Die molekularbiologische Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Pathogenen und ihren Wirtszellen ist ein wertvoller Ansatz zur Erschließung bakterieller Pathogenitätsmechanismen und hilft, unser ständig wachsendes Wissen über fundamentale Prozesse in eukaryotischen Zellen zu erweitern. Das Gram-negative Bakterium Salmonella Typhimurium ist ein gängiger Modellorganismus, um den intrazellulären Lebensstil bakterieller Pathogene und deren Einfluss auf Wirtszellprozesse zu erforschen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein FACS-basierter Hochdurchsatz RNA Interferenz Screen etabliert und durchgeführt, um Wirtszellfaktoren zu entschlüsseln, welche in die intrazelluläre Replikation von Salmonella Typhimurium in humanen Epithelzellen involviert sind. Ein Salmonellen-Stamm, der zwei fluoreszierende Reporterproteine exprimiert, wurde konstruiert, um die bakterielle Replikation und die metabolische Aktivität in infizierten Wirtszellen zu detektieren. Der Einsatz einer humanen Kinase-Bibliothek lieferte 48 potentielle Kandidatengene, von denen 15 in einer anschließenden Validierung als relevante Faktoren identifiziert werden konnten. Die Mitogen-aktivierte Protein Kinase MKK7, deren Depletion eine verminderte bakterielle Replikation zur Folge hatte, wurde für eine weitergehende funktionelle Charakterisierung ausgewählt. Es zeigte sich, dass reduzierte MKK7 Proteinmengen eine Verringerung des Proteins zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) durch eine transkriptionelle Regulation zur Folge hatten. Die Bedeutung von cPLA2 für die bakterielle Infektion wurde durch die Salmonellen-induzierte, dauerhafte Phosphorylierung des Faktors deutlich und konnte durch Replikationsvergleiche in cPLA2-depletierten und nicht-depletierten Zellen bestätigt werden. Mikroskopische Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Phospholipase für den fehlerfreien Aufbau von Salmonellen-induzierten Filamenten notwendig ist, welche unerlässlich für die Salmonellenreplikation in Epithelzellen sind. / The study of pathogen-host cell interactions on the molecular level is a valuable tool to reveal bacterial pathogenicity mechanisms and, moreover, contributes to our increasing knowledge of fundamental cellular processes of eukaryotic cells. The Gram negative bacterium Salmonella Typhimurium is a well established model organism to investigate the intracellular lifestyle of bacterial pathogens and their modulation of host cell processes. In this work, a FACS-based high-throughput RNA interference screen was established and performed to elucidate host cell factors involved in the intracellular replication of Salmonella Typhimurium. A Salmonella strain expressing two fluorescent reporter constructs was generated which allowed for monitoring the bacterial replication and metabolic activity within infected cells. A human kinome-wide siRNA library was screened and 48 candidates were chosen for further validation. Among these, 15 host cell genes were identified to influence Salmonella intracellular replication. The mitogen activated protein kinase MKK7, whose depletion caused a decrease in bacterial replication, was selected for a more profound functional characterization. It could be demonstrated that the knock down of MKK7 caused a decrease in phospholipase A2 (cPLA2) protein levels due to a transcriptional regulation. A role for cPLA2 during the bacterial intracellular lifestyle was implicated by the finding that Salmonella induced a permanent phosphorylation of the phospholipase. The necessity of cPLA2 was confirmed with replication assays in cPLA2 depleted cells using siRNA and shRNA mediated knock down strategies. Microscopic experiments indicated that the phospholipase A2 is involved in the accurate generation of Salmonella-induced filaments, structures that were reported to be indispensable for replication.

Serovare von Salmonella enterica subspecies enterica sind im allgemeinen pathogen für Mensch und andere Säugetiere. In dieser Arbeit habe ich anhand eines “Multilocus Sequences Typing” Typisierungsschemas die Populationsstruktur einer der am häufigsten auftretenden Serovaren dieser Subspecies, das aus Menschen und Schlachttieren isolierte Serovar Newport charakterisiert. Dieses Schema wurde auch für die Charakterisierung von Isolaten derselben Subspecies aus humanen Dauerträgern und Reptilien verwandt, um zu bestimmen, ob Isolate aus diesen Quellen sich in ihrer Populationstruktur von denjenigen unterscheiden, die aus anderen Quellen isoliert wurden. Multilocus Sequences Typing ist eine weitgehend für die Untersuchung der Evolution und Populationsstruktur von einen breiten Spektrum von Organismen verwendete Technik. 400 - 600 bp lange Fragmente von 7 Haushaltsgenen wurden sequenziert, und jede einzelne Sequenz jedes einzelnen Gens wurde eine Allelnummer zugeordnet. Jede einzelne Allelkombination wurde einem Sequenztyp zugeordnet. Die so gewonnenen Daten wurden weiter analysiert. Drei “Lineages”, Newport-I, Newport-II und Newport-III, wurden innerhalb dieses Serovars identifiziert, die jeweils aus Menschen in Europa, Tieren und Menschen in Nordamerika isoliert wurden. Der Multiresistenz-Phänotyp wurde häufiger in Newport II gefunden, während die meisten Newport III Isolate pan-sensitiv waren. Verglichen mit anderen Serovaren war die Anzahl von “Lineages” innerhalb Newport höher als bei Enteritidis, Kentucky und Typhimurium, aber niedriger als bei Paratyphi B. Das heisst, die Serovare von S. enterica subspecies enterica variieren stark in ihrer Populationsstruktur. Die Sequenztypen in Isolaten aus humanen Dauerträgern waren im allgemeinen am häufigsten in Isolaten von klinischen Patienten und Tieren vorhanden. In der Mehrheit der Serovaren waren die meisten Isolate aus Patienten und Tieren genetisch identisch mit solchen, die aus gesunden Trägern isoliert wurden. Die genetische Variabilität war zwischen Isolaten aus diesen Quellen vergleichbar. Diese Ergebnissen deuten daraufhin, dass Salmonellen aus Dauerträgern sowie Isolate aus Patienten und Tieren derselben Population angehören. Die meisten Serovare aus Reptilienisolaten waren genetisch identisch mit denen von Menschen und warmblütigen Tieren. In den Serovaren Bovismorbificans, Decatur, Miami und Oranienburg hingegen waren die meisten Isolate aus Reptilien genetisch anders als Isolate aus anderen Wirten. Allerdings wurden nur wenige Isolate der Serovaren Bovismorbificans, Decatur und Miami aus Reptilien und nur wenige Isolate der Serovaren Oranienburg aus anderen Quellen getestet; eine grössere Anzahl von Isolaten müsste daher untersucht werden, um festzustellen ob diese genetischen Unterschiede statistich signifikant sind oder nicht. / Serovars of Salmonella enterica subspecies enterica are generally pathogenic to humans and other mammals. In this study, I examined the population structure of one of the most common serovars of this subspecies isolated from humans and food animals, serovar Newport, using a multilocus sequence typing scheme. This scheme was also used to analyze isolates of this subspecies from chronic human carriers and reptiles to determine whether isolates from these sources represent distinct populations than those from other hosts. Multilocus sequence typing has extensively been used to study evolution and population structure of a wide range of organisms. 400-600 bp fragments of 7 housekeeping genes were sequenced and every unique sequence of each gene fragment was given a distinct allele number. Each unique combination of alleles was assigned a distinct sequence type number. The data were used in further analyses. Three lineages, namely Newport-I, Newport-II and Newport-III were identified within serovar Newport which were associated to European humans, animals and humans in North America, respectively. Multidrug resistance phenotypes were most common in Newport-II whereas most isolates in Newport-III were pan-susceptible. When compared to other serovars, the numbers of lineages within Newport were higher than for Enteritidis, Kentucky and Typhimurium but lower than for Paratyphi B. Therefore, serovars of S. enterica subspecies enterica vary greatly in their population structures. The sequence types observed for isolates from chronic human carriers were generally the most common among human-clinical and animal isolates. Most isolates from non-carrier humans plus animals were genetically identical to the carried isolates within most serovars. Genetic diversity was also comparable between isolates from these sources. These results suggest that salmonellae from chronic human carriers belong to the same population as isolates from non-carrier humans and animals. For most serovars, most isolates from reptiles were genetically identical to those from humans or other warm blooded animals. However, in serovars Bovismorbificans, Decatur, Miami and Oranienburg, most reptile isolates were genetically distinct from isolates from other hosts. Only few reptile isolates were tested from Bovismorbificans, Decatur and Miami and only few non-reptile isolates were tested from Oranienburg, and in larger numbers of such isolates would be needed to determine whether these differences are statistically significant.

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.