Intrazelluläre Protein- und RNA-Lokalisation ist ein lebenswichtiger molekularer Mechanismus. Ihm unterliegen sowohl die äußere Gestaltung der Zellform, Zellagilität, zelluläre Differenzierung sowie die intra- sowie interzelluläre Kommunikation. Diverse Krankheiten werden mit Fehlfunktionen des intrazellulären Molekültransportes assoziiert und es existieren unzählige Beispiele für bekannte Wege des intrazellulären Protein- und RNA-Transportes. Allerdings ist die globale Komposition lokaler Protein- und RNA-Reservoirs bisher kaum wissenschaftlich erforscht worden. In dieser Studie beschreibe ich die Protein- sowie RNA-Kompositionen subzellulärer Fraktionen zweier neuronaler Zelltypen. Die Neuriten und Somata von Neuroblastoma-Zellen (N1E-115) und Ascl1 induzierten Neuronen (beides Mauszellen) wurden mechanisch voneinander separiert und mittels RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie auf ihre Bestandteile untersucht. Die Verteilung von mRNAs korreliert signifikant mit der Verteilung der entsprechenden Proteine in Ascl1-iNs während in der Neuroblastoma Zelllinie N1E-115 kein solcher Trend nachgewiesen werden konnte. Der Vergleich zu Datensätzen von anderen Zellsystemen und Methoden zeigt, dass das lokale Proteom sowie das lokale Transkriptome und Translatome stark Zelltyp spezifisch ist. Um den Einfluss lokaler Proteinbiosynthese auf die Komposition subzellulärer Proteinpools zu erheben, habe ich die Lokalisation neu synthetisierter Proteine untersucht. Es scheint, als sei die RNA-Lokalisation und lokale Translation von hoher Relevanz für die Protein-Lokalisation in diesen stark polarisierten Zellsystemen. Des Weiteren stelle ich eine Methode vor, um de novo „zip codes“ in diesen neuronalen Zellsystemen zu identifizieren. Diese könnte ein elementar wichtiger Schritt sein, um Fehlfunktionen im interzellulären Molekültransport zu verstehen. / Intracellular protein and RNA localization is one of the mayor players in the formation of cell shape, enabling cell agility, cellular differentiation and cell signaling. Various diseases are associated with malfunctions of intracellular molecule transport. There are many known pathways of how and why proteins and RNAs are transported within the cell and where they are located, though there is not much known about the global distribution of proteins and RNAs within the cell. In this study I apply a subcellular fractionation method coupled to multiple omics approaches to investigate the global distribution of mRNAs, noncoding RNAs and proteins in neuronal cells. Neurites and soma from mouse neuroblastoma cells (N1E-115) as well as from Ascl1 induced neurons (Ascl1-iNs) were isolated and the composition of the spatial proteome and transcriptome was examined. The localization of mRNAs correlates significantly with the localization of their corresponding protein products in Ascl1-iNs whereas it does not in the mouse neuroblastoma cell line N1E-115. Comparing these datasets with recently published data of other cell lines and methods it is clear, that the local proteome, transcriptome and translatome of neuronal cells is highly cell type specific. To investigate how spatial protein pools are established I analyzed local pools of newly synthesized proteins revealing that many proteins are synthesized on the spot. RNA localization therefore plays a crucial role in generating local protein pools in these highly polarized cell systems. Additionally, I propose a method to identify on a global scale de novo “zip codes” in these cell systems which would be a great step towards understanding malfunctions in molecule transport.

Die Keimstreifverlängerung der Malacostraca wird durch ein festgelegtes Zellteilungsmuster der posterioren Teilungszone erreicht. Dort geben anfangs in einem Halbkreis angeordnete Ektoteloblasten ihre Tochterzellen nach anterior ab, welche das für malakostrake Krebse typische Gittermuster ausbilden. Dabei spielen die Ektoteloblasten eine besondere Rolle, da sie das Zellmaterial für die anschließende Segmentierung produzieren. Im Gegensatz zu Vertretern basal abzweigender Taxa der Malacostraca, bei denen sich der Halbkreis der Ektoteloblasten aus zwei Halbreihen oder aus einem Zellring bildet, sind bei den Isopoden, zu denen auch die Kellerassel Porcellio scaber zählt, die Ektoteloblasten von Beginn an in einem Halbkreis angeordnet. Das Teilungsmuster bei der Verlängerung des Keimstreifens wurde bereits bei vielen Vertretern der Malacostraca, einschließlich P. scaber, ausführlich untersucht. Daten über die Bildung der Ektoteloblasten und den Beginn ihrer Teilungsaktivität fehlen dagegen weitestgehend. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher mit Hilfe von Zellmarkierungsversuchen mit Vitalfarbstoffen (wie z.B. Alexa Fluor 488 und Tetramethylrhodamin) und der 4D-Mikroskopie die Bildung der Keimscheibe, die Gastrulation und der Beginn der Keimstreifverlängerung bei P. scaber untersucht. Ein besonderer Fokus lag dabei auf den Ektoteloblasten und den umliegenden Zellen, deren Zelllinien untersucht wurden. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, sind (i) die Ektoteloblasten bereits vor Beginn der Gastrulation in einem äußeren Halbkreis formiert, (ii) zwei Zellen, die Teile der späteren Mittellinie bilden, bis kurz vor Beginn der Teilungstätigkeit der Ektoteloblasten in deren Reihe eingereiht, (iii) die Ektoteloblasten erst mit der Fertigstellung der ersten e-Reihe als große, verlängerte Zellen erkennbar und es ist (iv) ein zweiter Halbkreis vorhanden, der sich ausschließlich in posteriore Richtung teilt und dadurch den Gastrulationsporus schließt. / In malacostracan crustaceans, the elongation of the germ band is realized by an invariant cell division pattern of the posterior growth zone. The ectoteloblasts are arranged in a semicircle and divide in anterior direction in a fixed pattern. Their progeny are arranged in the typical grid pattern of malacostracan crustaceans and provide the cell material for later segmentation processes. In contrast to other malacostracans, where the ectoteloblast appear in two half rows or a cell ring, the ectoteloblasts are arranged in a semicircle in isopods from the outset. The cell division pattern during elongation of the germ band is well studied in many malacostracan species including the isopod Porcellio scaber. However, details about formation of the ectoteloblasts and beginning of their cell division activity are missing. Therefore, the aggregation of the germ disc, the gastrulation, and the beginning of the elongation of the germ band in Porcellio scaber were examined using vital dyes (e.g. Alexa Fluor 488 and Tetramethylrhodamine) in cell labeling experiments combined with 4Dmicroscopy. The formation and cell-lineages of the ectoteloblasts and their surrounding cells were analyzed. The results suggest that (i) the ectoteloblasts are arranged in a semicircle before gastrulation starts, (ii) two cells forming part of the arising midline are lined up with the ectoteloblasts until they start their cell division activity in a predetermined pattern, (iii) the differentiation of ectoteloblasts is discernable after formation of the first e-row when they appear as big and elongated cells and (iv) a second semicircle exists whose cells divide in posterior direction and, consequently, enclose the gastrulation pore.

Computertomographie (CT) ist eine nicht-destruktive bildgebende Methode, die in den letzten Jahren häufig bei fossilen Wirbeltierschädeln angewendet wird und Paläontologen ermöglicht bisher unbekannte interne Schädelmerkmale zu untersuchen. Letztere sind bedeutend um die Gehör- und Gehirnevolution, Gesichtsinnervation, den Zahnwechsel und den Ursprung von Endothermie entlang der Stammlinie der Säugetiere (Synapsida) zu verdeutlichen. Obwohl interne Schädelmerkmale in den letzten Jahren bei zahlreichen Therapsiden beschrieben wurden, sind sie bisher von der Wissenschaft weitestgehend vernachlässigt worden, verglichen mit den gut erforschten äußeren craniodentalen Merkmalen bei Synapsiden und wurden daher in phylogenetischen Analysen überwiegend vernachlässigt. In dieser Doktorarbeit stelle ich eine Neubewertung der der Phylogenie der Eutheriodontier (die Synapsidengruppe bestehend aus Cynodontia+Therocephalia) und eine Beurteilung der Merkmalsevolution innerhalb dieser Gruppe bereit. Der Ursprung der Cynodontier, die Ahnen der Säugetiere, stellt einen der bedeutendsten, bisher ungelösten Probleme in der Evolution der Therapsiden dar. Es ist bekannt, dass die Cynodontier am engsten mit den Therocephaliern verwandt sind, jedoch sind die genauen Verwandtschaftsverhältnisse bisher nicht eindeutig geklärt. Obwohl eine wesentliche Dichotomie in der abgeleiteten triassischen Subklade Eucynodontia in der Phylogenie der Cynodontia gut unterstützt wird, bleiben die Verwandtschaftsverhältnisse basalerer Cynodontier derzeit ungelöst. Anhand von CT Daten, die anhand eines ausgiebigen Datensatzes von Exemplaren der am frühesten bekannten (oberpermischen und untertriassischen) Cynodontier, sowie einiger ausgewählter Therocephalier und höherer (mitteltriassischer) Cynodontier (Eucynodontia) gewonnen wurden, konnte ich neue interne Schädelmerkmale dieser Tiere beschreiben. Diese Daten wurden anschließend in einem neuen, umfassenden phylogenetischen Datensatz dieser Gruppe integriert. / Computed tomography (CT) is a non-destructive imaging technique that has been widely used on fossil vertebrate crania in recent years and allowed paleontologists to investigate previously-obscure endocranial data. The latter have been instrumental in elucidating patterns of ear and brain evolution, facial innervation, tooth replacement and the origin of endothermy along the mammalian stem lineage (Synapsida). Although endocranial characters have been described for various synapsids in recent years, they remain understudied compared to the well-known external craniodental features in synapsids and have been largely ignored in phylogenetic analyses. In this thesis, I provide a re-evaluation of the phylogeny of Eutheriodontia (the synapsid subclade consisting of Cynodontia+Therocephalia) and an assessment of character evolution within the group. The origin of cynodonts, the group ancestral to (and including) mammals, is one of the major outstanding problems in therapsid evolution. It is well-established that cynodonts are most closely related to Therocephalia among the major synapsid groups, but the exact nature of this relationship is uncertain. Furthermore, although a fundamental dichotomy in the derived Triassic subclade Eucynodontia is well-supported in cynodont phylogeny, the relationships of more stemward cynodonts are currently unresolved. Using CT data derived from extensive sampling of the earliest known (late Permian and Early Triassic) cynodonts and selected exemplars of therocephalians and later (Middle Triassic onwards) cynodonts (eucynodonts), I described novel aspects of the endocranial anatomy of these animals. These data were incorporated into a new, taxonomically comprehensive phylogenetic dataset of the group.

Citizen Science (CS) ist eine Methode, die in den letzten Jahren in der Wissenschaft weltweit an Bedeutung gewonnen hat. Obwohl viele Studien diese Daten mit denen von akademischen Forschenden verglichen, gibt es immer noch Bedenken hinsichtlich ihrer Qualität. In meiner Doktorarbeit zielte ich darauf ab die Methode CS für eine Vogelart mit einem großen Repertoire, der Nachtigall (Luscinia megarhynchos), als Anwendungsfall auf der Grundlage der Dialektforschung zu evaluieren. Ich untersuchte, ob die drei vermeintlichen Hauptgründe für schlechte Qualität (Anonymität, Unerfahrenheit und fehlende Standardisierung) zu unvollständigen, zeitlich oder räumlich verzerrten und ungenauen bioakustischen Daten führten. Dazu analysierte ich nicht-standardisierte CS-Aufnahmen, die mit einem Smartphone über die 'Naturblick' App erstellt wurden, welche einen eingebauten Mustererkennungsalgorithmus enthielt. Ich konnte in meiner Doktorarbeit zeigen, dass mit der Methode CS valide Daten für die bioakustische Forschung gewonnen werden können. Meine Ergebnisse zeigten, dass Anonymität, mangelnde Erfahrung und Standardisierung nicht zu geringer Qualität führten, sondern zu einem großen Datensatz, der genauso wertvoll war wie jene von akademischen Forschenden. Die Ergebnisse sind von großer Bedeutung für künftige CS-Projekte zur Verbesserung der Qualität und des Vertrauens in diese Daten. / Citizen science (CS) is a method that has been increased in science worldwide in recent years. Although many studies have compared these data with those of academic researchers, there are still concerns about their quality. In my doctoral thesis I aimed to evaluate the method of CS for a bird species with a large repertoire, the nightingale (Luscinia megarhynchos), as a use case based on dialect research. I investigated whether the three main assumed reasons for poor quality (anonymity, inexperience and lack of standardisation) led to incomplete, temporal or spatial biassed and inaccurate bioacoustic data. Therefore, I analysed non-standardised CS recordings, which were generated with a smartphone via the 'Naturblick' app, which contained an in-built pattern recognition algorithm. In summary (Chapter V), my doctoral thesis showed that the method CS could be used to generate valid data for bioacoustic research. My findings showed that anonymity, lack of experience and standardisation did not lead to low quality but in fact to a large dataset, which was as valuable as ones from academic researchers. The results are of great relevance for future CS projects to improve the quality and the trust in these data.

Mesosaurier, kleine Reptilien aus dem Unteren Perm, gelten als die frühesten aquatischen Reptilien. Trotz ihrer kurzen Existenz und begrenzten Verbreitung bieten sie wichtige Einblicke in die frühe Amnioten-Evolution. Diese Arbeit fasst vier Artikel zusammen, die Aspekte der Anatomie, Ontogenese und Ökologie von Mesosauridae beleuchten. Kapitel 1 behandelt die Knochenhistologie und Pachyosterosklerose in Mesosaurierknochen, was auf eine vollständig aquatische Lebensweise hinweist. Wir identifizieren auch eine große intraspezifische Variation, die möglicherweise durch unregelmäßige Probenahmeorte beeinflusst wird. Kapitel 2 untersucht die morpho¬logische Variation bei Mesosauriern und deren Umwelt-verteilung basierend auf ihrer Größe. Ontogenetische Veränderungen stehen im Zusammenhang mit dem Wechsel des Ablagerungsmilieus und deuten auf Veränderungen in Ernährung und Lebensraum mit dem Wachstum hin. In Kapitel 3 wird die kaudale Autotomie bei Mesosauriern überprüft und das Vorhandensein kaudaler Bruchebenen bestätigt. Wir schlagen eine stärker von den Extremitäten angetriebene Fortbewegung vor. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass kaudale Autotomie ursprünglich in einer breiten Gruppe von Reptilien vorhanden war, anstatt konvergent in verschiedenen Linien entstanden zu sein. Kapitel 4 beschreibt auf Grundlage von Mesosaurier-Exemplaren vier grundlegende axiale Entwicklungs-modelle bei Amnioten und rekonstruiert ihren ursprünglichen Zustand in der Klade. Diese Muster bleiben im Laufe der Zeit relativ stabil, obwohl regionale Einflüsse möglich sind. Diese Erkenntnisse beleuchten wichtige Aspekte der Mesosaurier-Paläontologie und unterstreichen ihre Bedeutung für die Erforschung der Evolution früher Amnioten. / The enigmatic mesosaurs were small, reptiles that lived during the Lower Permian period and were the earliest known reptiles to return to living in water. Despite their short existence and restricted geographical distribution, mesosaurs can provide important evidence about the early evolution of amniotes and the colonization of aquatic environments. This thesis regroups four articles published in peer-reviewed journals that investigate aspects of the anatomy, ontogeny, and ecology of Mesosauridae. In Chapter 1, my co-authors and I study bone histology and pachyosterosclerosis in the long bones, vertebrae, and ribs of mesosaurs. Thin sections show a high degree of osteosclerosis in their bones, supporting a fully aquatic lifestyle. We also recover a large intraspecific variation in Mesosauridae, albeit possibly due to irregular sampling locations. In Chapter 2 we examine morphological variation in mesosaurs and the environmental distribution of individuals as a function of size. We highlight ontogenetic changes in mesosaurs associated with a transition across depositional environments, which suggest that mesosaurs underwent diet and life environment change with growth. In Chapter 3, we review the information on caudal autotomy in mesosaurs. We confirm the presence of caudal fracture planes in the clade and propose a more limb-driven propulsion than previously considered. Our results also suggest that caudal autotomy was ancestrally present in a large radiation of reptiles, rather than a feature evolved convergently in multiple lineages. In Chapter 4, based on data in mesosaur specimens, we describe four axial developmental patterns in amniotes and reconstruct their ancestral condition in the clade. We demonstrate that these patterns are relatively stable throughout time, albeit possibly affected by regionalization. These new elements reveal crucial aspects of mesosaur paleontology and substantiate their significance for studying the evolution of early amniotes.

Die in dieser Arbeit vorgestellten Arbeiten zielten darauf ab, verschiedene Formen des Lernens und der Verhaltensanpassung in Tieren zu testen. Hierbei wurder der Großteil dieser Arbeit an einer natürlich vorkommenden klonalen Fischart, der Amazonas-Molly Poecilia formosa, durchgeführt. Diese gesellige, ausschließlich weibliche Art erzeugt durch ungeschlechtliche Fortpflanzung genetisch identische Nachkommen. Mit dem Aufkommen von immer detaillierteren Ansätzen zur Unterscheidung von Verhaltensunterschieden sind solche klonalen Arten in der Ethologie von entscheidender Bedeutung, da sie als perfektes natürliches Modell dienen, um individuelle Verhaltensunterschiede und deren Entwicklung zu testen. Da genetische Variationen als Störfaktor weitgehend ausgeschlossen werden können, kann die Aufmerksamkeit auf die Unterschiede zwischen Individuen aufgrund ihrer Vorerfahrungen gelenkt werden. In den ersten drei Kapiteln der hier vorgestellten Arbeit wurden die individuellen Erfahrungen durch operante Konditionierung oder durch das Aussetzen der Tiere gegenüber neuen oder bekannten Situationen verändert. Das jeweilige Verhalten wurde sowohl alleine, als auch im sozialen Kontext untersucht. Auf diese Weise wurde die Auswirkung des sozialen Kontexts sowie der physischen Umgebung auf Verhaltensaspekte wie Schwimmgeschwindigkeit und Sprungwahrscheinlichkeit ermittelt. Kleinere Verhaltensunterschiede wurden dann im folgenden Kapitel durch den Vergleich von manuellen Ansätzen und automatischen Quantifizierungsinstrumenten bewertet und evaluiert. Schließlich wurde ein methodischer Ansatz augearbeitet, bei dem die Leistungsfähigkeit künstlicher intelligenz in Form von neuronalen Netze genutzt wurde, um Individuen in komplizierten, natürlichen Szenen während Räuber-Beute-Interaktionen zu verfolgen. / The work presented in this thesis set out to test various forms of learning and behavior adaptation. The bulk of this work was done using a naturally occurring clonal fish species, the Amazon molly Poecilia formosa. This sociable, all female species produces genetically identical offspring through asexual reproduction. With the advent of increasingly detailed approaches to discriminate behavioral differences, such clonal species are vital in ethology as they serve as a perfect natural model to test for individual behavioral differences and the development of such. Since genetical variation can largely be excluded as a confounding factor, attention can be drawn towards the differences among individuals due to their prior experience. In the first three chapters of the work presented here, the individual information and experience was altered by applying operant conditioning or by exposing the animals to novel or well-known situations. This was done both individually and in a group setting. By doing so, the effect of the social context, as well as the physical surroundings on behavioral aspects such as swimming speed and jumping probability was determined. Minute behavioral differences were then evaluated in the following chapter by comparing manual approaches and automated quantification tools. Lastly, a methodological approach was taken in which the power of artifical neural networks was harnessed to track individuals in convoluted natural scenes during predator-prey interactions.

Die Entschlüsselung der Mechanismen zur Regulierung der Zellidentität im Kontext der zellulären Reprogrammierung ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung von Strategien, die die Qualität und Sicherheit reprogrammierter Zellen für medizinische Anwendungen gewährleisten. Die Bedeutung der verschiedenen Regulationswege und die Art und Weise, wie die ursprüngliche Zellidentität verloren geht, während die neue Zellidentität durch Reprogrammierung etabliert wird, sind noch nicht vollständig verstanden. Um diese Fragen zu klären, haben wir ein neuartiges System entwickelt, in dem Coelomozyten (CCs), die in C. elegans endocytische und hepatische Funktionen haben, durch Überexpression des GATA-Transkriptionsfaktors (TF) ELT-7 bzw. des ZNF-Transkriptionsfaktors (TF) CHE-1, sowohl in darm-, als auch in neuronenartige Zellen umprogrammiert werden können. Wir haben einen RNAi-Screen mit 732 Chromatinregulatoren durchgeführt, um neue Enhancer/Suppressor-Pathways zu identifizieren, die an der direkten Reprogrammierung von CCs beteiligt sind. Dabei konnten wir zeigen, dass die Deletion von Effektorproteinargonauten und von Komponenten des nuklearen RNAi-Pathways die Reprogrammierung von CCs in Neuronen oder Darmzellen unterdrückt. Argonaut NRDE-3, das aus dem Zytoplasma in den Zellkern wandert, zeigte bei seiner Deletion die stärkste Unterdrückung der Reprogrammierung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die nukleäre RNAi-Maschinerie für die direkte zelluläre in vivo Reprogrammierung erforderlich sein könnte. Darüber hinaus haben wir ATAC-seq in FACs-sortierten CCs durchgeführt, um die Chromatinlandschaft während der CC-Reprogrammierung zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir ein menschliches Transdifferenzierungsmodell etabliert, um die Rolle der nuklearen RNAi-Maschinerie und der zahlreichen konservierten Reprogrammierungsfaktoren, die in C. elegans während der direkten Reprogrammierung in vivo identifiziert wurden, zu erforschen. / Dissecting cell fate regulatory mechanisms in the context of cellular reprogramming is central to developing strategies that ensure the quality and safety of reprogrammed cells for medical applications. The importance of different regulatory pathways and how the original cell fate is shut down while establishing the new cell fate during reprogramming are not fully understood. To address these questions, we developed a novel system where coelomocytes (CCs), which have scavenging and hepatic function in C. elegans, can reprogram into both intestinal- and neuronal-like cells upon overexpression of GATA-type transcription factor (TF) ELT-7 and ZNF-type TF CHE-1, respectively. We performed an RNAi screen consisting of 732 chromatin regulators/remodelers to identify novel enhancer/suppressor pathways involved in the direct reprogramming of CCs. We showed that depletion of effector protein Argonauts and the nuclear RNAi pathway components suppresses CC reprogramming into either neurons or intestinal cells. Specifically, the core member Argonaut NRDE-3, which translocates from the cytoplasm to the nucleus, showed the most robust suppression in reprogramming upon its depletion. These findings suggest that nuclear RNAi machinery might be required for in vivo direct cellular reprogramming. Moreover, we also performed the ATAC-seq in FACs-sorted CCs to uncover accessibility in chromatin states during CC reprogramming. Furthermore, we established a human transdifferentiation model to reveal the role of nuclear RNAi machinery and the numerous conserved reprogramming factors identified in C. elegans during in vivo direct reprogramming.

In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben. / In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.

Tfap2a gehört zur Familie der AP-2-Transkriptionsfaktoren. Heterozygote Mutationen von TFAP2A im Menschen führen zum Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom (BOFS) und sind mit Nierenanomalien assoziiert. Molekulare Mechanismen, die zu diesen BOFS-assoziierten Nierenanomalien führen, sind noch unbekannt. In diesem Projekt wurde die Expression von Mitgliedern der AP-2-Familie in neugeborenen und erwachsenen Wildtyp-Mäusen analysiert. Tfap2a wurde in der Ureterknospe und der distalen Region des S-förmigen Körpers in den Nieren neugeborener Mäuse exprimiert. Die Expression blieb in ausgereiften distalen Tubuli und Sammelrohren erhalten. Tfap2b, ein zweites Mitglied der AP-2-Familie, das in der Niere exprimiert wird und mit Zystenbildung assoziiert ist, wurde im aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife sowie in den distalen Tubuli und dem in der Nierenrinde liegenden Sammelrohr exprimiert. Um die Rolle von Tfap2a in der Niere zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer sammelrohrspezifischen Deletion von Tfap2a (Tfap2a-KO) erzeugt. Phänotypische und morphologische Analysen ergaben, dass Tfap2a-KO-Mäuse mäßig reduzierte Nierengewichte und eine fortschreitende Dilatation der äußeren medullären Sammelrohre aufwiesen. Einzelkern- und RNA-Sequenzierung der Nieren adulter Mäuse zeigte eine deregulierte Expression von Genen, die mit der Organisation von Aktinfilamenten, Zelladhäsion, Wnt-Signalen und anderen Signalwegen der Nierenentwicklung in Verbindung stehen. In einem isolierten Modell von kultivierten Sammelrohrzellen mit einer Deletion von Tfap2a waren ähnliche Signalwege dereguliert. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass Tfap2a für die Differenzierung des Sammelrohrepithels und die Regulierung des Durchmessers des Tubuluslumens erforderlich ist. Dies ermöglicht Einblicke in die molekularen Grundlagen der beim BOFS beobachteten Nierenfehlbildungen. / The transcriptional regulator Tfap2a is part of the AP-2 transcription factor family. Heterozygous mutations of TFAP2A in humans lead to branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) and are associated with renal anomalies. Molecular mechanisms leading to BOFS-associated renal anomalies are still unknown. In this project, expression patterns of AP-2 family members were analyzed in newborn and adult wildtype mice. Tfap2a was expressed in the ureteric bud and distal region of the S-shaped body in kidneys of newborn mice. Expression was maintained in mature distal tubules and collecting ducts. Tfap2b, a second AP-2 family member expressed in the kidney and associated with cyst formation, was found in the ascending limb and showed overlapping expression with Tfap2a in distal tubules and the cortical collecting duct. To investigate the role of Tfap2a in the kidney, mice with a collecting duct-specific deletion of Tfap2a (Tfap2a-KO) were generated by crossing mice carrying a Cre-recombinase under the Hoxb7 promotor and mice with floxed Tfap2a alleles. Phenotypic and morphological analyses revealed that Tfap2a-KO mice displayed moderately reduced kidney weights and a progressive dilation of outer medullary collecting ducts. Single-nucleus and bulk RNA sequencing of kidneys of three months old Tfap2a-KO mice and littermate controls indicated deregulated expression of genes associated with actin filament organization, cell adhesion, Wnt signaling, and other kidney developmental pathways. Genes deregulated in Tfap2a-deficient mice included several genes previously implicated in the development of congenital anomalies of the kidney and urinary tract. In an isolated model of cultured collecting duct cells carrying a Tfap2a knockout similar pathways were deregulated. Taking together, this study indicates that Tfap2a is required for collecting duct epithelium differentiation and tubular lumen diameter regulation, providing insights into the molecular basis of renal defects observed in BOFS.

Hintergrund: Die Berlin Fat Mouse Inzuchtlinie (BFMI) ist ein Modell für Adipositas und das metabolische Syndrom. Diese Studie zielte darauf ab, genetische Varianten zu identifizieren, die mit dem gestörten Glukosestoffwechsel assoziiert sind, indem die fettleibigen Linien BFMI861-S1 und BFMI861-S2 verwendet wurden, die genetisch eng verwandt sind, sich aber in mehreren Merkmalen unterscheiden. BFMI861-S1 ist insulinresistent und speichert ektopisches Fett in der Leber, während BFMI861-S2 insulinsensitiv ist. Methoden: Die QTL-Analyse wurde in zwei fortgeschrittenen Intercross-Linien (AIL) in der Generation durchgeführt. Eine AIL wurde aus der Kreuzung BFMI861-S1 x BFMI861-S2 und die zweite AIL aus der Kreuzung BFMI861-S1 x BFMI861-B6N erhalten. Für beide AILs wurden Phänotypen über 25 bzw. 20 Wochen gesammelt. Zur Priorisierung von positionellen Kandidatengenen wurden Gesamtgenomsequenzierung und Genexpressionsdaten der Elternlinien verwendet. Ergebnisse: Für den AIL BFMI861-S1 x BFMI861-S2 wurden überlappende QTL für das Gonadenfettgewebegewicht und die Blutglukosekonzentration auf Chromosom (Chr) 3 (95,8–100,1 Mb) und für das Gonadenfettgewebegewicht, Lebergewicht und Blut nachgewiesen Glukosekonzentration auf Chr 17 (9,5–26,1 Mb). Für die AIL BFMI861-S1 x BFMI861-B6N zeigte ein hochsignifikanter QTL auf Chromosom (Chr) 1 (157–168 Mb) einen Zusammenhang mit dem Lebergewicht. Ein QTL für das Körpergewicht nach 20 Wochen wurde auf Chr 3 (34,1 – 40 Mb) gefunden, der sich mit einem QTL für das scAT-Gewicht überlappte. In einem multiplen QTL-Mapping-Ansatz wurde ein zusätzliches QTL, das das Körpergewicht bei 16 Wochen beeinflusste, auf Chr 6 (9,5–26,1 Mb) identifiziert. Schlussfolgerungen: Die QTL-Kartierung zusammen mit einem detaillierten Priorisierungsansatz ermöglichte es uns, Kandidatengene zu identifizieren, die mit Merkmalen des metabolischen Syndroms in beiden AILs assoziiert sind. / Background: The Berlin Fat Mouse Inbred line (BFMI) is a model for obesity and the metabolic syndrome. This study aimed to identify genetic variants associated with the impaired glucose metabolism using the obese lines BFMI861-S1 and BFMI861-S2, which are genetically closely related, but differ in several traits. BFMI861-S1 is insulin resistant and stores ectopic fat in the liver, whereas BFMI861-S2 is insulin sensitive. Methods: QTL-analysis was performed in two advanced intercross lines (AIL) in generation. One AIL obtained from the cross BFMI861-S1 x BFMI861-S2 and the second AIL from the cross BFMI861-S1 x BFMI861-B6N. For both AILs phenotypes were collected over 25 and 20 weeks, respectively. For prioritization of positional candidate genes whole genome sequencing and gene expression data of the parental lines were used. Results: For the AIL BFMI861-S1 x BFMI861-S2 overlapping QTL for gonadal adipose tissue weight and blood glucose concentration were detected on chromosome (Chr) 3 (95.8-100.1 Mb), and for gonadal adipose tissue weight, liver weight, and blood glucose concentration on Chr 17 (9.5-26.1 Mb). For the AIL BFMI861-S1 x BFMI861-B6N one highly significant QTL on chromosome (Chr) 1 (157–168 Mb) showed an association with liver weight. A QTL for body weight at 20 weeks was found on Chr 3 (34.1 – 40 Mb) overlapping with a QTL for scAT weight. In a multiple QTL mapping approach, an additional QTL affecting body weight at 16 weeks was identified on Chr 6 (9.5-26.1 Mb). Conclusions: QTL mapping together with a detailed prioritization approach allowed us to identify candidate genes associated with traits of the metabolic syndrome in both AILs.