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Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für FremdsequenzenSiraj, Hassen 21 June 2000 (has links)
Das Hamsterpolyomavirus (HaPV) wurde aus Hauttumoren von HaPV-infizierten Hamstern isoliert und gereinigt. Die Virionen sind ca. 45 nm groß und sind durch einen Polyomavirus-typischen ikosaedrischen Aufbau gekennzeichnet. Im Gegensatz zu den Kapsiden anderer Polyomaviren zeigen sie jedoch eine T=7-laevo Symmetrie. Die Analyse der Proteinzusammensetzung zeigte, daß das HaPV-Kapsid hauptsächlich aus drei Virus-kodierten Strukturproteinen (VP1, VP2 und VP3) besteht. Das VP1 repräsentiert ca. 71% des Gesamtkapsidproteins und stellt somit das Hauptkapsidprotein dar. Die Vorher-sage des VP1-ORF ergab 2 in-frame befindliche potentielle Translationsinitiationssignale (ATG), die zur Synthese von VP1-abgeleiteten Proteinen von 384 und 388 Aminosäuren füh-ren sollten. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 ergab, daß die Translations-initiation am 2. ATG des VP1-ORF erfolgt, so daß das authentische VP1 384 Aminosäuren beinhaltet (MG: ca. 41,8 kDa). Das authentische und das N-terminal verlängerte VP1 wurden in Insektenzellen zur Expres-sion gebracht. Die Proteine reagierten im Western blot mit HaPV-VP1-spezifischen Kanin-chenseren und Seren von HaPV-infizierten Hamstern. Beide VP1-Derivate sind in der Lage, in Insektenzellen Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Diese Partikel ähneln in ihrer Dichte und Struktur leeren HaPV-Virionen. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen und Zell-fraktionierung konnte die nukleare Lokalisation der Partikel in Insektenzellen gezeigt werden. Durch Behandlung der Partikel mit EGTA/DTT lassen sich die Partikel in Pentamere dissozi-ieren. Möglicherweise können die Partikel durch Dissoziation und anschließende Reassozia-tion mit fremder Nukleinsäure beladen werden, um für gentherapeutische Anwendungen ein-gesetzt zu werden. Zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 wurde die dreidimen-sionale Struktur des HaPV-VP1 auf der Basis verwandter Polyomaviren vorhergesagt und eine Epitopkartierung mit Hilfe in E. coli exprimierter rekombinanter VP1-Derivate und syn-thetischer Peptide durchgeführt. Die Vorhersage der Struktur ergab 5 oberflächenexponierte Regionen: As 81-88, As 222/223, As 244-246, As 289-294 und die C-terminale Region von VP1. Zwei der genannten Regionen (As 79-97 und die C-terminale Region von VP1) konnten bei beiden Epitopkartierungsstudien als Epitope identifiziert werden. Wahrscheinlich sind in der C-terminalen Region (As 320-384) sowohl lineare als auch mindestens ein diskontinuier-liches Epitop lokalisiert. Diese Region ist auch die Ursache für die Kreuzreaktivität von HaPV-VP1 mit anti-SV40- und anti-JCV-positiven Seren. Aufgrund der wichtigen Funktion der C-terminalen Region beim Virus-Assembly kann diese Region wahrscheinlich nicht als Insertionsort für Fremdsequenzen verwendet werden, während die Region As 84-87 für die Insertion von Fremdproteinsequenzen geeignet sein sollte. / Hamster polyomavirus (HaPV) particles were isolated and purified from the skin tumors of hamster polyomavirus infected hamsters. Virions were found to be approximately 45 nm in diameter. They demonstrate the typical icosahedral structure of polyomaviruses. However, in contrast to other polyomavirus capsids, they demonstrate a T=7-laevo symmetry. The analysis of the protein composition of the virus capsid showed that it is made up of mainly three virus-coded structural proteins VP1, VP2 and VP3. The VP1 represents up about 71% of the protein mass found in the virion and is therefore the major capsid protein. The prediction of the VP1-ORF showed the existence of 2 in-frame ATG codons which should result in the synthesis of VP1 proteins of 384 or 388 amino acids. The determination of the N-terminal amino acid sequence of the virion-derived VP1 by the method of Edman degradation revealed that the second ATG codon is the initiation site for translation. Therefore the authen-tic VP1 contains 384 amino acid residues (m.w. 41.8 kDa). The authentic VP1 and its N-terminal prolonged derivative were expressed in insect cells. The VP1 proteins reacted in the Western blot with HaPV-VP1-specific rabbit sera and sera of HaPV-infected hamsters. Both VP1 derivatives were able to form virus-like particles. In their density and morphology they are similar to empty HaPV virions. Electronmicroscopic inves-tigations and cell fractionation experiments demonstrated the nuclear localization of the parti-cles in insect cells. The treatment of particles with EGTA/DTT resulted in their dissociation in pentameric subunits. For use in gene therapy particles can be probably loaded with foreign nucleic acids by dissociation and subsequent reassociation. In order to find out potential insertion sites for foreign sequences in VP1, the three-dimen-sional structure of HaPV-VP1 was predicted on the basis of the known X-ray structure of re-lated polyomaviruses. In addition, epitopes within VP1 were mapped by means of truncated recombinant VP1 derivatives and synthetic peptides. According to structure modelling 5 sur-face-exposed regions exist in the HaPV-VP1: As 81-88, 222/223, 244-246, 289-294 and the C- terminal region. By epitope mapping we could show that at 2 out of these 5 regions in VP1, namely at As 79-97 and at the C-terminal part of HaPV-VP1, antigenic determinants are located. Most likely, in the C-terminal region (As 320-384) linear as well as at least one dis-continuous epitope exist. This region is also responsible for the cross-reactivity of HaPV-VP1 with anti-SV40 and anti-JCV-VP1-specific sera. Because of its important function in virus Assembly, the C-terminal part of HaPV-VP1 is not allowed to be used as insertion site for foreign sequences. According to the structural predictions and epitope mapping data the re-gion As 84-87 should allow the insertion of foreign protein segments.
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Die subklinische Staphylokokkenmastitis - Sanierungsversuch in einem sächsischen Milchviehbetrieb über die Einführung von zwei VakzinenFrank, Yvonne 24 November 2015 (has links)
In einer sächsischen Milchviehanlage mit etwa 1800 Milchkühen, deren Tankmilchzellzahl, infolge vermehrten Auftretens von Euterinfektionen mit S. aureus als Leitkeim längerfristig über 300.000 Zellen/ml aufwies, wurden zwei Vakzinen eingesetzt. Die Erwartungshaltung lautete, dass mit den Impfungen die Inzidenz- und Prävalenzraten von S. aureus- und KNS-bedingten Mastitiden bei Färsen und bei Kühen bis zur Geburt und auch danach sinken. Es wurde vor allem erwartet, dass bei den geimpften Tieren die Zellzahlen langfristig erniedrigt bleiben und sich folglich die Eutergesundheit durch die Vakzinationen verbessert.
Anhand der Gesamtgemelkszellzahlen (GZZ) der letzten drei Milchleistungsprüfungen (MLP) a. p. und der zytobakteriologischen Befunde einer Beprobung auf Viertelebene wurden die Kühe (n=416) in Statusgruppen eingeteilt. In Statusgruppe 2 befanden sich eutergesunde Kühe (n=112). Tiere (n=146) mit moderat erhöhten Viertel- (VZZ) und GZZ, die auf mindestens einem Viertel bakteriologisch positiv waren, wurden in Statusgruppe 3 zusammengefasst. Die Statusgruppe 4 bildeten Kühe (n=158), die durch stark erhöhte GZZ und VZZ charakterisiert waren und ggf. bakteriologisch positiv waren. Färsen (n=181) wurden in Statusgruppe 1 zusammengefasst. Alle Tiere mussten klinisch gesund sein, Färsen sollten eutergesund erscheinen.
Als Impfstoffe wurden Startvac® (HIPRA Deutschland GmbH, Düsseldorf), eine kommerzielle Vakzine gegen S. aureus, KNS, Escherichia coli und coliforme Keime, sowie eine bestandsspezifische Vakzine (Bestvac Rind Mastitis®, IDT Biologika GmbH, Dessau-Rosslau) basierend auf S. aureus-Isolaten aus Mastitismilchen des Bestandes eingesetzt. Nach dem Zufallsprinzip wurden die Tiere innerhalb der Statusgruppen den Impfgruppen oder der Kontrollgruppe zugeteilt. Die erste Vakzination wurde einen Tag nach dem Trockenstellen vorgenommen (bei Färsen an vergleichbaren Trächtigkeitstagen), die zweite Vakzination erfolgte ca. 31 Tage vor dem errechneten Kalbedatum. Um den 53. Tag p. p. fand die dritte Impfung statt. Zytobakteriologische Beprobungen aller Tiere auf Viertelebene wurden am Tag 5 sowie am Tag 52 p. p. vorgenommen. Außerdem wurden während der Laktation die monatlichen MLP-Daten sowie jene zu tierärztlichen Behandlungen der in der Studie befindlichen Kühe sowie Abgänge und Abgangsursachen erfasst.
Innerhalb der Statusgruppen gab es zwischen den Vakzinationsgruppen und den Kontrolltieren bezogen auf die VZZ zu den Beprobungszeitpunkten 5 und 52 sowie auf die GZZ aus den MLPs der gesamten Laktation keine nennenswerten Unterschiede. Die Erregerprävalenzen zu den genannten Zeitpunkten nebst deren Verlauf und jene der zytobakteriologischen Diagnosen, erbrachten nur punktuell signifikante Unterschiede, die in der Summe aber keine anhaltende Tendenz erkennen ließen, die auf das bessere Abschneiden einer Vakzinationsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe hindeuten würde. Zum gleichen Ergebnis gelangen die Auswertungen der Inzidenzraten, klinische Mastitisdaten und jene der Abgangsursachen im Anschluss an die Vakzinationen.
Zusammenfassend hatte der Einsatz der bestandsspezifischen Vakzine Bestvac Rind Mastitis® sowie des Impfstoffes Startvac® mit EU-Zulassung bezogen auf die Zellzahlenentwicklung, die Inzidenz- und Prävalenzraten von S. aureus und KNS, die Behandlungsdauer und den Schweregrad von Mastitiden sowie die Heilungsraten im Vergleich zur Placebo-Gruppe in keiner der Statusgruppen erkennbare positive Effekte auf die Eutergesundheit.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Die Milchdrüse des Rindes 2
2.1.1 Anatomie und Physiologie 2
2.1.2 Immunologie des Euters 3
2.1.2.1 Mechanische Barrieren 3
2.1.2.2 Zelluläre Abwehr 5
2.1.2.3 Humorale Abwehrfaktoren 5
2.2 Die Mastitis des Rindes 8
2.2.1 Ökonomische Bedeutung 8
2.2.2 Begriffsbestimmung und Mastitisformen 9
2.2.3 Pathogenese 10
2.2.4 Mastitiserreger 11
2.2.4.1 Staphylokokken 13
2.2.4.1.1 Staphylococcus (S.) aureus 14
2.2.4.1.2 Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) 16
2.2.4.2 Streptokokken 17
2.2.4.2.1 Streptococcus (Sc.) uberis 18
2.2.4.2.2 Streptococcus (Sc.) agalactiae 19
2.2.4.2.3 Streptococcus (Sc.) dysgalactiae 20
2.2.4.3 Escherichia (E.) coli 21
2.2.4.4 Andere Mastitiskeime 23
2.2.5 Mastitisdiagnostik 23
2.2.5.1 Milchprobennahme 23
2.2.5.2 Somatische Zellen und Zellzahl 23
2.2.5.2.1 Einflussfaktoren auf die Zellzahl 24
2.2.5.2.2 Messmethoden 24
2.2.5.3 Erregernachweis 25
2.2.5.3.1 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 25
2.3 S. aureus-Mastitis als Bestandsproblem 27
2.3.1 Mastitisbekämpfung 27
2.3.1.1 Mastitistherapie 27
2.3.1.2 Managementmaßnahmen 29
2.4 Vakzination gegen Mastitis 31
2.4.1 S. aureus-Vakzinen 32
2.4.1.1 Inaktivierte Bakterien, Toxine und Toxoide 33
2.4.1.1.1 Startvac® 34
2.4.1.1.2 Stallspezifische Vakzinen mit inaktivierten Bakterien 36
2.4.1.2 Lebende Bakterien 37
2.4.1.3 Weitere Antigene 38
2.4.2 E. coli-Vakzinen 38
2.4.3 Applikationsarten 39
3 Tiere, Material und Methoden 40
3.1 Auswahl des Projektbetriebs 40
3.2 Betriebsbeschreibung 40
3.2.1 Bauliche Strukturen 40
3.2.2 Fütterungstechnik, Futterrationen und Tränken 40
3.2.3 Melkvorgang und Mastitismanagement 41
3.2.4 Trockenstellen unter antibiotischem Schutz 42
3.3 Auswahl der Versuchstiere 42
3.3.1 Vorauswahl potentiell teilnehmender Tiere 42
3.3.2 Einschlusskriterien 42
3.3.3 Ausschlusskriterien 43
3.4 Versuchsaufbau 43
3.4.1 Vakzinationsgruppen 44
3.4.2 Vakzine 44
3.4.3 Vakzination 45
3.4.4 Impfregime 45
3.4.5 Viertelgemelksprobennahme 45
3.4.6 Zeitpunkte der Viertelgemelksprobennahme 46
3.4.7 Asservierung und Versand von S. aureus-Isolaten 46
3.4.8 DNS-Extraktion 46
3.5 Analytische Methoden 47
3.5.1 Zytologische Untersuchungen 47
3.5.2 Bakteriologische Untersuchungen 47
3.5.3 Resistogramme 47
3.5.4 Genotypisierung 48
3.6 Dokumentation 50
3.6.1 Dokumentation auf dem Betrieb 50
3.6.2 Dokumentation der bakteriologischen Befunde 50
3.6.3 Dokumentation der zytobakteriologischen Diagnosen (zbD) 50
3.7 Milchleistungsprüfung (MLP) 51
3.8 Versuchszeitraum 51
3.9 Statistische Auswertung 51
4 Ergebnisse 52
4.1 Versuchsablauf 52
4.2 Klinische Untersuchung 52
4.3 Impfzeitpunkte und Abstände 52
4.4 Untersuchungsergebnisse der Milchproben (MP) 0, 5 und 52 52
4.4.1 Somatische Zellzahlen 52
4.4.2 Bakteriologische Befunde und Erregerprävalenzraten 55
4.4.2.1 Verlauf der bakteriologischen Prävalenzraten auf Viertelebene 56
4.4.2.1.1 Statusgruppe 1 56
4.4.2.1.2 Statusgruppe 2 57
4.4.2.1.3 Statusgruppe 3 58
4.4.2.1.4 Statusgruppe 4 59
4.4.3 Zytobakteriologische Diagnosen (zbD) der MP0, 5 und 52 auf Viertelebene 60
4.4.3.1 Zytobakteriologische Diagnosen auf Viertelebene 61
4.4.3.1.1 Statusgruppe 1 61
4.4.3.1.2 Statusgruppe 2 62
4.4.3.1.3 Statusgruppe 3 63
4.4.3.1.4 Statusgruppe 4 65
4.4.3.1.5 Entwicklung der bakteriologischen Befunde 67
4.5 MLP-Daten 70
4.5.1 Laktationstage 70
4.5.2 Tierzahlen der MLPs 70
4.5.3 Milchleistung 70
4.5.4 Gesamtgemelkszellzahl 71
4.5.4.1 Arithmetisches Mittel 71
4.5.4.2 Normalverteilung der Gesamtgemelkszellzahlen 73
4.6 Mastitisdaten 73
4.6.1 Klinischen Mastitiden und Mastitiserreger 73
4.6.2 Mastitisbehandlungen 74
4.6.3 Erregernachweise 14 Tage nach Therapieende 75
4.6.4 Zytobakteriologische Diagnosen von MPX und MPX+14 76
4.6.4.1 Statusgruppe 1 76
4.6.4.2 Statusgruppe 2 76
4.6.4.3 Statusgruppe 3 77
4.6.4.4 Statusgruppe 4 78
4.6.5 Kreuztabellen der zytobakteriologischen Diagnosen zum bakteriologischen Befund „S. aureus“ von MPX und MPX+14 78
4.6.5.1 Statusgruppe 1 78
4.6.5.2 Statusgruppe 2 79
4.6.5.3 Statusgruppe 3 79
4.6.5.4 Statusgruppe 4 80
4.7 Resistogramme 80
4.8 AFLP 81
4.8.1 AFLP-1 81
4.8.1 AFLP-2 81
5 Diskussion 84
5.1 Ziel der Untersuchungen 84
5.2 Kritische Betrachtung der Methoden 84
5.2.1 Hygiene- und Managementmaßnahmen 84
5.2.2 Auswahl der Vakzine 84
5.2.3 Impfregime 85
5.2.4 Antikörpertiter 87
5.2.5 Milchprobennahme und deren Zeitpunkte 87
5.2.6 Untersuchungsmaterial und Untersuchungsmethoden 88
5.2.7 Gruppenbildung bei den Versuchstieren 88
5.2.8 Betriebliche Dokumentation 89
5.2.9 Versuchszeitraum 90
5.2.10 Auswertung der Ergebnisse 90
5.3 Diskussion der Versuchsergebnisse 90
5.3.1 Verträglichkeit der Vakzine 90
5.3.2 Einfluss der Vakzine auf den Eutergesundheitsstatus 91
5.4 Schlussbetrachtung 97
6 Zusammenfassung 100
7 Summary 102
8 Literaturverzeichnis 104
9 Anhang 131
10 Danksagung 154
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Antigenerkennung während unterschiedlicher Stadien der Helicobacter pylori-InfektionKaraali, Galip 01 August 2005 (has links)
Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit Nachweismöglichkeiten von Helicobacter pylori und deren Vergleich. Hierfür ist eine genaue Kenntnis der Helicobacter-Proteine notwendig. Zu diesem Zweck wurde die humorale Immunantwort gegenüber Helicobacter pylori unter Anwendung der Methodik des zweidimensionalen Immunoblots analysiert. Zunächst wurden Proteine des autologen Helicobacter pylori-Stammes über zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Membranen geblottet und sodann mit Antikörpern aus autologem Plasma sowie Antikörpern aus dem Überstand von in vitro kultiviertem autologem Biopsiematerial detektiert. Zur Bestimmung einer Helicobacter-Infektion wurden andere invasive und nicht invasive Tests genutzt. In einer prospektiven Untersuchung wurden über 200 konsekutive Patienten mit gastrointestinalen Beschwerden und unbekanntem H. pylori-Status, die für eine Gastroskopie vorgesehen waren, routinemäßig untersucht. Bei jeder Gastroskopie wurden zwei Antrum- und zwei Korpusbiopsien zur Gastritis-Diagnostik und zur Bestimmung des H. pylori-Status entnommen. Es wurden Assoziationen zwischen einer Infektion mit Helicobacter pylori und Erkrankungen wie akute und chronische Gastritis, gastraler und duodenaler Ulkus, Magenkarzinom und Folgeerkrankungen der Gastritis überprüft. Dabei wurden auch die eindeutig Helicobacter pylori-negativen Seren mit den positiven Seren verglichen. Trotz ungleichmäßiger Verteilung der Patientenzahlen über die einzelnen Krankheitsgruppen (Gastritis, Ulkus, Karzinom) wurden bestimmte Proteine nur bei einer der Erkrankungen erkannt. Einige Proteinspots kamen deutlich intensiver bei einer einzigen Krankheitsgruppe vor. Anzustreben sind Studien mit größeren Patientenzahlen innerhalb der einzelnen Krankheitsgruppen, um mögliche weitere Assoziationen bestimmter Helicobacter-Antigene mit Folgeerkrankungen zu analysieren und zu verifizieren. Ferner wurde das Vorliegen einer Assoziation des zweidimensionalen Immunoblots mit anderen invasiven und nicht invasiven Nachweisverfahren der H. pylori-Infektion analysiert. Dabei wurde das Antigenprofil des H. pylori, sowohl qualitativ als auch quantitativ, berücksichtigt. Durch die Charakterisierung und Identifizierung einer bedeutenden Anzahl von Helicobacter-Proteinen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit für ein zukünftig beschleunigtes Screening in Richtung protektiver Vakzine-Kandidaten. / The present study is concerned with practicable methods of detecting Helicobacter pylori and comparing them. As a precondition, a precise knowledge of the proteins of Helicobacter is necessary. To this end the humoral immune response of Helicobacter pylori was analysed by using the method of two-dimensional immuno blots. First, the proteins of each autologous Helicobacter pylori strain were separated by two-dimensional electrophoresis, then blotted onto nitrocellulose membranes and eventually detected by using antibodies from autologous plasma and antibodies taken from the overflow of in vitro cultivated autologous biopsy material. For determining a Helicobacter infection various invasive and non-invasive tests were carried out. In a prospective study on more than 200 patients with gastrointestianal disorders but unknown H. pylori status were consecutively tested. At each gastroscopy two bioptic specimen each were taken from the antrum and from the corpus region in order to determine the H. pylori status. Associations were assessed between Helicobacter pylori infections and manifestations such as acute or chronic gastritis, gastric or duodenal ulcers, gastric carcinoma and gastritis induced disorders. In the process, clearly Helicobacter pylori negative sera were also compared with positive sera. Inspite of the unequal distribution of numbers of patients over different groups of disorders (gastritis, ulcers, carcinoma) certain proteins were only detected in connection with one group of disorder. Several of the protein spots only occurred in a single group of disorders. More studies will be necessary using greater numbers of patients within each group of diseases in order to analyse and verify associations between Helicobacter antigenes and other disorders. Further, evidences of an association between two-dimensional immunoblots and other invasive and non-invasive methods of assessing H. pylori were analysed with regard to respective antigene profiles, qualitatively as well as quantitatively. Based upon the presented characterizations and identifications of an unusually great number of Helicobacter proteins the probability is thus increased considerably with regard to improved screening methods towards protective vaccine candidates.
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Autolytische Salmonellen als Vektoren für die orale genetische VakzinierungLößner, Holger 27 November 2003 (has links)
Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.
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Methodische Untersuchungen zu Eigenschaften, Nachweis, Reinigung und Antigenität des alpha-Toxins von <i>Clostridium septicum</i> / Methodical studies on properties, detection, purification and antigenicity of the alpha-toxin of <i>Clostridium septicum</i>Jansen, Katja 10 May 2000 (has links)
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