Die Fähigkeit, eine interne Repräsentation der Außenwelt zu schaffen, ist ein grundlegender Aspekt, der alle lebenden Organismen höherer Ordnung verbindet und ihr Überleben sichert. Bei diesem Prozess kodiert der Thalamus sensorische Informationen, die er von der sensorischen Peripherie erhält, und leitet sie zur weiteren Verarbeitung an kortikale Zentren weiter. Dieses Wissen beruht auf der Untersuchung der Verarbeitung der meisten Sinnesmodalitäten. Die physiologische Funktion des Thalamus bei der Verarbeitung nicht schmerzhafter Temperaturen und dessen Wahrnehmungsrelevanz sind jedoch nach wie vor wenig untersucht, da der Schwerpunkt bereits veröffentlichter Arbeiten oft auf der homöostatischen Regulierung der Körpertemperatur und der Verarbeitung schmerzhafter Temperaturen lag. Darüber hinaus konzentrierten sich diese Studien in der Regel auf die Identifizierung eines zentralen thalamischen Verarbeitungszentrums und ließen außer Acht, dass Temperatur parallel von verschiedenen thalamischen Kernen verarbeitet wird. Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu überwinden, indem sie eine detaillierte und groß angelegte Untersuchung der Thalamus spezifischen thermischen Verarbeitung, der Konnektivität zu kortikalen Bereichen und des Einflusses auf das Verhalten der drei somatosensorisch assoziierten Thalamuskerne vornimmt. Diese beispiellose Untersuchung der Temperaturverarbeitung im Thalamus hat eine vielschichtige thermische Darstellung mit ortsspezifischen Unterschieden in der Temperaturkodierung und der Konnektivität mit temperaturempfindlichen kortikalen Regionen aufgedeckt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Thalamus für die Temperaturwahrnehmung von wesentlicher Bedeutung ist, was die Relevanz des Thalamus bei der Verarbeitung von Temperatur unterstreicht. / The capability to create an internal representation of the external world is a fundamental aspect that unites all living higher-order organisms and ensures their survival. In this process, the thalamus encodes sensory information, which it receives from the sensory periphery and relays to cortical centers for subsequent processing. This knowledge is built upon the investigation of the processing of most sensory modalities. However, the physiological thalamic function in processing innocuous temperature and its perceptual relevance remains elusive due to a focus on the homeostatic regulation of body temperature as well as the processing of painful temperatures of already published work. In addition, these studies usually focused on identifying a central thalamic processing hub and failed to recognize that temperature is processed in a parallel manner by various thalamic nuclei. This study will attempt to overcome these limitations by undertaking a detailed and large-scale exploration of thermal processing, connectivity to cortical areas, and the influence on the behavior of three somatosensory-associated thalamic nuclei. This unprecedented study of thermal processing in the thalamus has uncovered a multi-faceted thermal representation with location-specific differences in temperature encoding and connectivity with temperature-sensitive cortical regions. Moreover, it is demonstrated that the thalamus is essential for temperature perception, which emphasizes the relevant roles of multiple thalamic nuclei in the physiological processing of temperature and perception.

AMPA-Rezeptoren sind entscheidend für ein funktionsfähiges Nervensystem von Säugetieren und spielen eine Schlüsselrolle bei exzitatorischen Neurotransmitter-Reaktionen im zentralen Nervensystem. Insbesondere die post-transkriptionale Modifizierung des GluA2-Untertyps beeinflusst die Permeation von Kalzium. Diese Arbeit untersucht den Permeationsmechanismus verschiedener Kationentypen durch die Kanäle des AMPA-Rezeptors mittels Molekulardynamik-Simulationen (MD). Die Untersuchung konzentriert sich auf die Q/R modifizierten Untereinheiten des AMPAR-Tetramers und zeigt, dass die Permeation von monovalenten Kationen wie Kalium und Caesium ähnliche Eigenschaften in Simulationen wie im Labor aufweist. Jedoch stellen Natrium und Kalzium aufgrund hoher Hydrationsenergien eine Herausforderung dar, die mit einem neu entwickelten multi-site Modell für Kalzium überwunden wird. Die Simulationen zeigen, dass monovalente Kationen während der Permeation etwa die Hälfte ihrer Wasserschale verlieren, während Kalzium seine erste Hydrathülle aufrechterhält. Dies legt einen wassermediierten Mechanismus für die Kationenpermeation nahe. Interessanterweise blockiert die Q/R Modifikation die Kalziumpermeation und während sie die Leitfähigkeit für monovalente Kationen nur verringert. Die Ergebnisse weisen jedoch auf eine eingeschränkte einwärtsgerichtete Permeationsrate im Vergleich zu Labormessungen und auswärtsgerichteten Permeationen hin, was in der Arbeit eingehend diskutiert wird. / The excitatory neurotransmission mediated by AMPA receptors (AMPARs) is essential for numerous higher brain functions, and abnormalities in their function have been implicated in severe neurodevelopmental disorders. This study employs molecular dynamics (MD) simulations to investigate the mechanisms underlying cation permeation through AMPAR channels with various compositions, shedding light on their functional dynamics. By conducting simulations under transmembrane potentials and utilizing advanced force fields, we explore the permeation of potassium, cesium, and calcium ions. Our results show that advanced models accurately capture calcium conductance, providing insights into the behavior of cations and water molecules during permeation, particularly highlighting the crucial role of the selectivity filter in facilitating ion passage. Additionally, we investigate the impact of natural editing of AMPAR subunits, revealing that the replacement of glutamine with arginine diminishes calcium conductance while allowing monovalent cation permeation. Moreover, simulations with edited subunit compositions demonstrate the differential effects on potassium and calcium permeation, providing further understanding of the structural determinants governing ion selectivity. Furthermore, our investigations into permeation dynamics in both inward and outward directions uncover intriguing differences that warrant further exploration. Overall, this thesis contributes to elucidating the intricate mechanisms underlying cation permeation through AMPAR channels, offering valuable insights into their role in neurotransmission and potential implications for therapeutic interventions targeting neurodevelopmental disorders.

Mikrotubuli sind filamentöse intrazelluläre Polymere, die als grundlegende Bestandteile subzellulärer Strukturen in Eukaryoten dienen. Diese Studie verwendet einen vergleichenden Ansatz, um zu untersuchen, wie sich die intrinsischen dynamischen und biochemischen Eigenschaften von Tubulin zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden, und zeigt ihre Konsequenzen in zwei verschiedenen physiologischen Kontexten: 1) Bestimmung der Spindelgröße bei Fröschen der Gattung Xenopus und 2) Spezifität von Mikrotubuli-Inhibitoren für Plasmodium falciparum-Mikrotubuli über denen ihres menschlichen Wirts. In den Eiern der Froschgattung Xenopus wird die Länge der meiotischen Spindel biochemisch festgelegt und erreicht unabhängig von räumlichen Einschränkungen eine Obergrenze. Messungen der Dynamik von Xenopus-Mikrotubuli zeigen, dass X. laevis-Mikrotubuli sowohl schneller wachsen als auch länger leben als die von X. tropicalis. Darüber hinaus spielt die Quantifizierung der Länge und Massenverteilung der Xenopus-Mikrotubuli zusammen mit den Reaktionen der Eiextrakt-Spindelanordnung eine Rolle für die intrinsische Dynamik der Mikrotubuli bei der Modulation der Spindellänge. Mikrotubuli sind auch Wirkstofftargets bei Pilz- und parasitären Helmintheninfektionen und haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit als potenzielles Wirkstoffziel beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum auf sich gezogen. Um die Dynamik und Medikamentspezifität von Mikrotubuli von P. falciparum zu charakterisieren, haben wir Tubulin direkt von den Parasiten gereinigt. Zum ersten Mal wurden hier dynamische P. falciparum-Mikrotubuli in vitro rekonstituiert und eine parasitenspezifische Unterdrückung der Dynamik von Mikrotubuli durch Oryzalin und Amiprofos-Methyl direkt nachgewiesen. Diese Studie legt einen experimentellen Rahmen fest, um direkt auf parasitenspezifische Hemmung von Mikrotubuli zu testen, die bisher unter Verwendung bestehender in-vitro-Ansätze nicht beobachtet wurden. / Microtubules are filamentous intracellular polymers that are fundamental components of subcellular structures including the spindle, the cytoskeleton, and flagella in eukaryotes. This study uses a comparative approach to investigate how the intrinsic dynamic and biochemical characteristics of tubulin vary between species and demonstrates their consequences in two different physiological contexts: 1) Spindle size control in Xenopus frogs, and 2) The specificity of microtubule inhibitors for Plasmodium falciparum microtubules over those of their human host. In Xenopus frog eggs, the length of the spindle is biochemically controlled and reaches an upper limit independent of spatial constraints. In this study, in vitro measurements of Xenopus microtubule dynamics show that X. laevis microtubules are both faster-growing and longer-lived X. tropicalis, independent of the influence of microtubule-associated proteins. Furthermore, quantification of Xenopus microtubule length and mass distributions, combined with egg extract spindle assembly reactions, establishes a role for intrinsic microtubule dynamics in modulating spindle length. Microtubules are also established drug targets in fungal and parasitic helminth infections and have in the past decades drawn attention as a potential drug target in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In order to characterize P. falciparum microtubule dynamics, structure, and drug specificity, we have used an affinity chromatography-based approach to purify tubulin directly from blood-stage parasites. For the first time, dynamic P. falciparum microtubules have been reconstituted in vitro and parasite-specific suppression of microtubule dynamics by oryzalin and amiprofos methyl has been directly demonstrated. This study establishes an experimental framework to directly test for parasite-specific microtubule inhibition, microtubule structure, and interactions with MAPs that previously have not observed using existing in vitro approaches.

Direkte Zellreprogrammierung basiert auf Transkriptionsfaktoren (TFs), die die Identität bestimmter Zelltypen induzieren.Diese TF vermittelte Zellreprogrammierung ist in den meisten Zelltypen häufig durch hemmende Mechanismen limitiert.Um solche Barrieren in C. elegans zu identifizieren, verwendeten wir den zuvor charakterisierten Zinkfinger-TF CHE-1, der erforderlich ist, um glutamaterge ASE-Neuronen zu induzieren.In dieser Studie haben wir eine mögliche Barriere für die Reprogrammierung von Keimzellen zu Neuronen identifiziert und charakterisiert:die NAD+ abhängige mitochondriale Isocitratdehydrogenase 3 (IDH3).Der RNAi-Knockdown ergab in Kombination mit ektopischer Expression von CHE-1 einen konsistenten Phänotyp hinsichtlich der Expression des neuronalen ASE- Reporters in der Keimbahn. Wir konnten feststellen,dass IDH3-Knockdowns zu globalen Veränderungen der repressiven Histonmodifikationen führen.Mittels genetischer Untersuchungen identifizierten wir Mitglieder der Jumonji-Proteine sowie die a-KG-abhängigen Histon-Demethylasen, die an diesem Reprogammierungsphänotyp beteiligt sind. Durch Massenspektrometrie und weiterführenden genetische Untersuchungen haben wir festgestellt, dass Zellen bei IDH3-Mangel eine sogenannte Glutamin-Anaplerose verwenden, um den a-KG-Spiegel wieder aufzufüllen und somit einen teilweise aktiven Zitronensäurezyklus beizubehalten.Des Weiteren sind diese Prozesse erforderlich, damit die TF vermittelte Zellreprogrammierung stattfinden kann.Wir haben außerdem festgestellt, dass Signale von Zellen der somatischen Gonade diesen durch IDH3-Mangel vermittelten Zellreprogrammierungsprozess von Keimzellen ermöglichen.Daher ist anzunehmen, dass der Reprogrammierungsphänotyp in der Keimbahn nicht gewebsautonom ist. Zusammengefasst identifiziert diese Studie die Rolle der evolutionär konservierten Isocitrat-Dehydrogenase 3 (IDH3) bei der Aufrechterhaltung der Zellidentität und damit auch als Barriere für die Zellreprogrammierung. / Direct reprogramming makes use of transcription factors (TFs) that induce the identity of specific cell types. These TFs often are restricted in most cell types by inhibitory mechanisms. In order to identify these barriers in C. elegans, we used the previously described zinc-finger TF CHE-1 that is required to induce the glutamatergic ASE neuron fate. In this study, we identified and characterized a candidate barrier for reprogramming germ cells into neurons, the NAD+ dependent mitochondrial isocitrate dehydrogenase 3 (IDH3). RNAi knockdown of alpha (IDHA-1) or gamma (IDHG-1) subunit of this complex gave a consistent and reliable phenotype of the expression of ASE reporter in the germ line upon ectopic expression of CHE- 1. This study shows that idha-1 depletion-mediated reprogramming of germ cells to neurons is partially repressed in animals that lack the hypoxia-induced factor, TF HIF-1. It has been shown that mitochondrial dynamics change during differentiation. This suggests that disturbing mitochondrial function may feed-back to chromatin thus altering gene expression and allowing reprogramming. We were able to identify that knock down of idha-1 leads to global histone modification changes; and by performing a genetic screen we identified members of the Jumonji proteins, the a-KG dependent histone demethylases, involved in this conversion phenotype. By performing Mass Spectrometry and genetic screens, we have identified that cells utilize glutamine anaplerosis to replenish a-KG levels and display a partially active citric acid cycle upon IDH3 depletion; and these processes are required for the TF- mediated reprogramming to occur. Furthermore, the IDH3 depletion-mediated germ cell reprogramming is not tissue autonomous. We identified that signals from the somatic gonad enable the reprogramming process. Overall, this study identifies the role of the conserved Isocitrate Dehydrogenase 3 in cell fate safeguarding and thus as a barrier to reprogramming.

Die innerste Schicht von Blutgefäßen wird durch Endothelzellen geformt. Dort haben sie das Potential neue Blutgefäße durch einen Prozess Namens Angiogenese zu bilden. In Krebspatienten wurde gezeigt, dass Medikamente, die auf Mikrotubuli zielen, die tumorassoziierte Angiogen ese hemmen. Diese Erkenntnis lässt auf eine Rolle der Mikrotubuli-Dynamik im Prozess der Angiogenese schließen. Die fein abgestimmte Mikrotubulus-Dynamik wird durch posttranslationale Tubulinmodifikationen, wie die durch die Vasohibin-1 katalysierte Mikrotubuli-Detyrosinierung, moduliert. Dennoch sind die Rollen der Mikrotubuli-Dynamik und -Detyrosinierung während der Angiogenese noch nicht verstanden. Ich konnte zeigen, dass Mikrotubuli in aussprossenden Zellen schneller und für kürzere Zeit wachsen, und dass sie in Abhängigkeit vom Blutfluss stabilisiert werden. Funktionelle Studien haben gezeigt, dass die Dynamik der Mikrotubuli eine Rolle bei der Streckung und Proliferation von Endothelzellen spielt und dadurch für die korrekte Gefäßmorphogenese notwendig ist. Vasohibin-1 detyrosiniert α-Tubulin und wird im Endothel von Zebrafischen stark exprimiert. Ich habe herausgefunden, dass endotheliales Tubulin vorwiegend in aus sprossenden Gefäßen der hinteren Kardinalvene detyrosiniert wird. Bei sekundären Aus sprossungen führte der Funktionsverlust von Vasohibin-1 zu einer allgemeinen Abnahme der Mikrotubuli-Detyrosinierung, was zu einem abnormalen Sprossungsverhalten führte. Es unter Verlust von Vasohibin-1 eine vermehrte Zellteilung und eine erhöhte Zellzahl in sekundären Aussprossungen gibt. Infolge dessen scheitern diese Zellen daran die Lymphgefäße zu bilden und bauen stattdessen überschüssige Verbindungen zwischen den Venen. Meine Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Tubulin-Detyrosinierung spezifisch die Zellteilung in den sekundären Aussprossungen kontrolliert, um die Bildung der venösen und lymphatischen Gefäße im Zebrafisch-Schwanz zu erreichen. / Endothelial cells form the inner layer of blood vessels. There, they retain the potential to develop into new vessels through a process known as sprouting angiogenesis. Microtubule targeting drugs inhibit tumour-associated angiogenesis in cancer patients, suggesting a role of microtubule dynamics in this process. The fine-tuned microtubule dynamics are modulated by tubulin post translational modifications such as microtubule detyrosination, catalysed by Vasohibin-1. The role of the microtubule dynamics and detyrosination in angiogenesis remains elusive. The aim of my research is to increase the understanding of the role of microtubule dynamics and stability in vessel development and maturation by studying and manipulating the microtubule dynamics in the zebrafish embryo. In Chapter 3, I show that microtubules grow faster and for shorter periods in sprouting cells, and stabilise over time, in a flow-dependent manner. Functional studies showed that microtubule dynamics are necessary for the correct vessel morphogenesis, by playing a role in endothelial cell elongation and proliferation. In Capter 4, I show that Vasohibin-1 detyrosinates α-tubulin and is highly expressed in the endothelium of zebrafish. I found that endothelial tubulin is predominantly detyrosinated in sprouting vessels from the posterior cardinal vein of the zebrafish. In these secondary sprouts, Vasohibin-1 loss-of-function led to an overall decrease of microtubule detyrosination resulting in abnormal sprouting behaviour. High resolution imaging revealed increased cell division and cell numbers in Vasohibin-1 deficient secondary sprouts. These cells then failed to build the lymphatic vessels and instead populate superfluous connections between veins. I propose that tubulin detyrosination specifically controls cell division of secondary sprouts to achieve adequate formation of venous and lymphatic vasculature in the zebrafish trunk.

Das RNA-guided adaptive Immunsystem CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) immunisiert prokaryotische Zellen gegenüber mobilen genetischen Elementen (MGEs). Bei der Adaption wird eine kurze Nukleinsäurensequenz (prespacer) von den MGEs gewonnen, verarbeitet und schließlich als spacer in das CRISPR-Array integriert. Cas1 und Cas2, die Hauptbestandteile der Adaption, bilden einen Integrase-Komplex, welcher neue spacer in das CRISPR-Array integriert. Der molekulare Mechanismus für die Adaptiondes Typ II-A Systems, welches cas9, cas1, cas2, csn2 und tracrRNA codiert, ist bis heute nicht vollständig verstanden. Daher untersuchten wir die Anforderungen der verschiedenen Cas-Proteine für den Adaptionsprozess. Wir verifizierten die Adaptions-Aktivität von Typ II-A Systemen des Streptococcus thermophilus LMD-9 anhand von Adaptionsstudien nach Phagen-Infektion. Dabei beobachteten wir höhere Akquisitionsraten im CRISPR3-Lokus im Vergleich zum CRISPR1-Lokus. Unsere Plasmid-basierte Adaptionsstudie bestätigte die Notwendigkeit von Cas9, zusätzlich zu Cas1, Cas2 und Csn2 bei der Adaption. Der yeast two-hybrid und der pull-down Ansatz zeigten sowohl spezifische Interaktionen zwischen den Cas-Proteinen, als auch Interaktionen zwischen Cas-Proteinen sowie DNA-Reparatur Proteinen. Die Regionen der Cas1 und Cas9 Interaktion wurden durch SPOT peptide assay identifiziert. Zusammenfassend weist unsere Studie darauf hin, dass Cas-Proteine sowohl mit Proteinen innerhalb, als auch außerhalb des CRISPR-Cas Systems interagieren, und bietet somit eine Basis für die Erforschung der möglichen Funktionen von DNA-Reparatur Proteinen in CRISPR-Cas Systemen und vice versa. / The RNA guided adaptive immune system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Cas (CRISPR-associated) immunizes prokaryotic cells against mobile genetic elements (MGEs). During spacer acquisition stage, a short nucleic acid sequence (prespacer) is acquired from the MGEs, processed and finally integrated into the CRISPR array as a spacer, which serves as genetic memory to defend against the invasion of the cognate MGEs. The molecular mechanism for the spacer acquisition of the type II A systems, which encode cas9, cas1, cas2, csn2 and tracrRNA, is still not fully understood. Therefore, we investigated the requirement of the different Cas proteins for spacer acquisition. We verified the acquisition activity of the type II A systems of Streptococcus thermophilus LMD 9 via spacer acquisition studies by phage challenge. We observed higher acquisition rates in the CRISPR3 locus compared to the CRISPR1 locus. Our plasmid-based spacer acquisition study confirmed in addition to Cas1, Cas2 and Csn2 the requirement of Cas9 for spacer acquisition. Yeast two hybrid and pull down approaches revealed specific interactions among the Cas proteins, as well as interactions between Cas and DNA repair proteins. The interaction regions of Cas1 with Cas9 were identified by SPOT peptide assay. Altogether, our study suggests that Cas proteins interact with proteins within and beyond the CRISPR Cas systems, and it provides a basis for the investigation of the potential roles of DNA repair proteins in the CRISPR Cas systems and/or vice versa.

Die embryonale Neurogenese in Drosophila ist eine hochgradig koordinierte Abfolge von Zellschicksalsentscheidungen, die viele Ähnlichkeiten mit der Entwicklung des Nervensystems in Wirbeltieren aufweist. Diese Zellschicksalsentscheidungen sind räumlich und zeitlich koordiniert. Diese Zellen entstehen an stereotypen Positionen in jedem Segment und sind entlang zweier räumlicher Achsen angeordnet: der dorsoventralen und der anteroposterioren Achse. Neuroblasten teilen sich, um stereotype Zelllinien zu bilden, und die Zellen weisen charakteristische Zellmorphologien und -ziele auf, wobei die molekularen Mechanismen, die diese Merkmale bestimmen, noch weitgehend unbekannt sind. Jahrzehnte der Genetik haben einige Faktoren aufgedeckt, die für viele dieser Entscheidungen notwendig sind, aber ein Verständnis der einzelnen neurogenen Linien auf Genomebene war bis vor kurzem in vivo unmöglich. Ich habe mRNA aus Einzelzellen verwendet, um die Transkriptomdynamik von Schicksalsentscheidungen in der frühen Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Mein Ziel ist es, zu entschlüsseln, wie sich Zellen unterscheiden, wenn Entscheidungen getroffen werden, die für die Entwicklung des Nervensystems wesentlich sind. Ich habe Transkriptomdaten von einzelnen Zellen aus Zehntausenden von Neuroblasten während der gesamten embryonalen Neurogenese erstellt. Es gelang mir, spezifische neurogene Populationen und ihre Genexpressionsprofile entlang ihrer Differenzierungswege zu identifizieren. Ich konnte die komplizierten zeitlichen Achsen, die das sich entwickelnde embryonale Nervensystem formen, teilweise entschlüsseln - ein Prozess, der von der Fliege bis zum Menschen konserviert ist. Diese Arbeit hat die Identifizierung lokalisierter Marker und sogar spezifischer Neuroblasten ermöglicht. Dieses Verständnis kann nun mit Informationen über die einzelnen Zellschicksale kombiniert werden, aus denen diese Neuroblasten hervorgehen, wie z. B. ihre spezifischen neuronalen und glialen Schicksale. / Embryonic neurogenesis in Drosophila is a highly coordinated sequence of cell fate decisions that bears many similarities to the development of the nervous system in vertebrates. These cell fate decisions are spatially and temporally coordinated. These cells arise at stereotypic positions in each segment and are arranged along two spatial axes: the dorsoventral axis and the anteroposterior axis. Neuroblasts divide to give rise to stereotypic lineages and the cells exhibit characteristic cell morphologies, branching patterns, and targets, the molecular mechanisms that determine these characteristics are still largely unknown. Decades of genetics have uncovered some factors necessary for many of these decisions, but understanding individual neurogenic lineages at the genome level has been impossible in vivo until recently. I have used Single cell mRNA to study the transcriptome dynamics that accompany important fate decisions in early nervous system development. My goal is to decipher how cells differ when decisions are made that are essential for nervous system development. This knowledge is invaluable for developing models for the in vivo mechanisms that allow individual cells in the nervous system to specify and differentiate. I have generated transcriptome data of single cells from tens of thousands of neuroblasts throughout embryonic neurogenesis. I was able to identify specific neurogenic populations and their gene expression profiles along their differentiation pathways. I was able to partially decipher the intricate temporal axes that shape the developing embryonic nervous system, a process that is conserved from fly to human. Single-cell transcriptomics has enabled the identification of localized markers and even specific neuroblasts. This understanding can now be combined with information about the individual cell fates that give rise to these neuroblasts, such as their specific neuronal and glial fates.

Die Modifikation von Chromatin und Histonen sind vielmehr zentrale Ereignisse in der Regulation der Geneexpression. Es ist gut etabliert, dass die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 27 (H3K27me3) durch ‚Polycomb group’ (PcG) Proteine epigenetisches Gedächtnis aufrechterhält. Genomweite Analysen haben jedoch gezeigt, dass ein großer Teil des nicht-exprimierten Genoms die H3K27me3 Modifikation trägt. In dieser Arbeit habe ich RNA-seq und ChIP-seq auf Drosophila Plasmatozyten angewendet und ein hochauflösendes Chromatinprofil generiert. Ich konnte zeigen, dass eine Gruppe von Immungenen, die durch H3K27me3 markiert sind, nach einer Immunstimulierung rasch hochreguliert wird. Weiterhin konnte ich durch die Anwendung eines neu entwickelten Genomanalyse-Algorithmus zeigen, dass diese H3K27me3 positiven Gene in einem Chromatinzustand sind, der sich von kanonischem Polycomb Chromatin unterscheidet. Dieser Chromatinzustand hat zwei wichtige Eigenschaften: Erstens beweise ich, dass H3K27me3 als Antwort auf physiologische Stimuli dynamisch reguliert wird. Zweitens weise ich nach, dass es für den Erhalt eines reprimierten Genezustands instruktiv ist. Daher bezeichne ich diesen Chromatinzustand als dynamisches Polycomb Chromatin. Meine weiteren Analysen haben gezeigt, dass dieses dynamisches Polycomb Chromatin in Drosophila Plasmatozyten mit einer großen Zahl anderer dynamisch regulierter Gene assoziieret ist. Einige dieser Gene wurden ebenfalls nach der Depletion von H3K27me3 hochreguliert. Deshalb schlage ich vor, dass dynamisches Polycomb Chromatin einen neuartigen Chromatinzustand darstellt, der an Genen zu finden ist, deren Transkription durch unvorhersehbare Ereignisse ausgelöst wird. Die Reprimierung durch dynamisches Polycomb Chromatin bildet demnach eine Aktivierungschwelle gegen aberrante Transkription, die aber trotzdem eine rasche Geninduktion in physiologisch relevanten Situationen erlaubt. / Modification of chromatin and histones are central events in regulating gene expression. It is clearly established that histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) by Polycomb group (PcG) proteins maintains the repressed state in epigenetic memory. Genome wide analysis revealed that much of the non-transcribed genome carries the H3K27me3 modification. This raises the question, whether this modification is functionally relevant outside of development to preclude activation of genes through physiological signaling. Here, I applied RNA-seq and ChIP-seq to Drosophila plasmatocytes generating a high resolution epigenetic landscape. Thereby, I demonstrated that a set of H3K27me3 marked immune genes was rapidly transcriptionally induced upon challenge. By applying a newly developed genome clustering algorithm, I demonstrated that these H3K27me3 positive genes are in a chromatin state that is distinct from the canonical Polycomb chromatin. This state has two important properties: First, by demonstrating that in plasmatocytes H3K27me3 is depleted specifically at immune genes after activation, I showed that it is dynamically regulated in response to physiological stimulation. Second, by establishing that immune genes were up-regulated when H3K27me3 was depleted, I confirmed that it is instructive in maintaining a silenced gene state. Therefore, I termed this novel chromatin state dynamic Polycomb chromatin. Further analysis revealed that this dynamic Polycomb chromatin state is also associated with a large number of other dynamically regulated genes. Some of these genes were also up-regulated when H3K27me3 is depleted by genetic manipulation. Hence, I propose that dynamic Polycomb chromatin is a novel chromatin state that targets genes which are triggered by non-predetermined signaling events. Silencing by dynamic Polycomb chromatin thresholds such genes against aberrant gene activation, but permits rapid induction in physiologically relevant situations.

Zelluläre Seneszenz wird als terminaler Zellzyklusarrest definiert, der mit dem Altern und funktionellen Verlust von Geweben verknüpft ist. Eine Seneszenzreaktion wird ebenso durch Onkogene und zytotoxischen Stress verursacht. Die Ausführung des Seneszenzprogramms wird durch eine zeitlich hochdynamische Aktivität von Transkriptionsfaktoren (TF) bedingt. Interessanterweise kann die Zelllinienzugehörigkeit einer Zelle durch die Expression von linien-aberranten TF überschrieben werden. Die vorliegende Arbeit untersucht Chemotherapie-induzierte Seneszenz (TIS) in Bcl-2 überexprimierenden, deshalb vor Apoptose geschützten, murinen Eµ-Myc B-Zell Lymphomen in An- oder Abwesenheit der Seneszenz-essentiellen Histonmethyltransferase Suv39h1. Analysen auf Transkriptom- und auf Proteinebene ergeben dabei, dass in einer Seneszenz-spezifischen Weise die TF AP-1, PU.1 und C/EBPβ induziert werden, welche normalerweise für die Funktion und Entwicklung myeloischer Zelllinien bedeutend sind. Dementsprechend korreliert der Seneszenzzustand mit Transkripten, Oberflächenmarkern und einer enzymatischen Funktion der myeloischen Linie. Indem die identifizierten TFs heruntergeschaltet oder überexprimiert werden, wird ihre direkte Beteiligung an der Linienuntreue der TIS Lymphome demonstriert. TIS-Kapazität wird als für den Erfolg von Krebstherapie günstige Eigenschaft betrachtet, da sie zu einem Wachstumsblock führt. Nichtsdestotrotz können sich verweilende TIS Zellen krebsbiologisch auch nachteilig auswirken. Anhand von murinen und humanen, klinisch annotieren Transkriptomdatensätzen kann hier in beiden Spezies ein myeloisch verschobenes, Linienuntreue anzeigendes Genexpressionsprofil mit einer besseren Überlebensprognose korreliert werden. Die vorliegenden Befunde legen nahe, dass die Modulation von TF Aktivitäten in Seneszenz einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, um den für den Therapieerfolg nützlichen Zweig des TIS Phänotyps zu befördern. / Cellular senescence is regarded as an irreversible cell cycle arrest associated with tissue aging and its functional decline. A senescence response is also evoked by oncogenic and cytotoxic stress. The execution of the senescence program relies on a highly dynamic sequence of transcription factor (TF) activities. Interestingly, cell lineage commitment can be overridden by the expression of lineage-aberrant TFs. This thesis examines chemotherapy-induced senescence (TIS) in Bcl-2 overexpressing, thus apoptosis-protected, murine Eμ-Myc B-cell lymphomas with or without the senescence-essential histone methyltransferase Suv39h1. Transcriptome as well as protein level analyses reveal senescence-specific induction of the TFs AP-1, PU.1 and C/EBPβ which are typically crucial for myeloid lineage commitment and function. Correspondingly, the senescent state associates with myeloid lineage transcripts, surface markers and enzymatic function, reminiscent of, but not equal to a transdifferentiation phenotype. By knocking down and overexpressing the identified TFs, we demonstrate their direct involvement in the lineage infidelity of TIS lymphomas. TIS-capacity is viewed as beneficial to cancer therapy outcome due to its block on proliferation. However, lingering TIS cells can also be detrimental due to the acquisition of latent stemness properties or tumor-protective remodeling of their microenvironment. By interrogating murine and human, clinical course-annotated transcriptome data sets, an association between a myeloid-skewed, lineage infidelity indicating gene expression profile and better tumor prognosis is established in both species. The presented findings suggest that modulation of the senescent TF activities could be therapeutically exploited to foster the cancer patient-beneficial branch of the TIS phenotype.

Die Genregulation ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen die Menge der Genprodukte steuern, um ihre Identität auszubilden und auf Umweltveränderungen zu reagieren. Die CRISPR-Technologie hat genetische Screens revolutioniert und ermöglicht es, mehrere Transkripte gleichzeitig zu untersuchen. In dieser Arbeit werden die Vorteile und Herausforderungen gepoolter CRISPR-Screens zur Erforschung der Genregulation untersucht. Es wird ein CRISPR-ko-Screen in embryonalen Mausstammzellen (mESCs) beschrieben, der pluripotenzerhaltende Transkriptionsfaktoren identifiziert. Es zeigte sich, dass ein Screening mit einer kleinen Bibliothek den Großteil des biologischen Signals eines genomweiten Screens erfasst und die Identifizierung von Genkandidaten mit kleinen Effektgrößen verbessert. Nachfolgend wird CRISPTimeR, eine neue Methode für die Analyse von Zeitreihen von CRISPR-Screens, vorgestellt. Sie basiert auf gemischten linearen Modellen und ermöglicht es, Treffer zu identifizieren und gleichzeitig zeitlich zu klassifizieren. Als Nächstes wurde CRISPRi verwendet, um für die Pluripotenz von mESCs relevante lncRNAs zu untersuchen, was aufgrund ihrer schlechten Annotation und niedrigen Expressionsniveaus schwierig ist. Eine mögliche Lösung ist eine manuell verfeinerte Annotation von Transkriptionsstartstellen und kleinere Bibliotheks-Screens mit empfindlicherer phänotypischer Auslesung. Zudem wurde ein Sättigungsscreen genomischer Regionen rund um den PHOX2B-Lokus, zur Identifikation cis-regulierender Elemente, durchgeführt. Dabei wurden CRISPRa-reaktive Elemente identifiziert, die Gene in der PHOX2B-TAD regulieren, und mit diesen mittels Einzelzell RNA-seq in Verbindung gebracht. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit den Wert gepoolter CRISPR-Screens für die Erforschung der Genregulation und Herausforderungen der Analyse nicht-kodierender Elemente. Zusätzlich beschreibt sie ein neues Tool für die Analyse von kodierenden und nicht-kodierenden CRISPR-Screens in Zeitreihen. / Gene regulation is a complex process in which cells control gene product levels to establish identity and respond to environmental changes. CRISPR technology has revolutionized genetic screening, enabling researchers to study multiple transcripts simultaneously. This thesis explores the advantages and challenges of using pooled CRISPR screens to study gene regulation. First, I describe a CRISPR-ko screen in mouse embryonic stem cells (mESCs) to identify transcription factors involved in pluripotency maintenance. I show that a small-library screen captures most of the biological signal observed in a genome-wide screen, and it improves the identification of candidate genes with small effect sizes. Next, introduce CRISPTimeR, a novel method for the analysis time-series CRISPR screens. CRISPTimeR is based on mixed linear models; it allows to use information from a time-series experiment to identify, and simultaneously perform temporal classification on, hits. Next, I use CRISPRi to study lncRNAs relevant to pluripotency in mESCs. Targeting lncRNAs poses challenges due to poor annotation and low expression levels. I suggest to address these issues by using a hand-refined annotation of transcription start sites and by designing small-library screens with more sensitive phenotypic readout. Finally, I describe a saturation screen targeting large genomic regions around the PHOX2B locus, to identify putative cis-regulatory elements. I identified CRISPRa responsive elements involved in regulating the expression of genes within the PHOX2B TAD, which were then matched with the genes they control using single-cell RNA-seq. Overall, in this thesis I demonstrate the value of CRISPR pooled screens for studying gene regulation, while highlighting the challenges associated with targeting non-coding elements and suggesting possible approaches to address these challenges. Moreover, I introduce a novel tool for the analysis of both coding and non-coding time-series CRISPR screens.