a similar approach was attempted hydantoins were formed during cleavage from the solid support. This interesting reaction was examined in detail in order to extend SPOT-synthesis to the synthesis of heterocycles. (4) synthesis of hydantoins on cellulose membranes The formation of hydantoins from terminal amides was not yet described in a solid phase synthesis, whereas it was examined intensively in solution. By optimizing the conditions of cyclization the reaction could be driven to completion. C-substituted hydantoins were obtained as single enantiomers, when alpha-amino acid-amides or -tert. butylesters were used in the synthesis.

Miesmuscheln inspirieren zur nächsten Generation von wasserbasierten Nassklebstoffen. Muschelfußproteine (mfps) ermöglichen es den Muscheln, sich an jede Oberfläche zu haften und zeigen bemerkenswerte Eigenschaften, die insbesondere durch das Aminosäurederivat 3,4 Dihydroxyphenylalanin (Dopa) verursacht werden. Da der Einfluss von Wasser nach wie vor eine große Herausforderung für Klebeanwendungen darstellt und die Herstellung und Reinigung von Klebeproteinen viel Zeit und Kosten erfordert, ist ein einfacher Zugang zu biomimetischen Klebstoffen von großem Interesse. Die vorliegende Arbeit untersucht einen neuartigen Muschel-inspirierten Polymerisationsansatz zur Herstellung von adhäsiven Proteinanaloga aus Oligopeptiden (Unimeren). Der Polymerisationsmechanismus nutzt einen Reaktionsweg, der in Miesmuscheln auftritt und beruht auf einer enzymatischen Oxidation von Tyrosin zu Dopachinon, das mit freien Thiolen aus Cystein Cysteinyldopa bildet, wodurch Unimere verknüpft und adhäsive Funktionalitäten erzeugt werden. Innerhalb weniger Minuten entstehen hochmolekulare Polymere, die ein vielseitiges Adsorptions- und starkes Adhäsionsverhalten demonstrieren. Die Proteinanaloga weisen eine signifikante Multischicht-Adsorption auf hydrophilen sowie hydrophoben Oberflächen auf und sind resistent gegenüber Spülschritten mit hochkonzentrierten Salz-Lösungen. Die beobachteten Adhäsionsenergien liegen im Bereich von kommerziellen mfp-Extrakten und überschreiten sogar berichtete Werte für isolierte mfps. Die Arbeit präsentiert eine einfache Synthese künstlicher mfp-Analoga, die in der Lage sind Aspekte natürlicher mfps nachzuahmen und potenziell zur Entwicklung von wasserresistenten Universalklebstoffen beitragen. Um die Bedingungen für eine kostengünstige, großtechnische Produktion zu verbessern, werden zusätzlich alternative Synthesewege für die enzymfreie Herstellung Muschel-inspirierter Polymere untersucht, die auf der chemischen Oxidation von Dopa-haltigen Unimeren beruhen. / Marine mussels provide inspiration for the next generation of water-based, wet adhesives. Mussel foot proteins (mfps) enable them to attach to any surface and exhibit remarkable properties, notably due to the amino acid derivative 3,4-dihydroxyphenylalanine (Dopa). Since the influence of water still constitutes a major challenge for gluing applications and large-scale production and purification of adhesive proteins is time-consuming and costly, an easy access route toward biomimetic adhesives is of high interest. This thesis investigates a novel mussel-inspired polymerization approach for the production of adhesive protein analogues from oligopeptides (unimers). The polymerization mechanism exploits a distinct reaction pathway, occurring in mussels and relies on enzyme-mediated oxidation of tyrosine to Dopaquinone in the unimers, which forms cysteinyldopa with free thiols from cysteine, thereby linking unimers and generating adhesive moieties. Within a few minutes high molecular weight polymers are obtained that show versatile adsorption and strong adhesion behaviour. The protein analogues exhibit significant multilayer adsorption onto hydrophilic as well as hydrophobic surfaces and resist rinsing with highly saline solutions. Comparative adhesion studies on silica reveal adhesion energies that are in the same range as commercial mussel foot protein extracts and even exceed reported values for isolated foot proteins that constitute the gluing interfaces. The approach offers facile access toward artificial mussel foot proteins that are capable of mimicking aspects of the natural ideal and potentially helps to develop next-generation universal water resistant glues. In order to further improve the conditions regarding cost-efficient and large-scale production in the future, alternative synthesis routes for the enzyme-free generation of mussel-inspired polymers based on chemical oxidation of Dopa containing unimers are additionally explored.

Chemoselektive Peptidfragmentverknüpfungsmethoden sind ein zentrales Element der chemischen Peptid- und Proteinsynthese. Auf der Suche nach einem „universellen Werkzeug für die Peptidligation“ wurde in den vergangenen zwei Jahrzenten eine Vielzahl unterschiedlicher Hilfsmolekülen (Auxiliare) entwickelt. Trotz des enormen Forschungaufwandes blieben bisher verfügbare Nα-Auxiliare jedoch in ihrer Anwendung auf glycinhaltige Ligationsstellen beschränkt. Im Fall der häufig verwendeten säurelabilen Nα-Auxiliare müssen zudem starke Säuren oder Supersäuren eingesetzt werden, um das Hilfsmolekül nach der Peptidligation zu entfernen. Dabei wurde häufig die Spaltung der zuvor aufgebauten Amidbindung als unerwünschte Nebenreaktion beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese von acht Nα-Auxiliaren erarbeitet und deren Anwendung in der erweiterten nativen chemischen Ligation untersucht. Dabei konnten sechs Hilfsmoleküle identifiziert werden, welche die Auxiliar-Abspaltung unter mild-basischen Bedingungen ermöglichten. Von besonderer Bedeutung war das 2-Mercapto-2-phenethyl-Grundgerüst, welches im Gegensatz zu bisher beschriebenen Nα-Auxiliaren erstmals den Zugang zu sterisch anspruchsvollen Verknüpfungstellen, jenseits von Glycin, gestattete. Der Nutzen des Auxiliars wurde in die chemische Totalsynthese zweier antimikrobieller Peptide demonstriert. Durch die Verwendung eines 13C-markierten Hilfsmoleküls konnte der Mechanismus der radikalischen Auxiliar-Abspaltungsreaktion in NMR-Experimenten detailliert untersucht werden. Zusätzlich wurde das 2-Mercapto-2-phenethyl-Auxiliar in einer neuen Methode der chemischen Proteinsynthese eingesetzt, welche die gewünschten Proteine ohne eine einzige HPLC-Reinigung in reiner Form lieferte. Im letzen Teil der Arbeit wurde mit dem 2-Selenol-2-phenethyl-Grundgerüst erstmals die Anwendung eines Selenol-funktionalisierten Nα-Auxiliars beschrieben. Das Hilfsmolekül ermöglichte besonders schnelle Verknüpfungsreaktionen und konnte zudem rasch mit hoher Selektivität entfernt werden. / Chemoselective ligation methods are an essential element of chemical peptide and protein synthesis. The search of a „universal tool for peptide ligation“ led to a range of different ligation auxiliaries over the last two decades. Despite the intense research in this field established Nα-auxiliaries remained limited to glycine-containing ligation sites. Furthermore, the application of frequently used acid-labile Nα-auxiliaries requires strong acids or superacids to remove the auxiliary after the ligation reaction. Under these harsh acidic conditions the cleavage of the established amide bond has been observed as an undesired side-reaction. This work describes the synthesis of eight Nα-auxiliaries and their application in extended native chemical ligation. Six helping molecules were identified enabling auxiliary cleavage under mild-basic conditions. Perhaps most important and in contrast to previously reported Nα-auxiliaries, the 2-mercapto-2-phenethyl group facilitated access to sterically demanding ligation sites, beyond glycine. The synthetic utility of the auxiliary was demonstrated by the chemical total synthesis of two antimicrobial peptides. The application of a 13C-labelled scaffold allowed a detailled study oft the radical auxiliary cleavage reaction by NMR-spectroscopy. Additionally, the 2-mercapto-2-phenethyl auxiliary was utilised for a novel method of chemical protein synthesis, which delivered the desired proteins without a single HPLC-purification in high purity. Finally, a selenol-functionalized Nα-auxiliary is described for the first time by introducing the 2-selenol-2-phenethyl mojety. This scaffold enabled execptionally rapid peptide ligations and is readily removed with high selectivity.

Obwohl die methodische Entwicklung der Peptidsynthese gewöhnlich eine automatisierte Herstellung erlaubt, sind für die Herstellung einer Reihe von Peptiden auch gegenwärtig Grenzen gesetzt. Einerseits kann eine im Verlauf der Kettenverlängerung auftretende Bildung intra- und /oder intermolekularer Wasserstoffbrücken zu einer begrenzten Solvatation und damit Zugänglichkeit der zu acylierenden Aminokomponente am Syntheseharz führen, andererseits kommt es beim Einbau sterisch anspruchsvoller Aminosäuren zu ungenügenden Acylierungsausbeuten. Urethangeschützte Aminosäurefluoride haben sich für den Einbau von alpha, alpha-Dialkylaminosäuren als geeignet erwiesen. Die reaktiveren urethangeschützten Aminosäurechloride sind zwar herstellbar, besitzen aber in Gegenwart einer Hilfsbase, die zum Abfangen der während ihrer Reaktion gebildeten HCl notwendig ist, eine zu geringe Stabilität (Oxazolonbildung, Abspaltung der Schutzgruppen). Erst die Verwendung von N(alpha)-Schutzgruppen, die keinen reaktionsfähigen Carbonylkohlenstoff enthalten, wie Arensulfonyl- Schutzgruppen, ermöglichen die volle Ausschöpfung der hohen Reaktivität der Aminosäurechloride. Mit Hilfe dieser Schutzgruppen gelang ein erster Vergleich der Reaktivität der Aminosäurechloride und -fluoride. Bei den durchgeführten Reaktionen wurde keine Stereomutation beobachtet. Unter Verwendung von Arensulfonylschutzgruppen war es erstmals möglich, zwei aufeinanderfolgende N-Alkyl-alpha, alpha-dialkylaminosäuren in Peptide einzubauen. Weiterhin konnten wir zeigen, daß derart geschützte Aminosäuren sich für in situ Aktivierungen mit Thionylchlorid eignen. Als Fänger für überschüssiges Aktivierungsreagenz wurden tertiäre Alkohole bzw. Amine eingesetzt. Arensulfonyl-geschützte Aminosäurechloride haben wir darüber hinaus erfolgreich in der Festphasenpeptidsynthese verwendet. In Kombination von Arensylfonyl-Schutz mit der Standard-Fmoc-Strategie gelang die Synthese eines biologisch aktiven Analogen des CRF, eines 41-mer Peptides mit einer eingefügten Tetrapeptidsequenz -Ala-MeAib-MeAib-Aib-. / Despite its wide field of application automatic peptide synthesis is still limited in certain cases. One of the limiting factors is the possibility of intra- or intermolecular hydrogen bond formation during the elongation of the peptide chain. This causes decreased solvation and thus reduced accessibility to the resin-bound amino component. Another limitation is the incorporation of sterically hindered amino acids that usually give rise to insufficient yields of acylation. Urethane protected amino acid fluorides have been shown suitable for the incorporation of alpha,alpha-dialkyl amino acids. Though the more reactive urethane protected amino acid chlorides can be readily synthesized, they do not possess the necessary stability in the presence of an auxiliary base that must be used for trapping of the hydrochloric acid formed during the reaction. Formation of oxazolons and deprotection of formerly protected functional groups would occur. Only the advent of protecting groups for the amino acid N-alpha that do not have a reactive carbonyl function - like arene sulfonyl groups - allowed to take full advantage of the high reactivity of the amino acid chlorides. These protecting groups enabled us to compare the reactivities of amino acid chlorides and fluorides for the first time. We didn't observe any stereo mutation in our experiments. The use of arene sulfonyl protecting groups permitted the consecutive incorporation of two N-alkyl-alpha,alpha-dialkyl amino acids into a peptide for the first time. Furthermore we could show, that amino acids protected in this way, are suitable for in situ activation with thionyl chloride. Tertiary alcohols and amines were used as scavenger for excessive activating reagent. Arene sulfonyl protected amino acids were also successfully used in solid phase peptide synthesis. By combining this protecting concept with the standard Fmoc approach we were able to synthesize a biologically active analogue of CRF, a peptide containing 41 residues into which we inserted the tetrapeptide Ala-MeAib-MeAib-Aib.

Antikörper und Antigen-bindende Proteine, die an Fluorophore, Tracer und Wirkstoffe konjugiert sind, sind einzigartige Moleküle, welche die Entwicklung wertvoller diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge ermöglichen. Allerdings ist der Konjugationsschritt sehr anspruchsvoll und trotz intensiver Forschung noch immer ein bedeutender Engpass. Zusätzlich sind Antigen-bindende Proteine oftmals nicht dazu in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen und im Zellinneren nicht funktionsfähig. Daher ist ihre Verwendung auf extrazelluläre Targets beschränkt, was eine bedeutende Anzahl wichtiger Antigene vernachlässigt. Beide Limitierungen bilden Kernaspekte dieser Arbeit. Mit Tub-tag labeling wurde ein neuartiges und vielseitiges Verfahren für die ortsspezifische Funktionalisierung von Biomolekülen und Antigen-bindenden Proteinen entwickelt, und so die Palette der Proteinfunktionalisierungen bedeutend erweitert. Tub-tag wurde erfolgreich für die ortsspezifische Funktionalisierung verschiedener Proteine und Antigen-bindender Nanobodies angewendet, die für konfokale Mikroskopie, Proteinanreicherung und hochauflösende Mikroskopie eingesetzt wurden. In einem weiteren Projekt wurden zellpermeable Antigen-bindende Nanobodies hergestellt und somit das schon lange Zeit bestehende Ziel, intrazelluläre Targets durch in vitro funktionalisierte Antigen-bindende Proteine zu visualisieren und manipulieren, erreicht. Hierzu wurden zwei verschiedene Nanobodies an ihrem C-Terminus cyclischen zellpenetrierenden Peptiden unter Verwendung von Expressed Protein Ligation funktionalisiert. Diese Peptide ermöglichten die Endozytose-unabhängige Aufnahme der Nanobodies mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Mit Tub-tag labeling und der Synthese von zellpermeablen Nanobodies konnten wichtige Bottlenecks im Bereich der Proteinfunktionalisierung und Antikörperforschung adressiert werden und neue Tools für die biochemische und zellbiologische Forschung entwickelt werden. / Antibodies and antigen binding proteins conjugated to fluorophores, tracers and drugs are powerful molecules that enabled the development of valuable diagnostic and therapeutic tools. However, the conjugation itself is highly challenging and despite intense research efforts remains a severe bottleneck. In addition to that, antibodies and antigen binding proteins are often not functional within cellular environments and unable to penetrate the cellular membrane. Therefore, their use is limited to extracellular targets leaving out a vast number of important antigens. Both limitations are core aspects of the presented thesis. With Tub-tag labeling, a novel and versatile method for the site-specific functionalization of biomolecules and antigen binding proteins was developed expanding the toolbox of protein functionalization. The method is based on the microtubule enzyme tubulin tyrosine ligase. Tub-tag labeling was successfully applied for the site-specific functionalization of different proteins including antigen binding nanobodies which enabled confocal microscopy, protein enrichment and super-resolution microscopy. In addition to that, cell permeable antigen binding nanobodies have been generated constituting a long thought goal of tracking and manipulating intracellular targets by in vitro functionalized antigen binding proteins. To achieve this goal, two different nanobodies were functionalized at their C-terminus with linear and cyclic cell-penetrating peptides using expressed protein ligation. These peptides triggered the endocytosis independent uptake of the nanobodies with immediate bioavailability. Taken together, Tub-tag labeling and the generation of cell-permeable antigen binding nanobodies strongly add to the functionalization of antibodies and their use in biochemistry, cell biology and beyond.