In der vorliegenden Arbeit werden drei neue Klassen von modular zugänglichen Elektrophilen für die Biokonjugation von Cystein vorgestellt. Diethynyl-phosphinate (DPs) wurden als bisreaktive Elektrophile für die cysteinselektive Markierung von Peptiden, Proteinen und Antikörpern entwickelt. In diesen Molekülen können beide elektronenarmen Dreifachbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Thiol-Nukleophilen reagieren und die erhaltenen Konjugate sind in menschlichem Plasma und in Gegenwart großer Mengen an reduziertem Glutathion stabil. Darüber hinaus wurden DPs in der selektiven Herstellung verschiedener Protein-(Doppel)-Konjugate angewandt. Neben der klassischen Proteinmodifikation können DPs auch zur kovalenten Verbrückung der Disulfidbrücken von Antikörpern eingesetzt werden. Weiters wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen werden Ethinyl-triazolyl-phosphinate (ETP) als eine neue Klasse hochreaktiver Elektrophile für die Cystein-Biokonjugation entdeckt. Die Berechnungen zeigen, dass sowohl die elektronenziehenden als auch die π-Elektronen donierenden Eigenschaften des Triazolrings die Reaktivität erhöhen. Vor allem aber wird gezeigt, dass ETP-Elektrophile über die chemoselektive Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in ein azidhaltiges Molekül eingebaut werden können. Da diese Reaktion problemlos in wässrigen Puffersystemen abläuft, konnte eine Vielzahl funktioneller Elektrophile, einschließlich elektrophiler Peptide und Proteine, aus DPs erzeugt werden. Schließlich wurden Diethinylphosphinoxide als chemoselektive Reagenzien zur Disulfidvererbrückung untersucht. Insbesondere Diethinyl-Triazolyl-Phosphinoxide (DTP) sind vielversprechende Kandidaten, da sie die modulare Synthese von ETP-Elektrophilen mit den beiden reaktiven Gruppen in DPs kombinieren. Die Fähigkeit der DTP-Reagenzien, Disulfide zu verbrücken, wurde durch die Bildung mehrerer funktioneller Antikörperkonjugate gezeigt. / The present work introduces three new classes of modular accessible electrophiles for cysteine bioconjugation. Diethynyl-phosphinates (DPs) were developed as bisreactive electrophiles for the cysteine-selective modification of peptides, proteins and antibodies. Both electrophilic alkynes can react with thiol-nucleophiles under physiological conditions. The corresponding double-conjugates are stable in human plasma and in the presence of a large excess reduced glutathione. Furthermore, the general applicability of diethynyl phosphinates for cysteine selective bioconjugation was established by the generation of various protein-(double)-conjugates and their application in cell experiments. Additionally, DPs can be employed to covalently rebridge the interchain disulfides of therapeutically relevant IgG1 antibodies. Furthermore, with the help of density functional theory based calculations, ethynyl-triazolyl-phosphinates (ETP) were discovered as a new class of highly reactive electrophilic warheads for cysteine bioconjugation. According to the calculations, both the electron withdrawing as well as the π-electron donating properties of the triazole-ring enhance the reactivity of the electrophile. Most importantly, it was demonstrated that ETP electrophiles can be incorporated into a given azide containing molecule via the chemoselective CuI-catalyzed azide alkyne cycloaddition. ETP-reagents were used to obtain functional peptide-, protein- and antibody-conjugates, as well as site-specifically linked diubiquitins. Finally, diethynyl phosphine oxides were explored as chemoselective reagents for disulfide rebridging. Especially diethynyl-triazolyl-phosphine oxides (DTP) are promising candidates since they combine the modular synthesis of ETP-electrophiles with the two reactive groups present in diethynyl phosphinates. The capability of DTP-reagents to rebridged disulfides was proven by the formation several functional antibody conjugates.

In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.