The human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen that establishes a life- long infection upon primary infection. While primary infection is mostly asymptomatic, HCMV is responsible for significant morbidity and mortality in immunocompromised patients and neonates. There is currently no vaccine. The strict species specificity of this large double-stranded DNA virus poses a major challenge in understanding cytomegalovirus (CMV) pathogenesis. Murine cytomegalovirus (MCMV) exhibits significant similarity to HCMV and represents a widely used model to study CMV pathogenesis. The genomes of both human cytomegalovirus (HCMV) and murine cytomegalovirus (MCMV) were first sequenced over 20 years ago. Similar to HCMV, the MCMV genome had initially been proposed to harbour ~ 170 open reading frames (ORFs). More recently, RNA-seq based omics approaches revealed HCMV gene expression to be substantially more complex, comprising several hundred viral ORFs, similarly observed for other herpesviruses including KSHV, EBV and our own work on HSV-1, where an integrative analysis was further extended to provide a unified nomenclature for all gene products. The aim of my PhD project was to generate and utilize available multi-omics datasets to provide a state-of-the-art reannotation of lytic MCMV gene expression based on integrative analysis of a large set of omics data. By developing a novel nomenclature strategy, I annotated 365 viral transcription start sites (TiSS) giving rise to 380 and 454 viral transcripts and ORFs, respectively. The latter included >200 small ORFs, some of which represented the most highly expressed MCMV gene products. I further developed a novel time-resolved TiSS profiling approach (dSLAM-seq) to accurately annotate TiSS and determine the temporal kinetics of viral TiSS usage by metabolic labelling of newly-synthesized RNA. This not only resulted in the identification of a novel MCMV immediate early transcript encoding the m166.5 ORF, which we termed ie4, but also revealed three classes of viral early genes that differ in the onset of transcriptional activity. Furthermore, we identified a class of well-expressed viral transcripts (termed: ‘delayed late genes’) that are induced later than canonical true late genes and contain an initiator element (Inr) but no TATA- or TATT-box in their core promoters. For interesting candidate viral uORFs, I demonstrated their regulatory effects on their downstream ORFs (in cis) through elaborate reporter assays. As a proof-of-concept, I validated two novel ORFs in MCMV infection, including the truncated isoforms of the viral NK-cell immune evasin m145 expressed from a viral TiSS downstream of the canonical m145 mRNA. Despite being ≈5-fold more abundantly expressed than the canonical m145 protein it was not required for downregulating the NK cell ligand, MULT-I, but nevertheless provided evidence for additional unknown glycosylated protein isoforms expressed from the same genomic locus. Furthermore, I validated a novel MCMV protein overlapping the viral polymerase (M54), m54.5. Funded by a seed grant from the DFG research unit FOR2830, I characterized the interactome of the m54.5 protein revealing interactions with three exciting protein complexes for future functional studies. Finally, I tested the hypothesis that viral small ORFs represent a novel class of CD8+ T-cell antigens that are subject to direct but not cross-presentation due to their inherent instability of their encoded microproteins. By expressing model epitopes at the C-terminus of either the M35 uORF or ORF, I could demonstrate that sORF-derived epitopes can be efficiently presented to naïve CD8+ T-cells by MHC-I, and mediate CD8+ T-cell control of infection, but are poor in priming naïve CD8+ T cells in mice. In summary, my work unravel exciting new aspects of an important animal infection model and will pave the way for future mechanistic studies on previously unknown cytomegalovirus gene. / Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein ubiquitäres Pathogen, das nach einer Primärinfektion eine lebenslange Infektion verursacht. Während die Primärinfektion meist asymptomatisch verläuft, ist das HCMV für eine erhebliche Morbidität und Mortalität bei immungeschwächten Patienten und Neugeborenen verantwortlich. Derzeit gibt es keinen Impfstoff. Die strenge Speziesspezifität dieses großen Doppelstrang-DNA-Virus stellt eine große Herausforderung für das Verständnis der Pathogenese des Cytomegalovirus (CMV) dar. Das murine Cytomegalovirus (MCMV) weist eine erhebliche Ähnlichkeit mit dem HCMV auf und ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der CMV-Pathogenese. Die Genome sowohl des humanen Cytomegalovirus (HCMV) als auch des murinen Cytomegalovirus (MCMV) wurden erstmals vor über 20 Jahren sequenziert. Ähnlich wie beim HCMV wurde zunächst angenommen, dass das MCMV-Genom etwa 170 offene Leserahmen (ORFs) enthält. In jüngerer Zeit haben RNA-seq-basierte Omics-Ansätze gezeigt, dass die HCMV- Genexpression wesentlich komplexer ist und mehrere hundert virale ORFs umfasst. Ähnliches wurde auch bei anderen Herpesviren beobachtet, darunter KSHV, EBV und unsere eigene Arbeit zu HSV-1, bei der eine integrative Analyse weiter ausgebaut wurde, um eine einheitliche Nomenklatur für alle Genprodukte zu erstellen. Ziel meines Promotionsprojekts war es, verfügbare Multi-omics-Datensätze zu generieren und zu nutzen, um eine hochmoderne Reannotation der lytischen MCMV- Genexpression auf der Grundlage einer integrativen Analyse eines großen Satzes von Omics-Daten zu erstellen. Durch die Entwicklung einer neuen Nomenklaturstrategie habe ich 365 virale Transkriptionsstartstellen (TiSS) annotiert, die zu 380 bzw. 454 viralen Transkripten und ORFs führen. Zu letzteren gehörten >200 kleine ORFs, von denen einige die am stärksten exprimierten MCMV-Genprodukte darstellten. Darüber hinaus entwickelte ich ein neuartiges zeitaufgelöstes TiSS-Profiling-Verfahren (dSLAM-seq), um TiSS genau zu annotieren und die zeitliche Kinetik der viralen TiSS- Nutzung durch metabolische Markierung von neu synthetisierter RNA zu bestimmen. Dies führte nicht nur zur Identifizierung eines neuartigen frühen MCMV-Transkripts, das für den m166.5 ORF kodiert und das wir als ie4 bezeichnet haben, sondern zeigte auch drei Klassen von frühen viralen Genen, die sich im Beginn der Transkriptionsaktivität unterscheiden. Darüber hinaus identifizierten wir eine Klasse von gut exprimierten viralen Transkripten (als "verzögerte späte Gene" bezeichnet), die später als die kanonischen echten späten Gene induziert werden und ein Initiatorelement (Inr), aber keine TATA- oder TATT-Box in ihren Kernpromotoren enthalten. Für interessante virale uORF-Kandidaten habe ich ihre regulatorischen Auswirkungen auf ihre nachgeschalteten ORFs (in cis) durch aufwendige Reporter- Assays nachgewiesen. Zum Nachweis des Konzepts habe ich zwei neue ORFs bei MCMV-Infektionen validiert, darunter die verkürzten Isoformen des viralen NK-Zell- Immunevasins m145, die von einem viralen TiSS stromabwärts der kanonischen m145 mRNA exprimiert werden. Obwohl es ≈5-mal häufiger exprimiert wird als das kanonische m145-Protein, war es für die Herabregulierung des NK-Zell-Liganden MULT-I nicht erforderlich, lieferte aber dennoch Beweise für weitere unbekannte glykosylierte Protein-Isoformen, die von demselben genomischen Locus exprimiert werden. Darüber hinaus habe ich ein neues MCMV-Protein validiert, das die virale Polymerase (M54) überlagert, m54.5. Finanziert durch eine Anschubfinanzierung der DFG-Forschergruppe FOR2830 habe ich das Interaktom des m54.5-Proteins charakterisiert und dabei Interaktionen mit drei interessanten Proteinkomplexen für zukünftige Funktionsstudien aufgedeckt. Schließlich testete ich die Hypothese, dass kleine virale ORFs eine neue Klasse von CD8+-T-Zell-Antigenen darstellen, die aufgrund der inhärenten Instabilität ihrer kodierten Mikroproteine zwar direkt, aber nicht kreuzweise präsentiert werden können. Durch die Expression von Modellepitopen am C-Terminus des M35 uORF oder ORF konnte ich zeigen, dass sORF-abgeleitete Epitope naiven CD8+ T-Zellen durch MHC-I effizient präsentiert werden können und die Kontrolle der Infektion durch CD8+ T-Zellen vermitteln, aber beim Priming von naiven CD8+ T-Zellen in Mäusen schlecht funktionieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit aufregende neue Aspekte eines wichtigen Tierinfektionsmodells aufdeckt und den Weg für künftige mechanistische Studien über bisher unbekannte Cytomegalovirus-Gene ebnen wird.

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