Die Mastitis beim Milchrind hat eine große ökonomische Bedeutung, daher liegt derzeit ein Forschungsschwerpunkt auf der Aktivierung und Stabilisierung der körpereigenen Abwehr zur Bekämpfung von Euterentzündungen. Besonders im peripartalen Zeitraum liegt eine Prädisposition für Infektionen vor, da eine physiologische Abwehrschwäche besteht. Daher erscheint die Förderung der Bildung von Antikörpern durch Impfungen sinnvoll. Getestet wurde der Einfluss von bestandsspezifischen E. coli-Vakzinen auf das Immunsystem, das Erregervorkommen in der Milch und die Eutergesundheit. Differenziert wurden Impfstoffe, die einerseits aus den Originalkulturen der antigenen Erreger (sogenannte large colony variants, LCV) oder aber aus den kleineren, intrazellulär persistierenden Erregern (small colony variants, SCV) hergestellt wurden. Letztlich zeigte sich bei Anwendung der Vakzinen an Milchrindern kein Unterschied zwischen LCV und SCV, bei beiden Impfstoffen war eine vakzinationsbedingte deutliche Steigerung der Antikörpertiter, welche einen Einfluss auf Erregervorkommen und Eutergesundheit hatte, erkennbar.

Die Mastitis beim Milchrind hat eine große ökonomische Bedeutung, daher liegt derzeit ein Forschungsschwerpunkt auf der Aktivierung und Stabilisierung der körpereigenen Abwehr zur Bekämpfung von Euterentzündungen. Besonders im peripartalen Zeitraum liegt eine Prädisposition für Infektionen vor, da eine physiologische Abwehrschwäche besteht. Daher erscheint die Förderung der Bildung von Antikörpern durch Impfungen sinnvoll. Getestet wurde der Einfluss von bestandsspezifischen E. coli-Vakzinen auf das Immunsystem, das Erregervorkommen in der Milch und die Eutergesundheit. Differenziert wurden Impfstoffe, die einerseits aus den Originalkulturen der antigenen Erreger (sogenannte large colony variants, LCV) oder aber aus den kleineren, intrazellulär persistierenden Erregern (small colony variants, SCV) hergestellt wurden. Letztlich zeigte sich bei Anwendung der Vakzinen an Milchrindern kein Unterschied zwischen LCV und SCV, bei beiden Impfstoffen war eine vakzinationsbedingte deutliche Steigerung der Antikörpertiter, welche einen Einfluss auf Erregervorkommen und Eutergesundheit hatte, erkennbar.

In einer sächsischen Milchviehanlage mit etwa 1800 Milchkühen, deren Tankmilchzellzahl, infolge vermehrten Auftretens von Euterinfektionen mit S. aureus als Leitkeim längerfristig über 300.000 Zellen/ml aufwies, wurden zwei Vakzinen eingesetzt. Die Erwartungshaltung lautete, dass mit den Impfungen die Inzidenz- und Prävalenzraten von S. aureus- und KNS-bedingten Mastitiden bei Färsen und bei Kühen bis zur Geburt und auch danach sinken. Es wurde vor allem erwartet, dass bei den geimpften Tieren die Zellzahlen langfristig erniedrigt bleiben und sich folglich die Eutergesundheit durch die Vakzinationen verbessert. Anhand der Gesamtgemelkszellzahlen (GZZ) der letzten drei Milchleistungsprüfungen (MLP) a. p. und der zytobakteriologischen Befunde einer Beprobung auf Viertelebene wurden die Kühe (n=416) in Statusgruppen eingeteilt. In Statusgruppe 2 befanden sich eutergesunde Kühe (n=112). Tiere (n=146) mit moderat erhöhten Viertel- (VZZ) und GZZ, die auf mindestens einem Viertel bakteriologisch positiv waren, wurden in Statusgruppe 3 zusammengefasst. Die Statusgruppe 4 bildeten Kühe (n=158), die durch stark erhöhte GZZ und VZZ charakterisiert waren und ggf. bakteriologisch positiv waren. Färsen (n=181) wurden in Statusgruppe 1 zusammengefasst. Alle Tiere mussten klinisch gesund sein, Färsen sollten eutergesund erscheinen. Als Impfstoffe wurden Startvac® (HIPRA Deutschland GmbH, Düsseldorf), eine kommerzielle Vakzine gegen S. aureus, KNS, Escherichia coli und coliforme Keime, sowie eine bestandsspezifische Vakzine (Bestvac Rind Mastitis®, IDT Biologika GmbH, Dessau-Rosslau) basierend auf S. aureus-Isolaten aus Mastitismilchen des Bestandes eingesetzt. Nach dem Zufallsprinzip wurden die Tiere innerhalb der Statusgruppen den Impfgruppen oder der Kontrollgruppe zugeteilt. Die erste Vakzination wurde einen Tag nach dem Trockenstellen vorgenommen (bei Färsen an vergleichbaren Trächtigkeitstagen), die zweite Vakzination erfolgte ca. 31 Tage vor dem errechneten Kalbedatum. Um den 53. Tag p. p. fand die dritte Impfung statt. Zytobakteriologische Beprobungen aller Tiere auf Viertelebene wurden am Tag 5 sowie am Tag 52 p. p. vorgenommen. Außerdem wurden während der Laktation die monatlichen MLP-Daten sowie jene zu tierärztlichen Behandlungen der in der Studie befindlichen Kühe sowie Abgänge und Abgangsursachen erfasst. Innerhalb der Statusgruppen gab es zwischen den Vakzinationsgruppen und den Kontrolltieren bezogen auf die VZZ zu den Beprobungszeitpunkten 5 und 52 sowie auf die GZZ aus den MLPs der gesamten Laktation keine nennenswerten Unterschiede. Die Erregerprävalenzen zu den genannten Zeitpunkten nebst deren Verlauf und jene der zytobakteriologischen Diagnosen, erbrachten nur punktuell signifikante Unterschiede, die in der Summe aber keine anhaltende Tendenz erkennen ließen, die auf das bessere Abschneiden einer Vakzinationsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe hindeuten würde. Zum gleichen Ergebnis gelangen die Auswertungen der Inzidenzraten, klinische Mastitisdaten und jene der Abgangsursachen im Anschluss an die Vakzinationen. Zusammenfassend hatte der Einsatz der bestandsspezifischen Vakzine Bestvac Rind Mastitis® sowie des Impfstoffes Startvac® mit EU-Zulassung bezogen auf die Zellzahlenentwicklung, die Inzidenz- und Prävalenzraten von S. aureus und KNS, die Behandlungsdauer und den Schweregrad von Mastitiden sowie die Heilungsraten im Vergleich zur Placebo-Gruppe in keiner der Statusgruppen erkennbare positive Effekte auf die Eutergesundheit.

Diese Arbeit beschreibt die immunologischen Eigenschaften von Acanthochilonema viteae Tropomyosin, einem Muskel-assoziierten Protein. A. viteae ist ein zu den Filarien gehörender Parasit von Gerbilen, ähnlich dem humanpathogenen Filarie Onchocercha volvulus. Diese Arbeit hatte die funktionelle Charakterisierung von A. viteae Tropomyosin im Kontext der natürlichen Infektion und experimentellen Vakzinierung zum Ziel. Das allergene Potential des Tropomyosins und die Produktion von spezifischen IgE-Antikörpern wurden untersucht. Außerdem wurden Tropomyosin-spezifische monoklonale Antikörpern (mAk) entwicklet. Es konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin als vielversprechender Kandidat zur Vakzinentwicklung gegen Filariosen angesehen werden kann, wobei berücksichtigt werden muss, dass deutliche Effekte nur unter Th1-Bedingungen auftreten. Die Vakzinierung mit Protein oder DNA reduzierte Adultwurmzahlen um 30 bzw. 45%. Während einer Infektion fungiert Tropomyosin als funktionelles Allergen und führt zur Produktion von hohen Mengen spezifischen IgEs. Ein Screening synthetischer Peptid-Bibliotheken zeigte gemeinsame 13 IgG- und 11 IgE-Epitope. Weiters konnte Kreuzreaktivität mit anderen Tropomyosinen und diesen gemeinsamen IgE-Epitopen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von mAk konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin auf der Oberfläche der Kutikula der Larvenstadien L3 und microfilariae des Parasiten vorkommt. Durch die Deglykosylierung des nativen Proteins wurde deutlich, dass einige Epitope von posttranslationellen Modifikationen gebildet werden. Weitere Immunisierungen mit Tropomyosin führten zu einem ähnlichen Profil der Zellaktivierung und Antikörperproduktion wie der Adjuvant Aluminiumhydroxid. Jedoch führte die Behandlung zur IL-10 Produktion und zur Zunahme von Gr1+/ CD11b+ Zellpopulationen, welche natürliche Surpressors darstellen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass A. viteae Tropomyosin immunmodulierende Eigenschaften aufweist und als Komponente eines zu entwickelnden Vakzins in Frage kommt. / This study describes the immunological properties of Acanthocheilonema viteae muscle-associated protein tropomyosin. A. viteae is a filarial parasite of jirds that resembles the important human parasite Onchocerca volvulus. Focus of experiments is on unraveling the functional properties of tropomyosin in the context of an infection and experimental vaccination. Additionally, allergenic potential of tropomyosin was investigated and the ability to induce high levels of specific IgE. A part of the study was also aimed at the development of anti-tropomyosin monoclonal antibodies (mAb). This study revealed that tropomyosin is a promising antigen for vaccines against filarial nematodes, however, effective only in a Th1 biased environment. Vaccination with protein or DNA resulted in 30% - 45% protection that was not associated with specific IgG or IgE. During infection tropomyosin is an allergen and leads to the production of high levels of specific IgE. Screening of synthetic peptide libraries showed 13 IgG and 11 IgE co-located epitopes and revealed cross-reactivity with other tropomyosins and sharing of IgE epitopes. mAb were raised against A. viteae tropomyosin and showed that tropomyosin is abundant on the cuticle of L3 and microfilariae of the parasite. Deglycosylation of the native protein showed that some epitopes were formed by the posttranslational modifications. Additionally, immunization shows that tropomyosin induces a similar pattern of cell activation and antibody production as aluminium hydroxide adjuvant, but leads to the induction of IL-10 and the increase of population of GR1+/CD11b+ cells. These cells are regarded as natural suppressors. Taken together, results show that A. viteae tropomyosin has immunomodulating properties and can be considered as a component of an efficient vaccine.

Gingipaine sind Cysteinproteinasen des wohl in Ätiologie und Pathogenese der chronischen Erwachsenenparodontitis bedeutsamsten bakteriellen Erregers und zugleich die wichtigsten Virulenzfaktoren der Spezies Porphyromonas gingivalis. Die für diese extrazellulären Produkte kodierenden Gene sind rgpA, rgpB und kgp. Deren Produkte sind entsprechend HRgpA, RgpB und Kgp. HRgpA und RgpB verursachen eine Steigerung der Gefäßpermeabilität durch die Aktivierung des Kallikrein/Kinin-Systems und aktivieren die Blutgerinnung, welche potentiell mit der Synthese der Sulkusflüssigkeit und dem Fortschreiten der Entzündung bis hin zum Verlust des alveolären Knochens assoziiert sind. Offenbar wird dieses durch die Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen begünstigt. Kgp ist von den dreien die potenteste fibrinogen-und fibrinabbauende Proteinase und bei der Blutungsneigung der erkrankten Stellen involviert. HRgpA aktiviert besonders Blutgerinnungsfaktoren. Gingipaine stören das Komplementsystem und manipulieren den Zytokinhaushalt der Entzündungskaskaden. Die Gingipaine unterstützen die Kolonisierung von P. gingivalis durch die Bindung zu anderen Bakterien des subgingivalen Biofilms und der Bindung zu epithelialen Zellen. Sie vermögen an Laminin, Fibrinogen, Fibronektin, Hämoglobin und an manchen Typen von Kollagen zu binden. Alle können den Rezeptor CD14 auf Makrophagen abbauen und so die Leukozytenaktivierung hemmen. Sie regulieren die Infektionsintensität, den Bakterienhaushalt, die Aminosäurenaufnahme aus Wirtsproteinen und die Fimbrienreifung. Die Genetik, die Chemie und die virulenzverursachenden Eigenschaften der Gingipaine stehen seit Mitte der 90iger Jahre des letzten Jahrhunderts im Blickpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Pathogenese der Parodontitis und der mikrobiellen Infektion sind die Gingipaine Ziele für die mögliche Entwicklung von Hemmstoffen respektive für Immunisierungsstrategien gegen die chronische Parodontitis. / Gingipains are cysteine proteases of the probably most important bacterial pathogen of the adult periodontitis in the field of etiology as well as pathology. At the time, they are the most important virulence factors of the species Porphyromonas gingivalis. The encoding genes of this extracellular products are rgpA, rgpB and kgp. Their products are corresponding HRgpA, RgpB and Kgp. HRgpA and RgpB induce vascular permeability enhancement through activation of the kallikrein/kinin system and activate the blood coagulation, processes potentially associated with gingival crevicular fluid synthesis and progression of inflammation which ultimately can lead to alveolar bone loss. Obviously, this will be favoured by matrix metalloproteinases. Kgp is the most potent fibrinogen/fibrin degrading enzyme of the three gingipains involved in the bleeding tendency at the diseased sites. HRgpA especially activates coagulation factors. Gingipains disturb the complement system and manipulate the cytokine network of the inflammation cascades. Gingipains support colonizing of P. gingivalis due to their connection to other bacteria of the subgingival biofilm and to epithelial cells. They are able to bind to laminin, fibrinogen, fibronectin, hemoglobin and some types of collagen. All of them are able to degrade macrophage CD14 receptor, thus preventing activation of the leukocytes. They regulate the intensity of infection and the bacterial housekeeping, including amino acid uptake from host proteins and fimbriae maturation. Genetics, chemistry and the virulence inducing properties of gingipains are the focus of scientific attention since the middle of the nineties of the last century. Due to their key role in pathogenesis of periodontitis and microbial infection the gingipains are targets for the possible development of inhibitory substances, respectively for immunization strategies against chronic periodontitis.

Gingipaine sind Cysteinproteinasen des wohl in Ätiologie und Pathogenese der chronischen Erwachsenenparodontitis bedeutsamsten bakteriellen Erregers und zugleich die wichtigsten Virulenzfaktoren der Spezies Porphyromonas gingivalis. Die für diese extrazellulären Produkte kodierenden Gene sind rgpA, rgpB und kgp. Deren Produkte sind entsprechend HRgpA, RgpB und Kgp. HRgpA und RgpB verursachen eine Steigerung der Gefäßpermeabilität durch die Aktivierung des Kallikrein/Kinin-Systems und aktivieren die Blutgerinnung, welche potentiell mit der Synthese der Sulkusflüssigkeit und dem Fortschreiten der Entzündung bis hin zum Verlust des alveolären Knochens assoziiert sind. Offenbar wird dieses durch die Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen begünstigt. Kgp ist von den dreien die potenteste fibrinogen-und fibrinabbauende Proteinase und bei der Blutungsneigung der erkrankten Stellen involviert. HRgpA aktiviert besonders Blutgerinnungsfaktoren. Gingipaine stören das Komplementsystem und manipulieren den Zytokinhaushalt der Entzündungskaskaden. Die Gingipaine unterstützen die Kolonisierung von P. gingivalis durch die Bindung zu anderen Bakterien des subgingivalen Biofilms und der Bindung zu epithelialen Zellen. Sie vermögen an Laminin, Fibrinogen, Fibronektin, Hämoglobin und an manchen Typen von Kollagen zu binden. Alle können den Rezeptor CD14 auf Makrophagen abbauen und so die Leukozytenaktivierung hemmen. Sie regulieren die Infektionsintensität, den Bakterienhaushalt, die Aminosäurenaufnahme aus Wirtsproteinen und die Fimbrienreifung. Die Genetik, die Chemie und die virulenzverursachenden Eigenschaften der Gingipaine stehen seit Mitte der 90iger Jahre des letzten Jahrhunderts im Blickpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Pathogenese der Parodontitis und der mikrobiellen Infektion sind die Gingipaine Ziele für die mögliche Entwicklung von Hemmstoffen respektive für Immunisierungsstrategien gegen die chronische Parodontitis.:Erklärungen I Genehmigungsvermerk II Inhaltsverzeichnis III 1. Einleitung und Fragestellung 4 1.1 Parodontitis 4 1.1.1 Epidemiologie 4 1.1.2 Klassifikation 4 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 5 1.1.4 Mikrobiologie 7 1.1.5 Biofilm 8 1.2 Porphyromonas gingivalis 10 1.3 Verwandtschaftsverhältnisse von P. gingivalis 12 1.4 Mit P. gingivalis assoziierte Proteinasen 15 1.5 Fragestellung 16 2. Material und Methoden 17 3. Ergebnisse und Diskussion 18 3.1 Einführung – Gingipaine als Enzyme von P. gingivalis 18 3.1.1 Definition der Gingipaine 18 3.1.2 RgpA- und RgpB-Gen-Gingipaine 19 3.1.3 Kgp-Gen-Gingipain 20 3.2 Bedeutung der Gingipaine für die Pathogenität von P. gingivalis 21 3.2.1 Gingipaine und fimbrienvermittelte Adhäsion, intrazelluläre Invasion und parazellulärer Pfad von P. gingivalis 21 3.2.2 Effekte auf die Integrität des Bindegewebes 24 3.2.3 Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems 25 3.2.4 Aktivierende Einflüsse auf das Gerinnungssystem 27 3.2.5 Hemmende Einflüsse auf das Fibrinogen-Fibrin-System 28 3.2.6 Beeinträchtigung der Immunabwehr des Wirts 28 3.3 Gingipaine im biochemischen Regulationsmechanismus von P. gingivalis 35 3.3.1 Die Rolle des proteolytischen Systems von P. gingivalis beim Nährstofferwerb 35 3.3.2 Gingipainreifung und die Steuerung des intrazellulären Haushalts von P. gingivalis 39 3.3.3 Regulation der Proteinaseexpression von P. gingivalis 40 3.3.4 Gingipaine als bakterielle Hämagglutinine, Adhäsine und hämoglobinbindende Proteine 42 3.3.5 Proteinasegenmutationen bei P. gingivalis und ihre enzymatische Aktivität 42 3.4 Gingipaine und systemische Effekte 44 3.5 Synergismen mit anderen Spezies und quorum sensing 45 3.6 Hemmstoffe der Gingipaine 46 3.7 Immunisierung gegen Gingipaine 48 4. Zusammenfassung / Summary 52 5. Literaturverzeichnis 53 Anhang 87 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 87 Danksagung 88 Lebenslauf 89 / Gingipains are cysteine proteases of the probably most important bacterial pathogen of the adult periodontitis in the field of etiology as well as pathology. At the time, they are the most important virulence factors of the species Porphyromonas gingivalis. The encoding genes of this extracellular products are rgpA, rgpB and kgp. Their products are corresponding HRgpA, RgpB and Kgp. HRgpA and RgpB induce vascular permeability enhancement through activation of the kallikrein/kinin system and activate the blood coagulation, processes potentially associated with gingival crevicular fluid synthesis and progression of inflammation which ultimately can lead to alveolar bone loss. Obviously, this will be favoured by matrix metalloproteinases. Kgp is the most potent fibrinogen/fibrin degrading enzyme of the three gingipains involved in the bleeding tendency at the diseased sites. HRgpA especially activates coagulation factors. Gingipains disturb the complement system and manipulate the cytokine network of the inflammation cascades. Gingipains support colonizing of P. gingivalis due to their connection to other bacteria of the subgingival biofilm and to epithelial cells. They are able to bind to laminin, fibrinogen, fibronectin, hemoglobin and some types of collagen. All of them are able to degrade macrophage CD14 receptor, thus preventing activation of the leukocytes. They regulate the intensity of infection and the bacterial housekeeping, including amino acid uptake from host proteins and fimbriae maturation. Genetics, chemistry and the virulence inducing properties of gingipains are the focus of scientific attention since the middle of the nineties of the last century. Due to their key role in pathogenesis of periodontitis and microbial infection the gingipains are targets for the possible development of inhibitory substances, respectively for immunization strategies against chronic periodontitis.:Erklärungen I Genehmigungsvermerk II Inhaltsverzeichnis III 1. Einleitung und Fragestellung 4 1.1 Parodontitis 4 1.1.1 Epidemiologie 4 1.1.2 Klassifikation 4 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 5 1.1.4 Mikrobiologie 7 1.1.5 Biofilm 8 1.2 Porphyromonas gingivalis 10 1.3 Verwandtschaftsverhältnisse von P. gingivalis 12 1.4 Mit P. gingivalis assoziierte Proteinasen 15 1.5 Fragestellung 16 2. Material und Methoden 17 3. Ergebnisse und Diskussion 18 3.1 Einführung – Gingipaine als Enzyme von P. gingivalis 18 3.1.1 Definition der Gingipaine 18 3.1.2 RgpA- und RgpB-Gen-Gingipaine 19 3.1.3 Kgp-Gen-Gingipain 20 3.2 Bedeutung der Gingipaine für die Pathogenität von P. gingivalis 21 3.2.1 Gingipaine und fimbrienvermittelte Adhäsion, intrazelluläre Invasion und parazellulärer Pfad von P. gingivalis 21 3.2.2 Effekte auf die Integrität des Bindegewebes 24 3.2.3 Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems 25 3.2.4 Aktivierende Einflüsse auf das Gerinnungssystem 27 3.2.5 Hemmende Einflüsse auf das Fibrinogen-Fibrin-System 28 3.2.6 Beeinträchtigung der Immunabwehr des Wirts 28 3.3 Gingipaine im biochemischen Regulationsmechanismus von P. gingivalis 35 3.3.1 Die Rolle des proteolytischen Systems von P. gingivalis beim Nährstofferwerb 35 3.3.2 Gingipainreifung und die Steuerung des intrazellulären Haushalts von P. gingivalis 39 3.3.3 Regulation der Proteinaseexpression von P. gingivalis 40 3.3.4 Gingipaine als bakterielle Hämagglutinine, Adhäsine und hämoglobinbindende Proteine 42 3.3.5 Proteinasegenmutationen bei P. gingivalis und ihre enzymatische Aktivität 42 3.4 Gingipaine und systemische Effekte 44 3.5 Synergismen mit anderen Spezies und quorum sensing 45 3.6 Hemmstoffe der Gingipaine 46 3.7 Immunisierung gegen Gingipaine 48 4. Zusammenfassung / Summary 52 5. Literaturverzeichnis 53 Anhang 87 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 87 Danksagung 88 Lebenslauf 89

Die in den letzten Jahren erfolgte Entwicklung im hämatologisch / onkologischen Grundlagenwissen hat neue therapeutische Strategien eröffnet. Die Übertragung von molekularbiologischer und tumorimmunologischer Grundlagenforschung in die klinische Anwendung und die Entwicklung verschiedener neuer Immun- und Gentherapieverfahren unter Verwendung von DNA des Tumorantigens Muzin sind der Schwerpunkt der Arbeit. Dargestellt werden Forschungsergebnisse von der Testung eines Impfstoffs in Schimpansen bis hin zur klinischen Anwendung einer Vakzine an Patienten: Das humane Tumorantigen Muzin, kodiert durch das Gen MUC1, ist ein großes Glykoprotein welches auf Pankreas-, Mamma- und Ovarialkarzinomen weniger glykosyliert ist und von zytotoxischen T-Zellen und monoklonalen Antikörpern erkannt werden kann. Schimpansen wurden mit Muzin-cDNA-transfizierten Epstein-Barr-Virus (EBV)-immortalisierten autologen B-Zellen immunisiert und dadurch konnte eine Induktion einer zellulären Immunantwort erreicht werden. Darüber hinaus wurden humane virusfreie "Mini"-EBV-B-Zelllinien etabliert, die das Tumorantigen Muzin exprimieren und eine unbegrenzte und sichere Quelle für Antigen präsentierende Zellen, mit denen ex vivo T-Zellen antigenspezifisch stimuliert und expandiert werden können, liefern. Als eine weitere Strategie wurde ein immortalisierter humaner CD4+ T-Zellklon, der das Tumorwachstum in Mäusen hemmt, generiert. Der Rezeptors dieses Muzin-erkennenden T-Zell-Klons wurde sequenziert und liefert die Grundlage für eine mögliche adoptive Immuntherapie unter Transfer dieses Rezeptors in Effektorzellen für ein antigenspezifisches Targeting. Weiterhin wurde eine "nackte" Muzin-DNA-Vakzine verwendet. Diese führte in einem Maustumor-Modell zu einer Langzeit-Hemmung des Tumorwachstums. Schließlich wurden dendritische Zellen für eine Vakzinierung genutzt. Als Voraussetzungen für eine klinische Anwendung wurden eine liposomale Gentransfermethode und eine effiziente Kryokonservierungsmethode für humane dendritische Zellen etabliert. Eine Vakzine, bestehend aus liposomal Muzingen (MUC1)-transfizierten autologen dendritischen Zellen, wurde in eine klinische Phase I / II umgesetzt. Es konnte demonstriert werden, dass diese Art von Vakzinierung durchführbar und sicher ist, und dass Immunantworten auch bei Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung erzielt werden konnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zu neuen therapeutischen Strategien in der Onkologie und Hämatologie. DNA-basierte Vakzinen und Immuntherapien stellen vielversprechende Methoden für künftige onkologische Behandlungsmöglichkeiten dar. / The recent development in oncological and hematological basic sciences has opened new therapeutic strategies. The transfer of molecular biology- and tumorimmunological research into clinical application and the development of different new immuno- and gene-therapeutical methods using DNA of the human tumor antigen mucin are the main focus of the work. Presented are results reaching from vaccination of chimpanzees to a clinical phase I / II study in patients: The human tumor antigen mucin, encoded by the gene MUC1, is a large glycoprotein which is underglycosylated on pancreatic-, breast- and ovarian cancer cells and can be recognized by cytotoxic T cells and monoclonal antibodies. Chimpanzees were immunized with mucin-cDNA-transfected Epstein-Barr-Virus (EBV)-immortalized autologous B cells as a vaccine inducing a cellular immune response in these animals. Moreover, human virus-free "mini-EBV-B-cell lines" expressing the tumor antigen mucin were generated providing an unlimited and safe source for antigen presenting cells to specifically stimulate and expand T cells ex vivo. As another strategy an immortalized human CD4+ T cell clone inhibiting tumor growth in mice was grown. The receptor of this mucin recognizing T cell clone was sequenced and provides the basis for a possible adoptive immunotherapy by transferring this receptor into effector cells for specific targeting. A further approach was to use a "naked" mucin-DNA-vaccine. This vaccine was able to suppress long-term tumor growth in a mouse tumor model. Finally, dendritic cells were used for vaccination. As prerequisites for a clinical application, liposomal gene transfer- and efficient cryopreservation- methods of human dendritic cells were established. A vaccine consisting of liposomal mucin gene (MUC1)-transfected autologous dendritic cells was evaluated in a clinical phase I / II trial. It could be demonstrated that this dendritic cell vaccine is feasible and safe and that immune responses can be induced even in patients with advanced diseases. The results of these studies contribute to new therapeutical strategies in oncology and hematology. DNA-based vaccines and immunotherapies could be promising tools for future oncological treatments.

Peptide aus intrazellulären Pathogenen sowie Tumorantigene aus mutierten oder überexprimierten Proteinen werden MHC I-restringiert auf der Oberfläche von Mammaliazellen präsentiert und dabei von cytotoxischen T-Lymphozyten erkannt. Die Peptidgenerierung erfolgt vorwiegend durch das Ubiquitin/26S Proteasomensystem, das eine zentrale Rolle bei der antitumoralen Immunantwort spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Polyepitopvakzine in Form von Plasmid-DNA entwickelt und auf ihre Effizienz untersucht. Als Modellantigen diente MUC1, ein von verschiedenen Adenokarzinomen und hämatologischen Tumoren überexprimiertes Glykoprotein. Ein aus dem MUC1-Protein bekanntes HLA-A2.1-abhängiges Epitop wurde als Polyepitop in verschiedenen Variationen synthetisiert, einer 20S proteasomalen in vitro Degradation unterzogen und seine Verdauprodukte massenspektrometrisch analysiert. Als optimale Sequenz für die Prozessierung des Polyepitops in die gewünschten Einzelepitope erwies sich deren einfache Verknüpfung ohne intervenierende Sequenzen. Zur Untersuchung des Effekts einer Ubiquitinfusion auf die Stabilität des MUC1-Polyepitops wurden anschließend verschiedene Strategien der linearen Fusion von Ubiquitin an das Polyepitop innerhalb eines Plasmids getestet. Durch transiente Transfektion der Plasmide konnte die Stabilität ihrer Translationsprodukte mittels Immunoblotanalysen quantifiziert werden. Die Ergebnisse demonstrieren, daß das Polyepitop durch die N-terminale Fusion von Wildtyp-Ubiquitin am effizientesten degradiert wird, wobei eine Polyubiquitinierung nicht stattzufinden scheint. Die Auswertung der folgenden in vitro Cytotoxizitätsassays sowie der Immunisierungsstudien wurde durch die schwache Affinität des gewählten subdominanten MUC1-Epitops zum HLA-A2.1-Komplex beeinträchtigt. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer umfassenden Analyse intra- und extrazellulärer Vorgänge bei der Entwicklung einer Plasmidvakzine unter Verwendung subdominanter Epitope. / Peptides from intracellular pathogens as well as tumor antigens from mutated or overexpressed proteins are presented in an MHC class I restricted manner on the surface of mammalian cells and are thereby recognized by cytotoxic T lymphocytes. Peptide generation is mainly carried out by the ubiquitin/26S proteasome system which plays a crucial role in the antitumor immune response. In the present study, a polyepitope vaccine was generated in the form of plasmid DNA and analyzed for its efficiency. As model antigen MUC1, a glycoprotein overexpressed in various adenocarcinomas and hematological tumors, was used. A known HLA-A2.1 restricted epitope from the MUC1 protein was synthesized as a polyepitope in different variations, subjected to a 20S proteasomal in vitro degradation, and its digestion products were analyzed by means of mass spectrometry. The optimal sequence for the processing of the polyepitope into the desired single epitopes was shown to be their simple conjunction without spacer sequences. Different strategies of linear fusion of ubiquitin to the polyepitope within a plasmid were subsequently tested to analyze the effect of ubiquitin fusion on the stability of the MUC1 polyepitope. After transient transfection of the plasmids, the stability of their translation products was quantified by means of immunoblot analyses. The results demonstrate that the polyepitope is degraded most efficiently through N-terminal fusion of wild type ubiquitin, while a polyubiquitination does not seem to occur. The evaluation of the subsequent in vitro cytotoxicity assays and immunization studies was impaired by the low affinity of the selected subdominant MUC1 epitope to the HLA-A2.1 complex. The present study emphasizes the importance of an extensive analysis of intra- and extracellular processes when generating a plasmid vaccine using subdominant epitopes.

Neuartige Vakzinierungsstrategien zur Aktivierung einer Tumor-spezifischen zellulären Immunantwort sind vielversprechende Ansätze zur Therapie von Tumoren, insbesondere Human Papillomvirus (HPV)-assoziierte Tumore. Bisherige HPV-Impfstudien zeigen zwar die Aktivierung einer spezifischen zellulären Immunantwort, eine Tumorreduktion bleibt jedoch aus. Um diesen Effekt auf Immunzellebene zu definieren, wurde die Wirkung der HPV-Vakzine Ad p14 im Mausmodell und an Untersuchungsmaterial humaner Tumore analysiert. In Mäusen bildeten sich HPV+ TC1-Tumore einer frühen Entwicklungsphase nach Vakzinierung zurück. Tumore einer späten Entwicklungsphase wuchsen dagegen in zwei Intervallen aus. Immunologische Eigenschaften der Tumorzellen blieben dabei unverändert. Unterschiede zeigten sich in den Frequenzen Tumor-infiltrierender Lymphozyten; in progressiven Phasen wurden nur CD4+ T Zellen nachgewiesen, in Regressionsphasen zusätzlich zytotoxische CD8+ T Zellen. Immunmodulatoren, wie Interferon alpha oder DTA-1, einem Antikörper für den Glucocorticoid-induzierten Tumornekrosefaktor-Rezeptor, unterstützten die Wirkung der Vakzine; letzterer erhöhte die Anzahl zytotoxischer CD8+ T Zellen und führte zur Abstoßung der TC1-Tumore. HPV+ Tumorgewebe des Menschen, wie auch ihre Vorstufen, zeigten im Vergleich zu anderen Tumoren, wie Bronchial oder Kolonkarzinomen einen signifikant höheren Anteil an CD4+ und CD8+ T Zellen und an Forkhead Box P3+ regulatorischen T Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immunologischen Abläufe bei der Entwicklung HPV-assoziierter Tumore mit denen vorangeschrittener chronischer Erkrankungen vergleichbar sind, in denen sich CD4+ und CD8+ T Zellantworten erschöpfen während sich gleichzeitig immunsuppressive Mechanismen verstärken. Um die Entwicklung von Impfstoffen zur Therapie HPV-assoziierter Tumore zu verbessern sollten diese Mechanismen ausführlicher betrachtet werden. / Novel vaccination strategies, activating cellular tumour specific immune responses represent a promising approach for the treatment of cancer. Especially featured for these treatments are tumours evolving from chronic human papillomavirus (HPV) infections. But current strategies have not yet proved efficacious for complete tumour regression. Addressing cellular immunological aspects of tumour vaccination, this work focused on effects of HPV vaccine Ad p14 in mice and in samples of human tumours. In mice vaccination resulted in complete regression of early stage murine HPV+ TC1 tumours. Late stage TC1 tumours increased discontinuously. During that process, TC1 cells preserved their immunological characteristics. But frequencies of tumour-infiltrating lymphocytes varied; in progressing tumours only CD4+ T cells occurred, in temporary regressing tumours also CD8+ T cells were detected. Immune modulators, like interferon alpha or glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor targeting antibody DTA-1 aggravated the effects of vaccination; latter raised cytotoxic CD8+ T cell numbers and resulted in complete tumour regression. Human HPV+ tumours as well as HPV+ precancerous stages revealed numbers of CD4+ and CD8+ T cells and especially of forkhead box P3+ regulatory T cells that were significantly increased compared to melanoma, bronchial or colon carcinoma. To assist further analysis of human HPV-associated cervical cancer and facilitate studies on therapeutic approaches, a humanized mouse model was established. The present work points to immunological exhaustion in the development of HPV-related tumours comparable to chronic diseases where CD4+ and CD8+ T cells exhaust and immunosuppression by regulatory T cells increases at the same time. For the development of appropriate strategies to enhance efficacy in HPV-associated tumour therapy, further knowledge of mechanisms involved in specific T cell activation, T cell exhaustion and immunosuppression is necessary.

Das Neuroblastom ist der am weitesten verbreitete solide, extrakranielle Tumor im Kindesalter. Trotz intensiver Forschung sind die Überlebensraten von Patienten mit fortgeschrittenem Tumorwachstum nach wie vor schlecht. Die Idee, eine zelluläre, langanhaltende Immunantwort im Körper zu induzieren, vermittelt durch zytotoxische CD8+T-Zellen, die sich gegen den Tumor richten, scheint dabei besonders attraktiv. Als tumorassoziiertes Antigen (TAA) wurde zu diesem Zweck für diese Arbeit die murine Tyrosinhydroxylase (mTH), das Schrittmacherenzym der Katecholaminbiosynthese, gewählt, da sie in der Mehrzahl der Neuroblastome stark überexprimiert ist. Für die Impfexperimente wurden sog. DNA-Minigen-Vakzine, die für Peptide aus der mTH-Sequenz kodieren, konstruiert. Die Auswahl Minigen-Peptide erfolgte mit dem MHC-Klasse-I-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei vorhergesagte starke H2-Kk-Liganden lieferte (mTH3k). Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle das Vakzin mTHlowest, dessen mTH-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und das Vakzin Ersatzepis, dessen Peptide auf der Oberfläche von murinen NXS2-Neuroblastomzellen aus MHC-Klasse-I-Komplexen isoliert werden konnten. Sowohl in prophylaktischen als auch therapeutischen Impfversuchen in Mäusen konnte das Tumorwachstum und die spontane Metastasierung in sekundäre Organe wie die Leber signifikant verhindert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Antitumoreffekt auf der Induktion mTH-spezifischer, zytotoxischer CD8+T Zellen (CTLs) beruht. Zusätzlich und insbesondere interessant für eine eventuelle klinische Anwendung eines auf der TH basierenden DNA-Vakzins verursachte das mTH-Minigen-Vakzin zumindest in Mäusen keine Aktivierung selbst-reaktiver CD8+T-Zellen. Alles in allem lassen die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse den Schluß zu, daß sich die Tyrosinhydroxylase als TAA in Form eines DNA-Vakzins zur adjuvanten Therapie des Neuroblastoms eignet. / Therapeutic vaccination against tumor antigens without induction of autoimmunity remains a major challenge in cancer immunotherapy. Here, we demonstrate for the first time effective therapeutic vaccination followed by eradication of established spontaneous neuroblastoma metastases using a tyrosine hydroxylase (TH) DNA minigene vaccine. We identified three novel mouse TH (mTH3) derived peptides with high predicted binding affinity to MHC class I H2-Kk according to prediction program syfpeithi and computer modeling of epitopes into MHC class I binding groove. Subsequently, a DNA minigene vaccine based on pCMV-F3Ub encoding for mutated ubiquitin (G76 to A76) and mTH3 was generated. Prophylactic and therapeutic efficacy of this vaccine was established following oral delivery using attenuated Salmonella typhimurium SL7207. Only mice immunized with mTH3 were free of spontaneous liver metastases. This effect was clearly dependant on ubiquitin and high affinity of the mTH epitopes to MHC class I. Specifically, we demonstrated a crucial role for minigene expression as a stable ubiquitin-Ala76 fusion peptide for vaccine efficacy. Interestingly, the unstable wild type ubiquitin-Gly76 vaccine was completely ineffective. The immune response following mTH3 DNA minigene vaccination was mediated by CD8+ T-cells as indicated by infiltration of primary tumors and TH specific cytolytic activity in vitro. Importantly, no infiltration was detectable in TH expressing adrenal medulla, indicating the absence of auto immunity. In summary, we demonstrate effective therapeutic vaccination against neuroblastoma with a novel rationally designed tyrosine hydroxylase minigene vaccine without induction of autoimmunity providing an important base line for clinical application of this strategy.