Die Wechselwirkung zwischen Kohlenhydraten und Lektinen ist relativ schwach. Dennoch ist sie in einer Fülle biologischer Prozesse von essentieller Bedeutung. Eine Verstärkung der Bindungsaffinität wird häufig durch Multivalenz, d. h. die Ausbildung mehrerer Bindungen zwischen zwei Bindungspartnern, realisiert. Neben der reinen Anzahl der präsentierten Liganden spielt jedoch auch deren Positionierung im Raum eine große Rolle. In dieser Arbeit wurde ein molekulares Lineal entwickelt, das einen modular aufgebauten PNA/DNA-Duplex als Gerüst nutzt und die Präsentation von Liganden im Raum mit atomarer Auflösung ermöglicht. Die Anzahl der präsentierten Liganden, der Abstand zwischen diesen und die Flexibilität des Gerüsts, das diese verbindet, können einerseits fein moduliert werden und sind andererseits sehr gut vorhersagbar. Mittels diverser Bindungsassays wurde zunächst gezeigt, dass das Werkzeug für die räumliche Rasterung von Kohlenhydrat-Lektin-Wechselwirkungen geeignet ist. Die ermittelten räumlichen Anordnungen der Bindungstaschen von Erythrina cristagalli Lektin (ECL) und Ricinus communis Agglutinin (RCA120) waren in Übereinstimmung mit den Kristallstrukturanalysen. Im Fall von RCA120 wurde neben den primären Bindungstaschen zudem eine potentielle sekundäre Bindungstasche identifiziert. Anschließend wurde das Werkzeug für die räumliche Rasterung eines weniger gut charakterisierten Systems verwendet. Im Detail handelte es sich um die Wechselwirkung zwischen Selektinen und seinen Liganden wie sie während der Leukozytenadhäsionskaskade infolge einer Entzündung auftritt. Als Liganden wurden das natürliche Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X und ein artifizielles DNA-Aptamer präsentiert. Dabei zeigte sich, dass der Abstand zwischen zwei bivalent präsentierten Liganden nur einen geringen Einfluss auf die Bindungsaffinität hatte. Die Selektin-Moleküle besaßen demnach eine hohe Flexibilität und/oder waren nicht absolut starr in der Membran verankert. / The interaction between carbohydrates and lectins is relatively weak. Still, it is of great importance in a plethora of biological processes. An enhancement of the binding affinity is often achieved via multivalency, i.e., the formation of several bonds between two binding partners. Besides the number of presented ligands, their spatial alignment is crucial as well. In this study, a molecular ruler was developed that utilizes a modularly assembled PNA/DNA duplex as scaffold and allows the presentation of ligands in space with atomic resolution. The number of presented ligands, the distance between them, and the flexibility of the scaffold that connects them can be nicely modulated and, at the same time, are very well predictable. By using various binding assays it was first shown that this tool is suitable for the spatial screening of carbohydrate-lectin interactions. The determined spatial alignments of the binding sites of Erythrina cristagalli lectin (ECL) und Ricinus communis agglutinin (RCA120) were in agreement with the crystal structure analyses. In addition to the primary binding sites, a potential secondary binding site was identified in the case of RCA120. Afterwards, the tool was used for the spatial screening of a system that is less well characterized. In detail, this was the interaction between selectin and its ligands as it occurs during the leukocyte adhesion cascade as a result of an inflammation. The natural tetrasaccharide sialyl-Lewis-X as well as an artificial DNA aptamer were presented as ligands. It was found that the distance between two bivalently presented ligands had only a minor effect on the binding affinity. Accordingly, the selectin molecules had a high flexibility and/or were not absolutely rigid anchored in the membrane.

In dieser Arbeit wurde die Methode der breitbandigen fs-zeitaufgelösten Fluoreszenzaufkonversionsspektroskopie (FLUPS) weiterentwickelt und vollständig theoretisch beschrieben, was anhand des Vergleichs von vorhergesagten und experimentell bestimmten photometrischen Korrekturfunktionen gezeigt werden konnte. Die Methode wurde verwendet, um lokale Fluoreszenzspektren von solvatochromen Sonden in der Nähe bestimmter Matrizes in wässrigen Lösungen zu messen. Aus der Dynamik der Stokes-Verschiebung konnte die Solvatations- bzw. Umgebungsdynamik bestimmt werden. Es wurden mittlere Solvatationszeiten τsolv von 0.57±0.06 für reines Wasser, 2.8±0.2 ps für DNA, 480±30 ps für Phospholipid-Kopfgruppen, 0.71±0.03 ps für ein Peptid (α-Helix) und 0.76±0.03 ps für eine t-Butyl-Gruppe erhalten. Hervorzuheben sind dabei die überraschend schnelle Relaxation nahe des Peptids und die sehr langsame Dynamik nahe der Lipid-Kopfgruppen, welche über 5 Größenordnungen der Zeit beobachtet wurde. Um den Einfluss einer hydrophoben Gruppe auf die Solvatationsdynamik erstmals zu aufzuzeigen, wurden präzise Messungen bei verschiedenen Temperaturen vor-genommen. Zuordnungen dieser Dynamiken zu molekularen Prozessen konnten durch Vergleiche zu MD-Simulationen durchgeführt werden. / The method of broadband fs time-resolved fluorescence upconversion spectroscopy (FLUPS) was further developed and completely theoretically described in this work. This was shown by comparing predicted and measured photometric correction functions. This method was used to obtain local fluorescence spectra of solvatochromic dyes near certain matrices in aqueous solution. From the dynamics of the Stokes-Shift the solvation or environmental dynamics respectively were obtained. Average solvation times τsolv of 0.57±0.06 for bulk water, 2.8±0.2 ps for DNA, 480±30 ps for phospholipid head groups, 0.71±0.03 ps for a peptide (α-helix) and 0.76±0.03 ps for a t-butyl group were obtained. Emphasized are the surprisingly fast dynamics near the peptide and the slow dynamics of the lipid head group region. The latter was observed over 5 orders of magnitude in time. To distinguish the influence a hydrophobic group for the first time, precise measurements at different temperatures were performed. Molecular processes were assigned to the obtained dynamics by comparisons to MD studies.

miRNA sind kurze 21 – 23 nukleotidlange nicht kodierende RNAs endogenen Ursprungs und regulieren auf post-transkriptionaler Ebene die Genexpression. Da aberrante Expressionsmuster der miRNAs im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten stehen, ist das Interesse groß, Kontrolle über die miRNA-vermittelte Genexpression zu erhalten. Bei Krankheitsbildern, die eine Überexpression der miRNA aufweisen, kann die Inhibition der miRNA Reifung als Therapieansatz dienen. Inhibition kann z. B. durch peptidische Strukturen und durch small molecules, wie Aminoglykoside erfolgen. Ziel dieser Arbeit war die nahezu vollständig festphasenbasierte Synthese von zyklischen Peptiden und Peptid-Aminoglykosid-Konjugaten als potentielle Inhibitoren der miRNA Reifung. Ferner sollte die Guanidinylierung an fester Phase mit verschiedenen Testsubstraten gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden im ersten Teilprojekt zehn zyklische Peptide mit Hilfe eines bisfunktionalen Linkermoleküls in den Seitenketten zweier im Peptid enthaltener Cysteine synthetisiert und isoliert. Basierend darauf wurden neun weitere zyklische Peptide an fester Phase synthetisiert, mit ausgewählten Aminoglykosiden in einer CuAAC gebunden und erfolgreich isoliert. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Guanidinylierung an fester Phase mittels des Goodman’s Reagent gezeigt. In ersten Studien wurden vier Testpeptide an fester Phase guanidinyliert. Im Anschluss wurde die Limitierung dieser Methode geprüft. Dazu wurden Aminoglykoside mittels CuAAC an verschiedene Peptid- und Peptid PNA-Rückgrate geknüpft und guanidinyliert. Nicht für alle Substrate konnte die vollständige Guanidinylierung an fester Phase gezeigt werden. Ein weiteres Teilprojekt zeigte die Funktionalisierung von kommerziell erhältlichen Polymeren für die SPPS in Hinsicht auf fluorophorbasierte „Hochdurchsatz Screening-Methoden“. Dazu wurde ein peptidischer Spacer entworfen, der eine Knüpfungsstelle für Fluorophore mittels CuAAC enthielt. / miRNA are short long non-coding RNAs endogenous origin with a length of 21 – 23 nucleotides. MicroRNAs regulate the gene expression on post-transcriptionally level. Starting in the nucleus, primary transcripts are processed into precursor-miRNAs. Accordingly, the miRNA matures after export into cytosol. Since aberrant expression patterns are related to different diseases, it’s from interest to gain control about miRNA mediated gene expression. Some diseases are related to over expression of miRNA. For that reason, the inhibition of the miRNA maturing is object of research. The inhibition can be resulted from peptide structures or with small molecules like aminoglycosides. Aim of this work was the solid phase synthesis of cyclic peptides derivatives and peptide aminoglycoside conjugates as potential inhibitors of the miRNA maturing. In addition, the guanidinylation on solid phase should be evidenced with different substrates. In the first part of the project ten cyclic peptides were synthesized on solid phase. The cyclization was carried out with a bifunctional linking molecule in the side chains of two cysteines. Based on that nine cyclic peptides were synthesized and elected aminoglycosides were bound with help of CuAAC. The second part of this work showed the guanidinylation on solid phase by using Goodman’s reagent under mild conditions. Four peptides were used for initial studies. Due to the success of this method the limit was evaluated. Therefore, aminoglycosides were bound via CuAAC to different peptide and peptide-PNA backbones. By mischance, not all the chosen substrates were fully guanidinylated on solid phase. A further short project showed the functionalization of commercially available resins for solid phase peptide synthesis in relation to fluorophore based high throughput screening methods. For this purpose, a peptide spacer was devised with a binding site for fluorophores via CuAAC.

Die im Jahre 1963 von Robert Bruce Merrifield vorgestellte festphasengebundene Peptidsynthese beeinflusste in hohem Maße verschiedene Bereiche der Naturwissenschaften. Doch trotz zahlreicher neuer Entwicklungen hat sich in der das Prinzip der eingesetzten Trägermaterialien nicht grundlegend geändert. Geringfügig quervernetzte Polystyrol-Harze sind immer noch die meist verwendeten Trägermaterialien in der standardisierten Peptidsynthese. In dieser Arbeit wurden superparamagnetische Kern-Schale-Nanopartikel entwickelt und erstmals deren Einsatz als neues Trägermaterial für die Synthese von Peptiden, Peptid-Polymer-Konjugaten und Oligonucleotiden demonstriert. Unter Verwendung einer mikrowellenunterstützten Syntheseroute gelang es zunächst superparamagnetische Magnetitpartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 6 nm darzustellen. Anschließend wurde ein neu entwickelter mikrowellenunterstützter Stöber-Prozess zur Herstellung von Magnetit-Silica-Kern-Schale-Nanopartikel angewendet, welche im dritten Schritt mit Aminopropyltrimethoxysilan funktionalisiert wurden. Es wurden hochpräzise, monodisperse Kern-Schale-Nanopartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 69 nm und einem Beladungswert von 0.11 mmol/g erhalten, welche in durchgeführten Stabilitätstests hervorragende Ergebnisse zeigten und als neue Trägermaterialien für festphasengebundenen Synthesen getestet wurden. Die erforderliche Produktaufreinigung erfolgte durch ein externes Magnetfeld, durch welches die Partikel reversibel sedimentierbar sind. Erste Studien der Synthese einer 4-mer-Peptidsequenz zeigten Ausbeuten von über 70% und mit herausragender Reinheit von über 95%. Besonders eindrucksvolle Ergebnisse erzielten die Partikel bei der Synthese von Peptid-Polymer-Konjugaten, bei denen die Ligationsreaktionen mit vorher nicht dokumentierten Umsatzraten verliefen. Außerdem konnte die Anwendbarkeit bei der Synthese eines Trinucleotids nachgewiesen werden. / In 1963 Merrifield introduced the method of solid-phase supported synthesis and thus revolutionized peptide synthesis. In spite of several new developments, the main principle of established solid supports has not changed much. Still lightly cross linked poly(styrene) resins dominate the used supports. This work reports on surface amino functionalized, superparamagnetic nanoparticles with a protective silica shell to be applicable as colloidal supports for organic synthesis of peptides, peptide polymer conjugates and oligonucleotides. A microwave supported synthesis route lead to superparamagnetic magnetite particles with an average particle diameter of 6 nm. Subsequently a new developed microwave assisted Stöber process was used to build up magnetite-silica-core-shell-nanoparticles, which were functionalized in a third step with aminopropyltrimethoxysilane. Defined monodisperse core-shell nanoparticles were obtained with an average diameter of 69 nm and a concentration of free amino groups of 0.11 mmol/g, which showed excellent results in conducted stability tests and were used as new support materials for solid-supported syntheses. Convenient magnetic sedimentation proved to ensure ease of purification after each reaction step. Initial studies of a synthesis of a tetramer peptide sequence showed yields of more than 70% and an outstanding purity of more than 95%. The particles also showed impressive results in the synthesis of peptide-polymer conjugates, in which the ligation reactions proceeded conversion rates, which had not been published before. In addition, the applicability of the particles was demonstrated in the synthesis of a trinucleotide.

Geringe Wasserlöslichkeiten kleiner organischer Wirkstoffkandidaten, sogenannter Leitstrukturen, sind in der Medikamentenentwicklung häufig für das Scheitern vielversprechender Projekte verantwortlich. Um diese Kandidaten dennoch zur Marktreife bringen zu können, wurden verschiedene Strategien entwickelt. Neben der kostenintensiven Strukturoptimierung rücken Formulierungsadditive in den Fokus, die in der Lage sind, Wirkstoffe zu solubilisieren, transportieren und gezielt freizusetzen. In dieser Arbeit wird eine Hochdurchsatz-Screening-Methode präsentiert, die eine schnelle und arbeitsextensive Identifizierung maßgeschneiderter Binder für wasserunlösliche, niedermolekulare Wirkstoffe ermöglicht und mithilfe derer Löslichkeitsvermittler in Form von Peptid-Polymer-Konjugaten mit definierten Solubilisierungs- und Freisetzungseigenschaften realisiert werden können. Dazu werden Peptidbibliotheken in einem zweistufigen Prozess auf Wirkstoffbindung und auf Wirkstofffreisetzung durchsucht. Das Screening kann aufgrund einer innovativen on-chip Immobilisierung der Peptidbibliothek und der intrinsischen Fluoreszenz der niedermolekularen Wirkstoffe halbautomatisiert durchgeführt werden. Vielversprechende Peptidsequenzen können anschließend direkt on-chip mittels MALDI-ToF-MS/MS bzw. fragmentierungsfrei sequenziert und löslichkeitsvermittelnde Peptid-PEG-Konjugate hergestellt werden. In einem Testsystem wurden maßgeschneiderte Peptid-PEG-Konjugate mit unterschiedlichen Freisetzungseigenschaften für einen potentiellen Alzheimer-Wirkstoff realisiert und sowohl Solubilisierungseigenschaften, als auch die Freisetzungseigenschaften in einem vereinfachten Blutplasmamodell mittels Fluoreszenzanisotropie und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie bestätigt. In Zelltests mit einer Neuro-2a-Zelllinie konnten durch Zugabe der Wirkstoff-Transporter-Komplexe effektiv die Ausbildung der bei einer Alzheimer-Erkrankung auftretenden Tau-Protein-Aggregate bis zu 55 % reduziert werden. / Low water solubility of promising small organic drugs is one of the main reasons for failures during early drug development. Solubilizers promise to overcome these difficulties by solubilization, improved transport and final release of the potential drug candidates, which may result in an approval as a commercial drug. Here, a high-throughput screening method is presented, which is capable of identifying tailor-made peptide-polymer conjugates binding small molecule drugs, which can be used to act as solubilizers with precisely defined drug uptake and release properties. The screening is based on a two-dimensional process, which in a first step identifies strong binders and in a second, characterises their drug release. Due to its innovative on-chip immobilization of the peptide library and the intrinsic fluorescence of the small molecule drugs, the screening can be performed semi-automatically. Promising peptides can be sequenced directly by on-chip fragmentation-free or via MALDI-ToF-MS/MS and subsequently peptide-PEG conjugates can be synthesized. A screening against a high potential Alzheimer´s disease drug resulted in several tailor-made peptide-PEG conjugates with various drug uptake and release characteristics, which were confirmed in additional experiments. Here, loading capacities were determined and release properties analysed with a simplified blood plasma model utilizing fluorescence anisotropy and fluorescence correlation spectroscopy. Cell tests with a Neuro-2a cell line confirmed the effectiveness of the drug-transporter aggregates by reducing the tau-protein concentration by 55 % and inhibiting their aggregation, which is one of the key issues in Alzheimer´s disease.

In der vorliegenden Arbeit diente das Kapsid der Bakteriophage Qbeta als multivalentes Gerüst und ermöglichte die Bildung eines monodispersen multivalenten Systems, welches mit Homopropargylglycin als unnatürliche Aminosäure modifiziert wurde. Das so eingeführte Alkin ermöglichte kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition zur Anbindung von Sialinsäuregrupen. Die entsprechende Synthese der hierzu kompatiblen Azid-modifizierten Sialinsäurederivate war eine der Hauptaufgaben dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurde das einfach zugängliche 5-N-Acetyladamantanylthiosialosid als Glykosylierungsdonor in der alpha-selektiven Synthese von Sialosiden evaluiert. Eine effiziente Aktivierung dieses Donors wurde unter optimierten Bedingungen bei -78°C mit N-Iodsuccinimid und Trifluormethansulfonsäure erreicht, was zu hohen alpha-Selektivitäten und Gesamtausbeuten der gewünschten Sialoside führte. Insbesondere Azidoethylenglykol-verknüpfte Sialinsäuren wurden synthetisiert, die für nachfolgende Biokonjugationsreaktionen an das Qbeta-Kapsid verwendet wurden. Die so dargestellten Sialinsäure-modifizierten Qbeta-Kapsidpartikel wurden dann eingehend mit Hilfe mehrerer biophysikalischer und biologischer Tests hinsichtlich ihrer Fähigkeit an Hämagglutinin zu binden und eine Influenza-Infektion zu inhibieren charakterisiert. Niedrige nanomolare Affinitäten wurden in diesen Assays gemessen. Eine sehr effiziente Infektionshemmung in vergleichbaren Konzentrationsbereichen konnte in einem in vitro Zell-, sowie einem in vivo Maus- als auch einem menschlichen ex vivo Modellsystem beobachtet werden. Verschiedene pathologisch relevante Influenzastämme konnten über die hier vorgestellte Strategie ebenfalls gebunden werden. Die monodisperse und definierte Struktur des Qbeta-Gerüsts erlaubte es außerdem ein theoretisches Modell der zugrundeliegenden Bindungsmodi zu erstellen. / In this thesis, the bacteriophage Qbeta capsid served as a multivalent scaffold and facilitated the generation of a monodisperse multivalent system which was modified with homopropargylglycine as an unnatural amino acid. The introduced alkyne enabled copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition to attach sialic acid groups. The corresponding synthesis of the compatible azide-modified sialic acid derivatives was one of the main tasks of this work. For this purpose, the straightforwardly accessible 5-N-acetyladamantanyl thiosialoside was evaluated as a glycosylation donor in the alpha-selective synthesis of sialosides. Efficient activation of this donor was achieved under optimized conditions at -78°C with N-iodosuccinimide and trifluoromethanesulfonic acid which led to high alpha selectivities and overall yields of the desired sialosides. Particularly azidoethylene glycol-linked sialic acids were synthesized which were used for subsequent bioconjugation reactions to the Qbeta capsid. These synthesized sialic acid-modified Qbeta capsid particles were then thoroughly characterized by multiple biophysical and biological assays regarding their ability to bind to hemagglutinin and to inhibit influenza infection. Low nanomolar affinities were measured in these assays. A very efficient infection inhibition in a comparable concentration range was observed in in vitro cellular, in vivo mouse and ex vivo human model systems. Several pathologically relevant influenza strains could also be bound with the strategy presented here. The monodisperse and defined structure of the Qbeta scaffold additionally allowed for the establishment of a theoretical model describing the underlying binding modes.

Gegenwärtig ist das Interesse und der Bedarf von Proteinbindern insbesondere in der Biotechnik und Pharmaforschung sehr groß. Kombinatorische, Partikel-basierte (One-Bead-One-Compound) Peptidbibliotheken sind eine Technik, um selektiv bindende Proteine zu identifizieren. Allerdings beinhaltet das Screening dieser Peptidbibliotheken aufwendige Schritte, wie die Separation, Sequenzierung und Charakterisierung von identifizierten Bindern. In dieser Arbeit wurde ein Chip-System entwickelt, auf dem alle Schritte eines Screenings durchgeführt werden können. Dafür wurde ein Glasobjektträger mit einem magnetisch leitenden, doppelseitigen Klebeband versehen. Die Partikel der Bibliothek wurden durch ein Sieb aufgetragen. Dies führte zu einer geordneten Immobilisierung der Partikel auf dem Chip. Über 30.000 Partikel konnten so auf einem Chip immobilisiert werden. Für die Identifizierung von selektiven Protein-bindenden Peptiden wird die immobilisierte Peptidbibliothek mit einem Fluorophor-markierten Protein inkubiert, bindende Partikel mittels Fluoreszenzscan identifiziert und die Peptidsequenz direkt auf dem Chip mittels Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-(MALDI)-Flugzeit-(TOF)-Massenspektroskopie (MS) bestimmt. Die Durchführung einer Abbruchsequenz-Methode erlaubt die eindeutige Bestimmung der Peptidsequenzen mit einer nahezu 100 % Genauigkeit. Die entwickelte Technologie wurde in einem FLAG-Peptid-Modell validiert. Bei dem Screening wurden neue anti-FLAG-Antikörper-bindende Peptide identifiziert. Anschließend wurden in einem Screening von ca. 30.000 Partikeln IgG-bindende Peptide mit mittleren mikromolaren Dissoziationskonstanten identifiziert. Für die Identifizierung stärkerer Binder wurde eine magnetische Anreicherung entwickelt, die dem Chip-Screening vorgeschaltet werden kann. Hiermit wurden aus ca. 1 Million gescreenter Partikel, Peptide mit Dissoziationskonstanten im niedrigen mikromolaren Bereich identifiziert. / The screening of one-bead-one-compound (OBOC) libraries is a well-established technique for the identification of protein-binding ligands. The demand for binders with high affinity and specificity towards various targets has surged in the biomedical and pharmaceutical field in recent years. The combinatoric peptide screening traditionally involves tedious steps such as affinity selection, bead picking, sequencing and characterization. In this thesis, a high-throughput “all-on-one chip” system is presented to avoid slow and technically complex bead picking steps. Beads of a combinatorial peptide library are immobilized on a conventional glass slide equipped with an electrically conductive tape. The beads are applied by using a precision sieve, which allows the spatially ordered immobilization of more than 30,000 beads on one slide. For the target screening, the immobilized library is subsequently incubated with a fluorophore-labeled target protein. In a fluorescence scan followed by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-time of flight (TOF) mass spectrometry (MS), high-affinity binders are directly and unambiguously sequenced directly from the bead. The use of an optimized ladder sequencing approach improved the accuracy of the de-novo sequencing step to 100 %. This new technique was validated by employing a FLAG-based model system. In a first step, new peptide binders for the M2 anti-FLAG monoclonal antibody were identified. Finally, this system was utilized to screen for IgG-binding peptides. The screening of about 30.000 peptides on one chip led to the identification of peptide binders in the mid micromolar range. A magnetic enrichment technique was developed to increase the number of screened beads. By combining the magnetic enrichment strategy with the chip system, 1 million beads were screened and IgG-binders in the low micromolar range were identified.

Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte. / Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

Smac-Mimetika (SMCs) sind eine Klasse von Tetrapeptid-abgeleiteten Medikamenten, die dem homodimeren, pro-apoptotischen Protein Smac nachempfunden sind. Sie binden und hemmen die Apoptose-Inhibitoren (IAPs), eine Klasse von anti-apoptotischen Proteinen, die von vielen medikamentenresistenten Krebszellen überexprimiert werden. In dieser Arbeit wurden Strategien zur Steigerung und Kontrolle der Aktivität von SMCs durch Konjugation an Oligonukleotide (ON) untersucht. ONs wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder das peptidbasierte Analogon Peptidnukleinsäure (PNA) bieten einzigartige Erkennungseigenschaften, die zur Detektion und/oder zur Modulation der Expression krebsspezifischer Genprodukte genutzt werden können. Letzteres kann z. B. mit Antisense-Oligonukleotiden (ASOs) erreicht werden, kurzen einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekülen, die die Translation einer komplementären Zielsequenz blockieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden Konjugate aus SMCs und ASOs auf Synergie-Effekte getestet. Viele menschliche Krebszelllinien sind gegen SMCs resistent, weil andere anti-apoptotische Proteine wie das zelluläre FLICE-ähnliche Protein (c-FLIP) als Ausfallsicherung wirken. Es konnte gezeigt werden, dass diese Resistenz durch Kupplung eines SMC an ein anti-c-FLIP ASO überwunden werden kann. Im zweiten Teil wurden kurze ON-Sonden verwendet, um ein templiertes Reaktionssystem zur gezielten Aktivierung eines SMCs in Gegenwart von X-linked Apoptose-Inhibitor (XIAP) mRNA zu erzeugen. Es wurden zwei verschiedene Ansätze untersucht: Ein templierter Acyl-Transfer, bei dem hochaffine, bivalente SMCs aus niedrig affinen, monovalenten Vorläufern erzeugt werden und eine Demaskierung der für die Bindungsaffinität von SMCs entscheidenden, N-terminalen Aminogruppe durch templierte Reduktion eines Azids. Für die zweite Strategie wurden zwei verschiedene Reaktionen verglichen, die Staudinger-Reduktion mit Phosphinen und eine katalytische Photoreduktion mit einem Ruthenium-Komplex. / Smac mimetic compounds (SMCs) are a class of tetrapeptide-derived drugs, modelled after the homodimeric, pro-apoptotic protein Smac. They bind and antagonize Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs), a class of anti-apoptotic proteins overexpressed by many drug-resistant cancer cells. In this work, strategies to enhance and control the activity of SMCs by conjugating them to oligo-nucleotides (ON) were investigated. ONs like deoxyribonucleic acid (DNA) or the peptide-based analog peptide nucleic acid (PNA) offer unique recognition properties that can be used to detect and/or modulate the expression of cancer-specific gene products. The latter can be achieved with antisense oligonucleotides (ASOs), short single-stranded DNA or RNA molecules that block the translation of a complementary sequence of interest. In the first part of this work, conjugates between SMCs and ASOs were tested for synergy. Many human cancer cell lines are resistant to SMCs because other anti-apoptotic proteins like the cellular FLICE-like protein (c-FLIP) act as a failsafe. It could be demonstrated that by joining an SMC with an anti-c-FLIP ASO this resistance can be overcome. In the second part, short ON probes were used to create a templated reaction system to conditionally activate an SMC in the presence of x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) mRNA. Two different approaches were explored: A templated acyl transfer that yields high affinity bivalent SMCs from low affinity, monovalent precursors and unmasking of the N-terminal amino group, which is crucial for the binding affinity of SMCs, by templated reduction of an azide. For the second strategy, two different chemistries were compared, Staudinger reduction with phosphines and a catalytic photoreduction using a ruthenium complex.

Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus ist eine mögliche Zielstruktur für antivirale Therapeutika. Aus der Menge experimenteller HA-Inhibitoren stechen die kürzlich beschriebenen Q-beta-Sialoside aufgrund ihrer hohen Affinität und akkuraten, multivalenten Abbildung der Rezeptorbindungsstellengeometrie hervor. Anknüpfend an diese Eigenschaften beschreibt die vorliegende Arbeit die Erweiterung der Q-beta-Sialosidplattform durch neuartige Varianten und Anwendungsgebiete. Verschiedene Strategien für die Entfernung von Lipopolysacchariden aus Kapsidproben wurden untersucht, wobei sich das Verfahren der Cloud Point als am besten geeignet herausstellte. Das gereinigte Material war geeignet für in vivo Versuche. Teilsialylierte Kaspidvarianten wurden auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und im Vergleich der Ergebnisse mit statistischen Berechnungen Hinweise auf einen vorherrschend trivalenten Bindungsmodus zwischen Q-beta-Sialosiden und HA gefunden. Die Arbeit beinhaltet die ersten Beispiele heterobifunktionaler Q-beta-Sialoside, die verschiedene Sialinsäureliganden oder Kombinationen aus Zuckern und Fluoreszenzfarbstoffen aufweisen. Die fluoreszenzmarkierten Kapside wurden in Mukus-Mobilitätsstudien angewendet und ihre Undurchgängigkeit der äußeren Mukusbarriere visualisiert. Mehrere Sialinsäureester wurden als potenzielle ladungsmaskierte Liganden für erhöhte Mukusgängigkeit untersucht. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Entwicklung eines peptidbasierten HA-Inhibitors. Eine Gruppe von aus HA-bindenden Antikörpern und Lactoferrin abgeleiteten Peptiden wurde mit Hilfe der mikroskaligen Thermophorese auf ihre Affinität zu HA oder Influenza A/X31 (H3N2) getestet. Die vorläufigen Resultate weisen auf eine gute Bindung mehrerer Kandidaten hin. Multivalente Peptid-Polymer-Konjugate wurden auf Basis von linearem Polygylcerol niedrigen Molekulargewichts synthetisiert, jedoch zeigte keines eine Inhibierung der getesteten Influenzastämme. / The influenza virus hemagglutinin (HA) attracts much attention as a target widely unexploited by licensed therapeutics. From the numerous experimental HA inhibitors, the recently reported Q-beta sialosides stand out through their affinity and accurate, multivalent reflection of the receptor binding site geometry. Building upon these characteristics, this work expands the variety of the Q-beta sialoside platform with novel variants and explores new areas of application. Several strategies were compared to remove lipopolysaccharides from capsid preparations, determining cloud point extraction as the most suitable. The purified material shown to be suitable for in vivo experiments. The inhibitory activities of partially sialylated capsids were compared to statistical models to obtain evidence for the prevalence of trivalent interactions between Q-beta sialosides and HA. Moreover, this work contains the first examples of heterobifunctional Q sialosides, bearing multiple sialic acid (SA) ligands or combinations of sugars and fluorescent dyes. Fluorescently labeled Q-beta sialosides were applied in mucus mobility studies to visualize their entrapment in the outer mucus layer. Several SA esters were examined as potential masked-charge ligands to increase mucus permeation. A second focal point of the thesis was the design of a novel, peptide-based HA inhibitor. A library of peptides derived from HA-binding antibodies and lactoferrin was investigated using microscale thermophoresis for binding to recombinant HA or influenza A/X31 (H3N2) concentrate. Preliminary results indicated good affinity for some candidates. Multivalent polymer-peptide conjugates of several peptides were synthesized by immobilization on low molecular weight linear polyglycerol. However, none of the conjugates was able to inhibit influenza strains A/X31 (H3N2) or A/PR8 (H1N1) in a hemagglutination inhibition test.