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The study reported herein concerns itself with the isolation of melaninless mutants of S. antibioticus, ATCC, 3723, and with the demonstration that at least one of the sites of mutation involves that of the enzyme, tyrosinase.

Thesis--Chemistry : Columbia : 1940.

Au cours des dernières décennies, un nombre croissant de micropolluants organiques a été détecté et quantifié dans l'environnement à de faibles concentrations échappant aux procédés conventionnels de traitement des stations d'épuration dont les effluents constituent des sources majeures de déversement. Parmi ces micropolluants bons nombres sont des molécules pharmaceutiques à structure aromatique ou phénolique. Ces molécules pharmaceutiques restent généralement biologiquement actives même dans les matrices environnementales d'où les nombreuses préoccupations au sujet de leurs risques et impacts avérés ou inconnus sur les écosystèmes et la santé. Plusieurs méthodes de traitement incluant des méthodes biologiques, adsorption, filtrations membranaires et oxydations avancées ont été expérimentées pour l'élimination de ces contaminants pharmaceutiques dans les eaux usées. Bien que dans de nombreux cas ces méthodes fournissent une efficacité élevée d'élimination des composés récalcitrants ciblés, elles génèrent souvent des sous-produits de toxicité plus élevée que le composé parent ou sont associées à des coûts élevés d'investissement ou d'exploitation. En outre, plusieurs enzymes oxydatives dont la laccase et la tyrosinase ont démontré leurs capacités à transformer des micropolluants aromatiques et phénoliques en solution en des macromolécules qui précipitent et qui peuvent être ensuite séparées de la solution. Ces deux phénoloxidases catalysent la transformation des composés phénoliques en n'utilisant que l'oxygène moléculaire comme unique cofacteur avec production d'eau. Une revue littéraire approfondie a été faite sur les caractéristiques des laccases en relation avec l'élimination des composés phénoliques en solution. Ce qui a permis de faire ressortir un consensus général exprimé chez différents auteurs sur la nécessité d'immobiliser la laccase sur des supports, de la claustrer dans des capsules ou de l'insolubiliser sous forme d'agrégats d'enzymes réticulées (cross-linked enzymes aggreagtes ou CLEAs). Cette dernière technique offr avantageusement un meilleur ratio de masse par volume de biocatalyseur tout en améliorant ses caractéristiques catalytiques. Elle permet aussi de remédier à la dilution de l'activité de l'enzyme sur le support ou dans la capsule observée avec les deux premières techniques. Finalement, une nouvelle technique d'insolubilisation en combinant deux ou plusieurs enzymes de caractéristiques différentes (combination of cross-linked enzymes aggreagtes ou combi-CLEAs) est proposée comme nouvelle approche permettant l'élimination d'une gamme de substrats plus élargie. Ainsi, la laccase fongique de la souche de Trametes versicolor (TvL) et une laccase bactérienne metzyme (MZL) ayant leur pHs optima à 4 et 8, respectivement, ont été insolubilisées sous forme de combi-CLEA. Le combi-CLEA demeure actif aussi bien en pH acide qu'alcalin. Les études de températures ont permis de déterminer que la température optimale du combi-CLEA est à 50 °C et que sa stabilité thermique est supérieure à chacune des deux laccases libres. L'application du combi-CLEA à des échantillons d'eau usée d'usine de pâte et papier a permis de réduite de 70% sa DCO totale. Finalement, le recyclage du combi-CLEA a aussi été mis en évidence par son activité résiduelle après deux cycles d'utilisation dans le traitement des échantillons de l'eau usée. Subséquemment, les caractéristiques catalytiques de la tyrosinase sont examinées et des exemples de son insolubilisation en CLEA trouvés dans la littérature sont fournis. Il apparaît aussi que plusieurs composés phénoliques et aromatiques y compris les chlorophénols, fluorophénols, les alkylphénols, les colorants azoïques ont fait l'objet d'élimination dans les eaux usées par la tyrosinase. Ceci démontre donc le fort potentiel qu'a cette enzyme aussi à éliminer les micropolluants pharmaceutiques phénoliques. Ensuite, la tyrosinase de champignon avec un pH optimum à 7 a été substituée à la MZL pour former un combi-CLEA avec la TvL. Le combi-CLEA a exhibé une grande activité enzymatique aux pH 5-8 et températures 5-30 °C, une résistance significative à la dénaturation. Aucune altération des performances catalytiques du combi-CLEA comparées à celles des enzymes libres qui la constituent n'a en outre été observée en se basant sur l'étude des paramètres cinétiques de Michaelis-Menten. L' application en mode cuvée du combi-CLEA a permis de transformer plus de 80% à près de 100% l'acetaminophène dans l'eau usée municipale et à plus de 90% dans l'eau usée hospitalière. Une étude d'identification des produits de transformation de l'acetaminophène a montré la formation de ses oligomères sous formes de dimères, trimères et tétramères due à la laccase et de 3-hydroxyacetaminophen due à la tyrosinase. Finalement, les travaux de cette thèse suggèrent un réel potentiel d'application de la laccase et de la tyrosinase insolubilisées pour l'élimination de micropolluants phénoliques dans les eaux usées.

This study reported herein involves the synthesis and determination of certain biological activities of 4,5-dihydroxy-2-pyridinealanine and the synthesis of 3-pyridine-N-methylalanine.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24482号 / 医博第4924号 / 新制||医||1063(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 岩田 想, 教授 萩原 正敏, 教授 椛島 健治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

No / Recently two alternative mechanisms have been put forward for the inhibition of tyrosinase by 6R-l-erythro 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (6BH4). Initially allosteric uncompetitive inhibition was demonstrated due to 1:1 binding of 10¿6 M 6BH4 to a specific domain 28 amino acids away from the CuA active site of the enzyme. Alternatively it was then shown that 10¿3 M 6BH4 inhibit the reaction by the reduction of the product dopaquinone back to l-dopa. In the study presented herein we have used two structural analogues of 6BH4 (i.e., 6,7-(R,S)-dimethyl tetrahydrobiopterin and 6-(R,S)-tetrahydromonapterin) confirming classical uncompetitive inhibition due to specific binding of the pyrimidine ring of the pterin moiety to the regulatory domain on tyrosinase. Under these conditions there was no reduction of l-dopaquinone back to l-dopa by both cofactor analogues. Inhibition of tyrosinase by 6BH4 occurs in the concentration range of 10¿6 M after preactivation with l-tyrosine and this mechanism uncouples the enzyme reaction producing H2O2 from O2. Moreover, a direct oxidation of 6BH4 to 7,8-dihydrobiopterin by tyrosinase in the absence of the substrate l-tyrosine was demonstrated. The enzyme was activated by low concentrations of H2O2 (<0.3 × 10¿3 M), but deactivated at concentrations in the range 0.5¿5.0 × 10¿3 M. In summary, our results confirm a major role for 6BH4 in the regulation of human pigmentation.

Tyrosinase (E.C. 1.14.18.1) is a key enzyme in the biosynthesis of melanin. The control of melanin sythesis was explored in skin melanocytes of the following strains; wild type (C57BL/6J-C/C) (which maximally synthesize melanin at normal mammalian body temperature, Himalayan (C57BL/6J-cʰ/cʰ) (which maximally synthesize melanin at temperatures below 37°C) and albino (Balb c-c/c) (a mutant which does not synthesize melanin) The effect of a-MSH on tyrosinase activity was initially investigated. A skin culture tyrosinase assay that made it possible to measure the effect of α-MSH on the activity of this enzyme in vitro was first developed. It was found that α-MSH activated the wild type and Himalayan tyrosinase in a dose-dependent manner and that this activation did not require the de novo synthesis of new enzyme. The role of glycosylation on the wild type and particularly the Himalayan tyrosinase activity was next investigated. The results do not support, but are not in conflict with the theory that the Himalayan tyrosinase is inherently underglycosylated. Translation and transcription as additional control mechanisms of tyrosinase activity was finally investigated. The correlation between the levels of tyrosinase activity, abundance of the enzyme and the synthesis of tyrosinase mRNA in wild type, Himalayan and albino mice was determined. It was shown that the levels of newly synthesized tyrosinase and tyrosinase mRNA transcripts were higher in the wild type than in the Himalayan skin. This could account for the reduced tyrosinase activity in the Himalayan mutant at normal body temperature. Low levels of tyrosinase mRNA were found in the albino skin though there was no immunodetectable enzyme in this tissue.

Analytische Chemie heute meint nicht länger nur die große Messtechnik, die zeit- und kostenintensiv ist, die außerdem nur von qualifiziertem Personal zu bedienen ist und deren Resultate nur durch dieses Personal auswertbar sind. Meist erfordert diese sagen wir 'klassische analytische Messtechnik' auch noch spezielle Räumlichkeiten und oft eine relative große Menge an speziell vorbereiteten Proben. Neben dieser klassischen analytischen Messtechnik hat sich besonders in den letzten Jahren eine auf bestimmte Stoffgruppen und Anforderungen zugeschnittene Messtechnik durchgesetzt, die oft auch durch einen Laien bedient werden kann. Meist sind es sehr kleine Geräte. Auch die benötigten Probenvolumina sind klein und eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. Ausserdem sind die Geräte einfach zu handhaben, billig sowohl in ihrer Herstellung als auch im Gebrauch und meist erlauben sie sogar eine kontinuierliche Messwerterfassung. <br /> <br /> Zahlreiche dieser in den letzten Jahren entwickelten Geräte greifen zurück auf 40 Jahre Forschung auf dem Gebiet der Biosensorik. Seit Clark und Lyons im Jahr 1962 in der Lage waren, mit einer einfachen Sauerstoffelektrode, ergänzt durch ein Enzym, Glucose zu messen, war die Entwicklung neuer Messtechnik nicht mehr aufzuhalten. Biosensoren, spezielle Messfühler, die aus einer Kombination aus biologischer Komponente (erlaubt eine spezifische Erkennung des Analyten auch ohne vorherige Reinigung der Probe) und einem physikalischen Messfühler (wandelt den primären physikochemischen Effekt in ein elektronisch messbares Signal um) bestehen, eroberten den Markt. <br /> <br /> Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Tyrosinasesensoren entwickelt, die je nach Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Tyrosinase unterschiedliche Anforderungen erfüllen. Beispielsweise wurde einer dieser Tyrosinasesensoren für die Bestimmung phenolischer Verbindungen in Fluss- und Seewasserproben eingesetzt, und die mit diesem Sensor gemessenen Ergebnisse konnten sehr gut mit dem entsprechenden DIN-Test zur Bestimmung phenolischer Verbindungen korreliert werden. Ein anderer entwickelter Sensor zeigte eine sehr hohe Empfindlichkeit für Catecholamine, Substanzen die speziell in der medizinischen Diagnostik von Wichtigkeit sind. <br /> <br /> Ausserdem zeigten die ebenfalls im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Untersuchungen zweier verschiedener Tyrosinasen, dass, will man in Zukunft noch empfindlichere Tyrosinasesensoren entwickeln, eine spezielle Tyrosinase (Tyrosinase aus Streptomyces antibioticus) die bessere Wahl sein wird, als die bisher im Bereich der Biosensorforschung verwendete Tyrosinase aus Agaricus bisporus. <br /> <br /> Desweiteren wurden erste Erfolge auf molekularbiologischem Gebiet erreicht, das heisst, dass Tyrosinasemutanten mit speziellen, vorher überlegten Eigenschaften, hergestellt werden sollen. Diese Erfolge können dazu genutzt werden, eine neue Generation an Tyrosinasesensoren zu entwickeln, Tyrosinasesensoren in denen Tyrosinase gerichtet gebunden werden kann, sowohl an den entsprechenden physikalischen Messfühler oder auch an ein anderes Enzym. Davon verspricht man sich deutlich minimierte Wege, die die zu bestimmende Substanz (oder deren Produkt) sonst zurücklegen müsste, was am Ende zu einer deutlich erhöhten Empfindlichkeit des resultierenden Biosensors führen sollte. / Today, analytical chemistry does not longer consist of only the big measuring devices and methods which are time consuming and expensive, which can furthermore only be handled by the qualified staff and in addition the results can also only be evaluated by this qualified staff. Usually, this technique, which shall be described in the following as 'classic analytic measuring technique', requires also rooms equipped especially and often a relative big quantity of the test compounds which should be prepared especially. Beside this classic analytic measuring technique, limited on definite substance groups and requests, a new measuring technique has gained acceptance particularly within the last years, which one can often be used by a layman, too. Often the new measuring technique has very little pieces of equipment. The needed sample volumes are also small and a special sample preparation isn't required. In addition, the new measuring instruments are simple to handle. They are cheap both in their production and in the use and they permit even a continuous measurement recording usually. <br /> <br /> Numerous of this new measuring instruments base on the research in the field of Biosensorik during the last 40 years. Since Clark and Lyon in the year 1962 were able to measure glucose with a simple oxygen electrode, completed by an enzyme the development of the new measuring technique did not have to be held back any longer. Biosensors, special pickups which consists of a combination from a biological component (permits a specific recognition of the analyte also without purification of the sample previously) and a physical pickup (convert the primary physicochemical effect into an electronically measurable signal), conquered the market. <br /> <br /> In the context of this thesis different tyrosinasesensors were developed which fulfilling the various requests, depending on origin and features of the used tyrosinase. One of the tyrosinasesensors for example was used for quantification of phenolic compounds in river and sea water and the results could correlated very well with the corresponding DIN-test for the determination of phenolic compounds. An other developed tyrosinasesensor showed a very high sensitiveness for catecholamines, substances which are of special importance in the medical diagnostics. <br /> <br /> In addition, the investigations of two different tyrosinases, which were carried out also in the context of this thesis, have shown, that a special tyrosinase (tyrosinase from Streptomyces antibioticus) will be the better choice as tyrosinase from Agaricus bisporus, which is used in the area of biosensor research till now, if one wants to develop in future even more sensitive tyrosinasesensors. <br /> <br /> Furthermore, first successes became reached on a molecular biological field, the production of tyrosinasemutants with special, before well-considered features. These successes can be used to develop a new generation of tyrosinasesensors, tyrosinasesensors in which tyrosinase can be bound directionally both to the corresponding physical pickup or also to another enzyme. From this one expects to achieve ways minimized which the substance to be determined (or whose product) otherwise must cover. Finally, this should result in an clearly visible increase of sensitivity of the Biosensor.