Hintergrund: Experimentelle Studien konnten zeigen, dass Taurolidin intraperitoneales Tumorwachstum durch lokale intraperitoneale Applikation reduzieren kann. Erste Studien zur tumorstatischen Wirksamkeit nach systemischer Bolus-Applikation zeigten keinen Effekt auf das intra- und extraperitoneale Tumorwachstum. In einem neuen Experiment wurde die Wirkung einer einwöchigen intermittierenden Therapie versus einer Bolus-Therapie mit steigenden Konzentration von Taurolidin bis 3% auf das intraperitoneale und subkutane Tumorwachstum untersucht. Methoden: 80 Ratten (BD IX) wurden einer medianen Laparotomie unterzogen. Anschließend wurden 2 x 104 syngenetische Adenokarzinomzellen (DHD/K12/TRb) intraperitoneal und subkutan am Rücken instilliert. Die Tiere wurden in acht Gruppen randomisiert. Vier Gruppen erhielten postoperativ eine intravenöse (iv) Bolustherapie (Taurolidin 1%, 2%, 3%, Ringer-Lösung), vier Gruppen erhielten die Therapie über eine Woche intermittierend viermal täglich über ein iv Port-System. Nach vier Wochen erfolgte die Obduktion und Auswertung des Tumorwachstums hinsichtlich Tumorgewicht und Anzahl der Tumorknoten. Ergebnisse: Die Anzahl der subkutanen Tumorknoten war unter 3% Taurolidin gegenüber der Kontrollgruppe reduziert (p=0,035). Darüberhinaus war ein Trend der Reduktion des subkutanen Tumorgewichtes unter steigender Taurolidinkonzentration zu verzeichnen (p=0,048). Diskussion: Nur die Langzeittherapie über eine Woche mit 3% Taurolidin-Lösung konnte eine diskrete subkutane Tumorreduktion bewirken. Unerwünschte Arzneimittelwirkungen traten bis auf passagäre vagotone Wirkungen bei zu schneller Applikation nicht auf. Schnelle Injektionen sollten vermieden werden. Die Ergebnisse führen über zu weiteren Studien, die die Wirksamkeit von systemischer Applikation an etablierten, vaskularisierten Tumoren untersuchen. / Background: Experimental studies have shown that taurolidine suppresses intraperitoneal tumor growth following local application in rats. In opposite, a single intravenous therapy affected neither intraperitoneal nor subcutaneous growth of malignancies. Thus, an intravenous bolus and long term therapy with 1%, 2% and 3% taurolidine was investigated in rats with intraperitoneal and subcutaneous tumor load. Methods: At the beginning of the operation 10,000 colon adenocarcinoma cells (DHD/K12/TRb) were applied subcutaneously at the back of the rats. Then the animals (n=80, BD IX rats) were randomized into eight groups and underwent a standardized 4 cm midline laparotomy for 30 minutes. At the end of the operation a bolus (1 ml Ringer´s solution) versus a long term intravenous therapy (7 days, eight-hourly 1 ml 1%, 2%, or 3% taurolidine) were performed. For long term therapy a jugularis vein port catheter system was placed and left for one week. The influences on subcutaneous tumor growth, animal growth, general side effects and leukocyte granulocyte counts were analyzed. Total tumor weights were determined four weeks after cell application. Results: The metastatic (subcutaneous) tumor growth showed a dose-dependent reduction of tumor weight (p=0.048) under long term therapy with statistical significancy in solid tumor counts (p=0,035). A slight and temporary depression in animal growth was observed only in long term therapy groups. Independent of the therapeutic agents and the application forms, the operation itself caused a slight leukopenia shortly after the operation compensated by a moderate leukocytosis in the following course. Fast injections of taurolidine led to temporary reduction of breathing rate. Conclusions: Only the intravenous long term therapy of 3% taurolidine led to a slight downregulation in metastatic (subcutaneous) tumor growth. The slight changes of leukocyte counts were not affected by taurolidine. Fast injections have to be avoided. The findings prompted us to start new experiments to determine the influence of increasing doses of taurolidine on progressive tumor growth in rats.

Die innerste Schicht von Blutgefäßen wird durch Endothelzellen geformt. Dort haben sie das Potential neue Blutgefäße durch einen Prozess Namens Angiogenese zu bilden. In Krebspatienten wurde gezeigt, dass Medikamente, die auf Mikrotubuli zielen, die tumorassoziierte Angiogen ese hemmen. Diese Erkenntnis lässt auf eine Rolle der Mikrotubuli-Dynamik im Prozess der Angiogenese schließen. Die fein abgestimmte Mikrotubulus-Dynamik wird durch posttranslationale Tubulinmodifikationen, wie die durch die Vasohibin-1 katalysierte Mikrotubuli-Detyrosinierung, moduliert. Dennoch sind die Rollen der Mikrotubuli-Dynamik und -Detyrosinierung während der Angiogenese noch nicht verstanden. Ich konnte zeigen, dass Mikrotubuli in aussprossenden Zellen schneller und für kürzere Zeit wachsen, und dass sie in Abhängigkeit vom Blutfluss stabilisiert werden. Funktionelle Studien haben gezeigt, dass die Dynamik der Mikrotubuli eine Rolle bei der Streckung und Proliferation von Endothelzellen spielt und dadurch für die korrekte Gefäßmorphogenese notwendig ist. Vasohibin-1 detyrosiniert α-Tubulin und wird im Endothel von Zebrafischen stark exprimiert. Ich habe herausgefunden, dass endotheliales Tubulin vorwiegend in aus sprossenden Gefäßen der hinteren Kardinalvene detyrosiniert wird. Bei sekundären Aus sprossungen führte der Funktionsverlust von Vasohibin-1 zu einer allgemeinen Abnahme der Mikrotubuli-Detyrosinierung, was zu einem abnormalen Sprossungsverhalten führte. Es unter Verlust von Vasohibin-1 eine vermehrte Zellteilung und eine erhöhte Zellzahl in sekundären Aussprossungen gibt. Infolge dessen scheitern diese Zellen daran die Lymphgefäße zu bilden und bauen stattdessen überschüssige Verbindungen zwischen den Venen. Meine Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Tubulin-Detyrosinierung spezifisch die Zellteilung in den sekundären Aussprossungen kontrolliert, um die Bildung der venösen und lymphatischen Gefäße im Zebrafisch-Schwanz zu erreichen. / Endothelial cells form the inner layer of blood vessels. There, they retain the potential to develop into new vessels through a process known as sprouting angiogenesis. Microtubule targeting drugs inhibit tumour-associated angiogenesis in cancer patients, suggesting a role of microtubule dynamics in this process. The fine-tuned microtubule dynamics are modulated by tubulin post translational modifications such as microtubule detyrosination, catalysed by Vasohibin-1. The role of the microtubule dynamics and detyrosination in angiogenesis remains elusive. The aim of my research is to increase the understanding of the role of microtubule dynamics and stability in vessel development and maturation by studying and manipulating the microtubule dynamics in the zebrafish embryo. In Chapter 3, I show that microtubules grow faster and for shorter periods in sprouting cells, and stabilise over time, in a flow-dependent manner. Functional studies showed that microtubule dynamics are necessary for the correct vessel morphogenesis, by playing a role in endothelial cell elongation and proliferation. In Capter 4, I show that Vasohibin-1 detyrosinates α-tubulin and is highly expressed in the endothelium of zebrafish. I found that endothelial tubulin is predominantly detyrosinated in sprouting vessels from the posterior cardinal vein of the zebrafish. In these secondary sprouts, Vasohibin-1 loss-of-function led to an overall decrease of microtubule detyrosination resulting in abnormal sprouting behaviour. High resolution imaging revealed increased cell division and cell numbers in Vasohibin-1 deficient secondary sprouts. These cells then failed to build the lymphatic vessels and instead populate superfluous connections between veins. I propose that tubulin detyrosination specifically controls cell division of secondary sprouts to achieve adequate formation of venous and lymphatic vasculature in the zebrafish trunk.

Für die Progression des Wachstums maligner Tumoren und ihre Metastasierung ist die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, eine essentielle Voraussetzung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die proangiogenen Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3 in ihrer Stabilität gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System durch das COP9-Signalosom (CSN) kontrolliert werden. Dieses bildet einen multimeren Proteinkomplex, der deutliche Homologien mit dem Lid-Subkomplex des 26S-Proteasoms aufweist. Sowohl c-Jun als auch Id3 binden an die Untereinheit CSN5. Id3 interagiert zusätzlich mit CSN7. Rekombinantes c-Jun, ein bekanntes Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD, wird durch Curcumin, einen Hemmstoff dieser Kinasen, deutlich destabilisiert. Daneben induziert Curcumin hochmolekulare Formen von c-Jun, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate handelt. Ferner beschleunigt Curcumin, ebenso wie die CK2- und PKD-Inhibitoren Emdodin, DRB und Resveratrol, in HeLa-Zellen den proteasomalen Abbau von c-Jun. Die c-Jun-abhängige Produktion von VEGF wird durch alle vier Kinase-Hemmstoffe signifikant reduziert. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch den proteasomalen Inhibitor MG-132. Id3 wird nicht von den CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Allerdings hemmt es in einem Kinase-Assay die Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und CSN2. Curcumin und Emodin regen in HeLa-Zellen die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von Id3 an. Die Proteolyse von Id1 wird in HeLa-Zellen ebenfalls in Anwesenheit dieser beiden Hemmstoffe stimuliert. Mittels Kotransfektion von Id3 und His-markiertem Ubiquitin konnte eine verstärkte Ubiquitinierung von Id3 in Gegenwart von Curcumin direkt nachgewiesen werden. Außerdem wird Id3 durch die Überexpression von CSN2 stabilisiert. Auf diesen Daten basiert die Schlussfolgerung, dass die CSN-abhängige Phosphorylierung den Abbau von c-Jun und der beiden Id-Proteine über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System inhibiert und dadurch ein interessantes neues Ziel einer antiangiogenen Tumortherapie repräsentiert. / Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the existing vasculature, is a prerequisite for the progression of solid tumor growth and metastasis. In this study it is shown that the COP9 signalosome (CSN) regulates the stability of the angiogenic transcription factors c-Jun, Id1 and Id3 towards the ubiquitin/26S proteasome system. The COP9 signalosome constitutes a multimeric protein complex that shares sequence homology with the 26S proteasome lid complex. Both c-Jun and Id3 physically interact with the CSN subunit CSN5. In addition, Id3 can bind to CSN7. Recombinant c-Jun, a substrate of the CSN-associated kinases CK2 und PKD, is destabilized by curcumin, an inhibitor of these two kinases. Furthermore, curcumin induces high molecular weight c-Jun species, most likely ubiquitin conjugates. All tested inhibitors of the CK2 and PKD, emodin, DRB, resveratrol, as well as curcumin accelerate the degradation of c-Jun by the 26S proteasome in HeLa cells. The c-Jun-dependent expression of VEGF, the most potent angiogenic factor, is significantly reduced by the four kinase inhibitors. MG-132, an inhibitor of the 26S proteasome, also diminishes the production of VEGF. Id3 is not phosphorylated by the CSN-associated kinases. However, it inhibits c-Jun, ICSBP and CSN2 phosphorylation. Curcumin and emodin significantly induce ubiquitination and proteasome-dependent degradation of Id3 in HeLa cells. Proteasome-dependent degradation Id1 in HeLa cells is also stimulated by treatment with curcumin or emodin. Ubiquitination of Id3 is shown directly by cotransfection of HeLa cells with Id3 and His-tagged ubiquitin. Curcumin increases Id3-ubiquitin conjugate formation. In addition, overexpression of CSN2 leads to stabilization of Id3 protein. On the basis of these data it is concluded that CSN-mediated phosphorylation inhibits ubiquitination and proteasome-dependent degradation of c-Jun, Id1 and Id3. The COP9 signalosome thus represents an interesting new target for antiangiogenic tumor therapy.