The regulation of gene expression is the driver of cellular differentiation in multicellular organisms; the result is a diverse range of cell types each with their own unique profile of expression. Within these cell types the transcriptional product of a gene is up or down regulated in response to intrinsic and extrinsic stimuli according to its own regulatory programme encoded within the cell. The complexity of this regulatory programme depends on the requirements of the gene to change expression states in different cell lineages or temporally in response to a range of conditions. In the case of many housekeeping genes integral to the survival of the cell, this programme is simple - switch on the gene and leave it on, whereas often the required level and precision of regulatory control is much more involved and lends to subtle changes in expression. This raises many questions of precisely where and how that regulatory information is encoded and whether different biological systems encode it in the same way. This project attempts to answer these questions through the development of novel approaches in quantifying the output of this regulatory programme according to the state changes as observed from the expression profile of a given gene. Measures of complexity in gene expression are calculated over a wide range of cell types and conditions collected using CAGE, which provides a quantitative estimate of gene expression that precisely defines the promoter utilised to initiate that expression. As expected, housekeeping genes were found to be amongst the least complex, as a result of their uniform expression profiles, as well as those genes highly restricted in their expression. The genes most complex in their expression output were those associated with the presence of H3K27me3 repressive marks; genes poised for activation in a specific set of cell types, as well as those enriched in DNAse I hypersensitive sites in their upstream region but not necessarily conserved in that region. Evidence also suggests that different promoters associated with a gene contribute in different ways to its resultant regulatory complexity, suggesting that certain promoters may be more crucial in driving the regulation of some genes. This allows for the targeting of such promoters in the analysis of certain diseases implicated by changes in regulatory regions. Indeed, genes known to be associated with diseases such as leukaemia and Alzheimer’s are found to be highly complex in their expression.

De nombreuses altérations épigénétiques ont été décrites dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nous avons récemment mis en évidence un enrichissement anormal en la marque histone H3K27me3, située sur 70 kb du cluster HIST1 (6p22) dans 50% des échantillons de patients atteints d'une LAM avec un caryotype normal (CN). Nous étudions dans ce travail, les conséquences cliniques et moléculaires de cette marque. H3K27me3 HIST1high est associé à 1) une meilleure survie des patients en analyse multivariée 2) la sous-expression du mRNA de plusieurs gènes histones (HIST1H1D, HIST1H2BG et HIST1H2BH) 3) un enrichissement fonctionnel en gènes associés à la réponse immunitaire ou inflammatoire, en faveur d’un engagement dans la différenciation granulocytaire, surexprssion confirmée pour trois de ces gènes (CYBB, FCN1 et CLEC4A) par RT-qPCR dans les blastes de patients H3K27me3 HIST1high 4) une diminution de la quantité absolue de protéine histone linker H1d par spectormétrie de masse et par Western blot et 5) une meilleure sensibilité à la différenciation induite par l'acide rétinoïque dans la lignée OCI-AML3 avec un KD de H1d (augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation CD11B et CD11C, présence de granules intra-cytoplasmiques et expression des gènes CYBB et ITGAM). En conclusion, le biomarqueur H3K27me3 HIST1high est associé à une meilleure survie dans les LAM-CN NPM1mut, un phénotype plus différencié des blastes et une sous-expression génique et protéique de certains histones incluant le sous-type histone linker H1d. H1d semble être important dans la différenciation des blastes de LAM NPM1mut et pourrait constituer une cible thérapeutique. / The epigenetic machinery is frequently altered in acute myeloid leukemia (AML). We previously described an abnormal histone H3K27me3 repressive enrichment covering 70 kb on the HIST1 cluster (6.p22). In the present work, we further studied the medical significance and the molecular impact of this new epigenetic biomarker. We observed that H3K27me3 HIST1high is associated with 1) a better patients' outcome in multivariate analysis, 2) a lower histone mRNA expression of several histone genes (HIST1H1D, HIST1H2BG and HIST1H2BH), 3) a mature granulocytic gene expression profile including immune or inflammatory responsive genes, (we confirmed the higher expression of three of these genes, CYBB, FCN1 and CLEC4A, using qPCR in the H3K27me3 HIST1high patients' samples), 4) a decrease in histone linker H1d absolute protein abundance by Mass spectrometry and by Western blot analyses and 5) a better retinoic acid sensitization of the H1d KD OCI-AML3 cell line (i.e. increase of CD11B and CD11C expression on cell surface, higher percentage of cytoplasmic granules and mRNA up-expression of two mature granulocytic genes, CYBB and ITGAM). To conclude, this study showed that epigenetic silencing of the HIST1 locus by the H3K27me3 mark is associated with a better outcome, but also a mature gene expression profile in the NPM1mut subgroup of patients. We suggested that H1d has an important role of histone linker expression in AML blast cell differentiation. This protein could constitute a new epigenetic target.

En France comme dans la majorité des pays développés, le cancer de la prostate est le plus fréquent chez l’homme. Il est clairement établi que les altérations génétiques et épigénétiques sont des événements communs dans les cancers de la prostate, se traduisant par l’expression aberrante de gènes critiques. La méthylation des histones participe à la régulation de l’expression des gènes dans la cellule. La marque épigénétique H3K27me3 est associée à la répression génique et se trouve dérégulée dans les cancers de la prostate. Ses niveaux sont déterminés par l’équilibre entre les activités de la méthyltransférase d’histone EZH2 et de la déméthylase d’histone JMJD3. Afin de comprendre le mécanisme de dépôt de H3K27me3 dans la tumorigenèse prostatique, le travail de cette thèse s’est orienté sur l’évaluation simultanée de l’impact de JMJD3 et de EZH2. Dans un premier temps, les niveaux d’expression de JMJD3 et de EZH2 ont été montrés augmentés simultanément dans le cancer de la prostate. Cette augmentation est corrélée à un enrichissement de ces deux protéines sur le promoteur des gènes RARβ2, ERα, RGMA, AR et PGR. Dans un deuxième temps, une analyse transcriptomique a permis d’identifier une signature génique corrélée avec le niveau d’agressivité de la tumeur. L’utilisation des « épidrogues » GSK-J4 et DZNeP ciblant JMJD3 et EZH2 permettent de moduler l’expression de ces gènes. L’ensemble de ces résultats caractérise JMJD3 et EZH2 comme des facteurs clés dans le processus de tumorigenèse prostatique. Le panel de gènes identifié devrait permettre de développer de potentiels marqueurs de diagnostic mais également de pronostic dans le cancer de la prostate et sa modulation par les « épidrogues » permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. / In France like in majority of developed countries, prostate cancer is the most common cancer in men. It has been clearly established that genetic and epigenetic alterations are common events in prostate cancer resulting in aberrant gene expression. Histone methylation are involved in gene expression of cells. The H3K27me3 epigenetic mark is a repressive mark and it is deregulated in prostate cancer. H3K27me3 levels are determined by the balance between histone methyltransferase EZH2 and histone demethylase JMJD3 activities. In order to understand the mechanism of H3K27me3 deposition in prostatic tumorigenesis, this thesis focused on the simultaneous assessment of the impact of JMJD3 and EZH2.Firstly, expression levels of JMJD3 and EZH2 were shown to be simultaneously increased in prostate cancer. The increase is correlated to both protein enrichments on RARβ2, ERα, RGMA, AR and PGR gene promotors. Secondly, transcriptomic analysis identified gene signature correlated with tumor aggressiveness. The utilization of GSK-J4 and DZNeP epidrugs targeting JMJD3 and EZH2 allowed us to modulate gene expressionOur results characterized JMJD3 and EZH2 as key factors in prostatic tumorigenesis process. The identified gene panel would be able to develop potential diagnostic and prognostic markers in prostate cancer and their modulation by epidrugs would make new therapeutic strategies.

Les gliomes sont les tumeurs primitives les plus fréquentes du cerveau et restent de mauvais pronostic en raison de l’inefficacité des traitements actuels. Des cellules souches cancéreuses ont été isolées à partir de gliomes de haut grade de l’adulte. Ces cellules souches de gliomes (GSC) peuvent fournir tous les sous-types cellulaires qui composent la tumeur. De nombreuses données indiquent que la résistance aux traitements est due en grande partie aux GSC. Cibler les GSC et leurs propriétés souches constitue donc un enjeu thérapeutique important. [...] Une solution pertinente de ciblage thérapeutique est de forcer les GSC à quitter leur état souche. Dans ce cadre, mes principaux travaux ont eu pour but de caractériser les changements épigénétiques des marques d’histones qui accompagnent la répression des propriétés des GSC par un groupe de micro-ARN, miR-302-367. [...] L’étude de cette plasticité par notre équipe a abouti à l’identification de miR-302-367. Son expression forcée, à l’aide de lentivirus, bloque de façon irréversible les propriétés souches et initiatrices de tumeur des GSC. L’effet suppresseur de tumeur exercé par miR offre la possibilité d’identifier les mécanismes qui régulent le maintien ou la perte des propriétés des GSC. A l’aide d’un modèle formé par une lignée de GSC et de sa contrepartie dépourvue des propriétés souches et tumorigènes GSC-miR-302-367, je me suis attachée à caractériser les méthylations de l’histone H3, qui font parties du code d’histone associé à une transcription génique respectivement active ou réprimée. Je me suis axée sur la triméthylation de la lysine 4 (H3K4me3) et de la lysine 27 (H3K27me3), respectivement permissive et répressive de la transcription. Une analyse par ChIP-seq (Immunoprécipitation de la chromatine-séquençage) des gènes associés à ces marques a été associée à la caractérisation des transcriptomes des cellules par exon-array. Nos résultats montrent que l’expression du groupe de miR-302-367 ne modifie pas de façon globale les taux des marques H3K4me3 et H3K27me3. Par contre, des changements dans des groupes de gènes circonscrits ont pu être identifiés. La corrélation positive observée entre les marques d’histones et les taux d’expression des gènes montre une conservation du code d’histone dans les cellules cancéreuses, au moins pour les marques étudiées. L’analyse des termes GO (Gene Ontology) indique que la perte des propriétés induites par miR-302-367 s’accompagne d’un engagement de GSC dans une voie de différenciation. Les gènes portant la marque répressive dans les GSC-miR-302-367 participent notamment à des catégories fonctionnelles associées à l’expression de propriétés souches et tumorigènes. L’analyse du groupe de gènes portant une marque permissive dans les GSC et répressive dans les GSC-miR-302-367, a révélé un réseau de facteurs de transcription susceptible de participer au contrôle des propriétés souches des GSC. La répression à l’aide de siRNA d’un des membres de ce réseau, le facteur de transcription ARNT2, nous a permis de révéler son rôle dans le maintien des capacités prolifératives des GSC issues de gliomes distincts et dans l’expression du facteur de transcription Nanog, connu pour son rôle central dans le contrôle des propriétés souches des GSC. Nos résultats montrent que l’analyse des changements de marques d’histone offre donc non seulement une vue d’ensemble des différents réseaux moléculaires associés au maintien ou au contraire à la répression des propriétés des GSC, mais permet d’identifier de nouveaux acteurs. L’effet stimulateur d’ARNT2 sur la croissance cellulaire et l’expression de Nanog, dans des GSC dérivées de gliomes différents aux altérations génomiques distinctes, indique que ce facteur de transcription tient une place centrale, insoupçonnée jusqu’à présent, dans la hiérarchie des gènes qui gouvernent les propriétés des GSC. / Gliomas, the most frequent primary brain tumors, are resistant to current therapies and the survival rate of patients is very low. Within high-grade gliomas, a cell sub-population bearing stem-like properties has been isolated. These cells, called glioma stem cell (GSC), are capable of generating all glioma cellular sub-types. Recent data indicates that resistance of these aggressive tumors to therapies is mostly due to GSCs. Thus, targeting the GSCs and their stem-like properties is imperative in order to improve current therapies. [...] Another effective solution to treat GSCs is to force them to lose their stem-like properties. In this context, the aims of my major project were to characterize the epigenetic modifications of histone marks accompanying the loss of GSC stem-like properties under the influence of a cluster of micro-RNA, miR-302-367. GSCs are endowed with an exceptional plasticity, allowing them to gain or lose their stem-like state in response to modifications in their micro-environment. Our results identified the implication of miR-302-367 in the regulation of GSC plasticity. Its stable expression using lentivirus inhibits in an irreversible manner the stem-like and tumorigenic properties of GSC. The tumor-suppressor effect of this miR offers the possibility to decipher the mechanisms responsible for the maintenance or the loss of GSC stem-like properties. Using the model of GSC and their counterparts, GSC-miR-302-367, who lost their stem-like and tumorigenic properties, my aim was to identify the methylation status of histone H3 of the histone code which is known to be associated either to an active or to a repressive gene transcription. I focused on the trimethylation of lysine 4 (H3K4me3) and lysine 27 (H3K27me3), which are associated with an activation or repression of gene transcription, respectively. We performed a ChIP-seq (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing) analysis of the respective associated genes followed by a transcriptomic (exon-array) analysis of both cell lines. Our results show that miR-302-367 expression does not alter in a global manner the expression levels of H3K4me3 and H3K27me3. On the contrary, we were able to detect modifications in a discrete group of genes. At least for the studied marks, the positive correlation between the identified histone marks and the gene expression levels indicates that the histone code is well preserved in cancer. GO (Gene Ontology) analysis indicates that miR-302-367-induced loss of stem-like properties is accompanied with activation of the differentiation process in GSC. Genes implicated in the regulation of stem-like and tumorigenic properties were found to bear the repressive histone mark in GSC-miR-302-367. From our analysis of the group of genes bearing the active histone mark in GSC and the repressive one in GSC-miR-302-367, emerged a network of transcription factors that could possibly participate in the regulation of GSC stem-like properties. Down-regulation using siRNA of a member of this network, namely ARNT2, highlighted its role in the maintenance of the proliferative dynamic, as well as the expression of the transcription factor Nanog (a major regulator of GSC stem-like properties), in GSC derived from distinct gliomas. Our histone mark modification analysis, not only elucidated the molecular pathways implicated in the maintenance or, on the contrary, in the loss of GSC stem-like properties, but also, highlighted the implication of new actors in these processes. The activator effect of ARNT2 on GSC proliferation, as well as on the expression of Nanog, observed in GSC bearing distinct genetic alterations and derived from different glioma, indicates that this transcription factor plays a major role, not documented thus far, in the regulation of GSC stem-like properties.

Les modifications de la chromatine jouent un rôle fondamental dans le contrôle de l’expression des gènes de stress et la mise en place d’une réponse physiologique appropriée en réponse aux signaux environnementaux. Les complexes répressifs polycomb (PRC pour Polycomb Repressive Complexes), PRC1 et PRC2 permettent la répression des gènes via le dépôt des marques H3K27me3 et H2AUb. Ce projet de thèse vise à explorer le rôle de la protéine LHP1, une sous-unité du complexe PRC1 chez Arabidopsis thaliana, dans la régulation de l’homéostasie de la marque H3K27me3 et des voies de signalisation activées par les stress. Nous avons utilisé une approche intégrative pour identifier les réponses immunitaires dé-régulées dans le mutant lhp1 ; mettant ainsi en évidence le rôle de la protéine LHP1 dans la répression de la branche dépendante de MYC2 de la signalisation par l’Acide Jasmonique et l’éthylène. La perte de la protéine LHP1 induit une baisse du niveau de la marque H3K27 me3 dans le corps des gènes ANAC019 et ANAC055, ce qui augmente leur expression et la dérégulation de leurs cible, conduisant ainsi à une résistance accrue aux pucerons, ainsi qu’à une sensibilité plus importante à l’ABA et à une meilleure tolérance à la sècheresse. D’autre part, l’activation de cette voie de signalisation dans le mutant lhp1 induit une baisse d’accumulation de l’Acide Salicylique (SA), due à la dé-régulation des gènes ICS1 et BSMT1, ainsi qu’à une sensibilité accrue au pathogène hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Afin de mieux comprendre la fonction moléculaire de LHP1, nous avons étudié son interaction génétique avec l’histone déméthylase REF6. Nous avons analysé des données de ChIP-seq menées dans les mutants lhp1 et ref6 ainsi que dans le double mutant à la lumière des phénotypes développementaux et physiologiques de ces lignées, mettant ainsi en évidence le rôle complexe de LHP1 dans l’homéostasie de la marque H3K27me3. D’après ces résultats, nous proposons que d’une part, LHP1 est requise pour le recrutement d’histone méthyltransférases sur certains gènes afin de permettre le dépôt de la marque, et que d’autre part, LHP1 protège d’autre loci de l’activité de déméthylases telles que REF6. Nous avons aussi étudié les mécanismes conduisant à une augmentation des niveaux de H3K27me3 sur certains gènes dans le mutant lhp1, et montrons que LHP1 réprime le gène MEA. L’expression ectopique de ce gène dans les tissus somatiques du mutant lhp1 est probablement responsable de l’hyper-méthylation de nombreux loci. Ce groupe de gènes hyper-méthylés dans le mutant lhp1 est enrichi en gènes annotés comme étant impliqués dans les réponses immunitaires, affectant ainsi la régulation transcriptionnelle des gènes de défense, ce qui contribue à la sensibilité accrue du mutant lhp1 aux pathogènes nécrotrophes. Ainsi, nous proposons que l’homéostasie de la marque H3K27me3 est essentielle au développement harmonieux ainsi qu’aux réponses immunitaires de la plante, et que LHP1 contribue au maintien de l’équilibre entre diverses voies de réponse au stress et les processus de croissance. / Chromatin modifications and regulation play a major role in the expression of stress-responsive genes and the instauration of appropriate physiological responses to environmental cues in plants. Polycomb Repressive Complexes (PRCs), PRC1 and PRC2,are involved in the repression of protein-coding genes through the deposition of H3K27me3 and H2Aub. This thesis project explores the role of LHP1, an Arabidopsis thaliana PRC1 protein, in the regulation of H3K27me3 homeostasis and stress-responsive signaling pathways. We used an integrative approach for the identification of immune related pathways de-regulated in the lhp1 mutant, finding that LHP1 is required for the repression of the MYC2 branch of jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) pathway of immunity. Loss of LHP1 induces the reduction in H3K27me3 levels in the gene bodies of ANAC019 and ANAC055, leading to their up-regulation and the mis-regulation of their downstream targets, increasing aphid resistance, ABA sensitivity and drought tolerance in Arabidopsis.On the other hand, the up-regulation of this pathway in lhp1 reduces Salicylic Acid (SA) content caused by a de-regulation of ICS1 and BSMT1, as well as increased susceptibility to the hemibiotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.In order to deepen our comprehension of the molecular role of LHP1, we studied the genetic interaction between this histone reader and the REF6 demethylase. We integrated ChIP-seq, developmental and physiological data of the single lhp1 and ref6 mutants, as well as their respective double mutant, finding that LHP1 plays different roles in the regulation of H3K27me3 homeostasis. Based in on our results we propose that on the one hand, LHP1 is necessary for the recruitment of histone methyltransferases to certain genes to promote the deposition of H3K27me3, while in some other targets it protects this histone mark from the demethylase activity of REF6. We also addressed the phenomenon of H3K27me3 gain in lhp1, and we provide evidence for the role of LHP1 in the repression of MEA, a gene that is de-repressed in the lhp1 mutant and may contribute to the ectopic hyper-methylation of several loci. This set of hyper-methylatedloci in lhp1 is enriched in immune-related genes, impacting the transcriptional regulation of immune responses, a process that contributes to the increased lhp1 susceptibility to necrotrophic pathogens. Therefore, we propose that H3K27me3 homeostasis is a key phenomenon behind developmental and innate immune processes in Arabidopsis, and that LHP1 plays a role as a keeper of the trade-off between diverse stress signaling pathways but also between these and developmental programs.

Die Modifikation von Chromatin und Histonen sind vielmehr zentrale Ereignisse in der Regulation der Geneexpression. Es ist gut etabliert, dass die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 27 (H3K27me3) durch ‚Polycomb group’ (PcG) Proteine epigenetisches Gedächtnis aufrechterhält. Genomweite Analysen haben jedoch gezeigt, dass ein großer Teil des nicht-exprimierten Genoms die H3K27me3 Modifikation trägt. In dieser Arbeit habe ich RNA-seq und ChIP-seq auf Drosophila Plasmatozyten angewendet und ein hochauflösendes Chromatinprofil generiert. Ich konnte zeigen, dass eine Gruppe von Immungenen, die durch H3K27me3 markiert sind, nach einer Immunstimulierung rasch hochreguliert wird. Weiterhin konnte ich durch die Anwendung eines neu entwickelten Genomanalyse-Algorithmus zeigen, dass diese H3K27me3 positiven Gene in einem Chromatinzustand sind, der sich von kanonischem Polycomb Chromatin unterscheidet. Dieser Chromatinzustand hat zwei wichtige Eigenschaften: Erstens beweise ich, dass H3K27me3 als Antwort auf physiologische Stimuli dynamisch reguliert wird. Zweitens weise ich nach, dass es für den Erhalt eines reprimierten Genezustands instruktiv ist. Daher bezeichne ich diesen Chromatinzustand als dynamisches Polycomb Chromatin. Meine weiteren Analysen haben gezeigt, dass dieses dynamisches Polycomb Chromatin in Drosophila Plasmatozyten mit einer großen Zahl anderer dynamisch regulierter Gene assoziieret ist. Einige dieser Gene wurden ebenfalls nach der Depletion von H3K27me3 hochreguliert. Deshalb schlage ich vor, dass dynamisches Polycomb Chromatin einen neuartigen Chromatinzustand darstellt, der an Genen zu finden ist, deren Transkription durch unvorhersehbare Ereignisse ausgelöst wird. Die Reprimierung durch dynamisches Polycomb Chromatin bildet demnach eine Aktivierungschwelle gegen aberrante Transkription, die aber trotzdem eine rasche Geninduktion in physiologisch relevanten Situationen erlaubt. / Modification of chromatin and histones are central events in regulating gene expression. It is clearly established that histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) by Polycomb group (PcG) proteins maintains the repressed state in epigenetic memory. Genome wide analysis revealed that much of the non-transcribed genome carries the H3K27me3 modification. This raises the question, whether this modification is functionally relevant outside of development to preclude activation of genes through physiological signaling. Here, I applied RNA-seq and ChIP-seq to Drosophila plasmatocytes generating a high resolution epigenetic landscape. Thereby, I demonstrated that a set of H3K27me3 marked immune genes was rapidly transcriptionally induced upon challenge. By applying a newly developed genome clustering algorithm, I demonstrated that these H3K27me3 positive genes are in a chromatin state that is distinct from the canonical Polycomb chromatin. This state has two important properties: First, by demonstrating that in plasmatocytes H3K27me3 is depleted specifically at immune genes after activation, I showed that it is dynamically regulated in response to physiological stimulation. Second, by establishing that immune genes were up-regulated when H3K27me3 was depleted, I confirmed that it is instructive in maintaining a silenced gene state. Therefore, I termed this novel chromatin state dynamic Polycomb chromatin. Further analysis revealed that this dynamic Polycomb chromatin state is also associated with a large number of other dynamically regulated genes. Some of these genes were also up-regulated when H3K27me3 is depleted by genetic manipulation. Hence, I propose that dynamic Polycomb chromatin is a novel chromatin state that targets genes which are triggered by non-predetermined signaling events. Silencing by dynamic Polycomb chromatin thresholds such genes against aberrant gene activation, but permits rapid induction in physiologically relevant situations.

Chez les plantes comme chez les animaux, les protéines du groupe Polycomb (PcG) jouent des rôles essentiels dans les processus développementaux par la répression de l'expression des gènes. Ces protéines fonctionnent en complexes multi-protéiques; dont les mieux caractérisés sont Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) et PRC2. Bien que PRC2 a été étudié extensivement chez Arabidopsis, ce n’est que récemment que des composants de PRC1 ont été identifiés chez les plantes et leur mécanisme de fonctionnement reste peu conclusif. Dans mes travaux de thèse, j’ai caractérisé AtRING1, un sous-unité essentiel du PRC1, et AtZRF1, une protéine proposée comme lecteur de l’histone H2A monoubiquitinée (H2Aub1) en aval du fonctionnement du PRC1. Mes résultats montrent qu’une perte-de-fonction totale de AtRING1A, par ‘CRISPR/Cas9 gene-editing’, causes une létalité partielle embryonnaire et la dédifférenciation cellulaire de la plantule d’Arabidopsis. Les mutations du domaine RAWUL au C-terminal de AtRING1A sont plus tolérées mais induisent certains défauts sur la croissance végétative, la floraison, l’organogénèse, et la production des graines. Mes analyses moléculaires révèlent que ces mutations du domaine RAWUL réduisent H2Aub1 et augmentent l’expression de plusieurs gènes essentiels dans la régulation du développement de la plante. Ainsi, mes données ont permis à établir une fonction primordiale de AtRING1 et à attribuer un rôle de son domaine RAWUL dans la déposition de H2Aub1 et répression des gènes in vivo. Nos analyses sur AtZRF1 ont permis à détailler son rôle sur la division and différenciation cellulaire. / In plants as in animals, the Polycomb Group (PcG) proteins play key roles in diverse developmental processes by repressing the expression of genes. These proteins work in multi-protein complexes, among them the best characterized ones are Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) and PRC2. Although PRC2 was extensively studied in Arabidopsis, it is only recently that components of PRC1 were identified in plants and their function mechanism remains largely elusive. My thesis work focused on the characterization of AtRING1A, one of the PRC1 core subunits, and of AtZRF1, a protein proposed as a reader of the histone H2A-monoubiquitin (H2Aub1) downstream to the PRC1 function. My results show that a total loss-of-function of AtRING1A, by CRISPR/Cas9 gene editing, leads to partial embryonic lethal and callus-formation of seedlings in Arabidopsis. Several mutations within the RAWUL domain at the C-terminus of AtRING1A are better tolerated and induce several defects in plant vegetative growth, flowering time, floral organ formation and seed production. My molecular data indicate a role of the RAWUL domain in H2Aub1 deposition in vivo and suppression of several key developmental genes. Our characterization of loss-of-function of AtZRF1 provides important detailed information about its function in the regulation of cell division and cell differentiation.

Depuis la découverte de Phaeodactylum tricornutum par Bohlin en 1897, sa classification au sein de l'arbre de la vie a été controversée. En utilisant des morphotypes ovales et fusiformes Lewin a décrit en 1958 plusieurs traits caractéristiques de cette espèce rappelant la structure des diatomées mettant ainsi fin à la controverse sur la classification de P. tricornutum au sein des Bacillariophycées. Pour se faire, trois morphotypes (ovale, fusiforme et triradié) de Phaeodactylum tricornutum ont été observés. Au cours d’une centaine d’années environ, de 1908 à 2000, 10 souches de Phaeodactylum tricornutum (appelées écotypes) ont été collectées et stockées soit de manière axénique ou en l’état avec leur populations naturelles de bactéries dans les centres des ressources génétiques pour algues, cryo-préservées quand cela est possible. Divers outils cellulaires et moléculaires ont été établis pour disséquer et comprendre la physiologie et l'évolution de P. tricornutum, et/ou les diatomées en général. Grâce à des décennies de recherche et les efforts déployés par de nombreux laboratoires que P. tricornutum est aujourd’hui considérée comme une espèce modèle des diatomées. Le sujet de ma thèse traite majoritairement de la composition génétique et épigénétique du génome de P. tricornutum ainsi que de la diversité morphologique et physiologique sousjacente au sein des populations naturelles prospectées à différents endroits du globe. Pour se faire, j’ai généré les profils chromatiniens en utilisant différentes marques des modifications post-traductionnelles des histones (chapitres 1 et 2) et a également comparé la variation naturelle dans la distribution de certaines marques clés entre deux populations d’écotypes (chapitre 4). Nous avons également généré une carte de la diversité génétique à l’échelle du génome chez 10 écotypes de P. tricornutum révélant ainsi la présence d'un complexe d'espèces dans le genre Phaeodactylum comme la conséquence d’une hybridation ancienne (chapitre 3). Sur la base de nombreux rapports antérieurs et des observations similaires au sein de P. tricornutum, nous proposons l’hybridation naturelle comme une base solide et une possibilité plausible pour expliquer la diversité des espèces chez lest diatomées. De plus, nous avons mis à jour les annotations fonctionnelles et structurelles du génome de P. tricornutum (Phatr3, chapitre 2) et mis au point un algorithme de logiciel convivial pour aller chercher les cibles CRISPR du système d’édition du génome CRISPR / cas9 chez 13 génomes de phytoplancton incluant P. tricornutum (chapitre 5). Pour accomplir tout cela, j'ai utilisé diverses méthodes à la pointe de l’état de l’art comme la spectrométrie de masse, l’immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage à haut débit ainsi que les séquençages du génome entier, de l'ARN et des protocoles d'édition du génome CRISPR et plusieurs logiciels / pipelines de calcul. Ainsi, le travail de thèse fournit une plate-forme complète qui pourra être utilisée à l’avenir pour des études épigénétiques, de génétiques moléculaires et fonctionnelles chez les diatomées en utilisant comme espèce modèle Phaeodactylum tricornutum. Ce travail est pionnier et représente une valeur ajoutée importante dans le domaine de la recherche sur les diatomées en répondant à des questions nouvelles ouvrant ainsi de nouveaux horizons à la recherche en particulier en épigénétique qui joue un rôle important mais pas encore assez apprécié dans le succès écologique des diatomées dans les océans actuels. / Since the discovery of Phaeodactylum tricornutum by Bohlin in 1897, its classification within the tree of life has been controversial. It was in 1958 when Lewin, using oval and fusiform morphotypes, described multiple characteristic features of this species that resemble diatoms structure, the debate to whether classify P. tricornutum as a member of Bacillariophyceae was ended. To this point three morphotypes (oval, fusiform and triradiate) of Phaeodactylum tricornutum have been observed. Over the course of approximately 100 years, from 1908 till 2000, 10 strains of Phaeodactylum tricornutum (referred to asecotypes) have been collected and stored axenically as cryopreserved stocks at various stock centers. Various cellular and molecular tools have been established to dissect and understand the physiology and evolution of P. tricornutum, and/or diatoms in general. It is because of decades of research and efforts by many laboratories that now P. tricornutum is considered to be a model diatom species. My thesis majorly focuses in understanding the genetic and epigenetic makeup of P. tricornutum genome to decipher the underlying morphological and physiological diversity within different ecotype populations. To do so, I established the epigenetic landscape within P. tricornutum genome using various histone post-translational modification marks (chapter 1 and chapter 2) and also compared the natural variation in the distribution of some key histone PTMs between two ecotype populations (chapter 4). We also generated a genome-wide genetic diversity map across 10 ecotypes of P. tricornutum revealing the presence of a species-complex within the genus Phaeodactylum as aconsequence of ancient hybridization (Chapter 3). Based on the evidences from many previous reports and similar observations within P. tricornutum, we propose natural hybridization as a strong and potential foundation for explaining unprecedented species diversity within the diatom clade. Moreover, we updated the functional and structural annotations of P. tricornutum genome (Phatr3, chapter 2) and developed a user-friendly software algorithm to fetch CRISPR/Cas9 targets, which is a basis to perform knockout studies using CRISPR/Cas9 genome editing protocol, in 13 phytoplankton genomes including P. tricornutum (chapter 5). To accomplish all this, I used various state-of-the-art technologies like Mass-Spectrometry, ChIPsequencing, Whole genome sequencing, RNA sequencing, CRISPR genome editing protocols and several computational softwares/pipelines. In brief, the thesis work provides a comprehensive platform for future epigenetic, genetic and functional molecular studies in diatoms using Phaeodactylum tricornutum as a model. The work is an addon value to the current state of diatom research by answering questions that have never been asked before and opens a completely new horizon and demand of epigenetics research that underlie the ecological success of diatoms in modern-day ocean.

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Mammalian cell types and tissues have diverse functional roles within an organism but can be derived by the differentiation of the embryonic stem cells (ESCs). ESCs are pluripotent cells with self-renewal properties. During development subsets of genes in ESCs are activated or silenced for manifestation of the cell type specific function. Gene expression changes occur transiently in early developmental stages, through signals received and executed by a variety of transcription factors (TFs), regulatory elements (promoters, enhancers) and epigenetic modifications of chromatin. Post-translational modifications of the histone tails are regulated by chromatin modifiers and transform the chromatin architecture. Polycomb (PcG) and Trithorax (TrxG) group proteins are the most commonly studied histone modifiers. They were first discovered as repressors (H3K27me3) and activators (H3K4me3) respectively of Homeobox (Hox) genes in Drosophila and they are conserved in mammals. Bivalent chromatin is defined as the simultaneous presence of silencing (H3K27me3) and activating (H3K4me3) histone marks and was first discovered as a feature of many developmental gene promoters of ESCs. Bivalent promoters are thought to be in a ‘poised’ state for later activation or repression during differentiation due to the presence of the two counter-acting histone modifications and a pausing variant of RNA polymerase II (RNAPII) accompanied with intermediate-low levels of expression. By integrative analysis of publicly available ChIP sequencing (ChIP-seq) datasets in murine and human ESCs, we predicted 3,659 and 4,979 high–confidence (HC) bivalent promoters in mouse and human ESCs respectively. Using a peak-based method, we acquire a set of bivalent promoters with high enrichment for developmental regulators. Over 85% of Polycomb targets were bivalent and their expression was particularly sensitive to TF perturbation. Moreover, murine HC bivalent promoters were occupied by both Polycomb repressive component classes (PRC1 and PRC2) and grouped into four distinct clusters with different biological functions. HC bivalent and active promoters were CpG rich while H3K27me3-only promoters lacked CpG islands. Binding enrichment of distinct sets of regulators distinguished bivalent from active promoters and a ‘TCCCC’ sequence motif was specifically enriched in bivalent promoters. Using the recent technology of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) we focused on gene expression heterogeneity and how it may affect the output of differentiation. We collected single cell gene expression profiles for 32 human and 39 murine ESCs and studied the correlation between diverse characteristics such as network connectivity and coefficient of variation (CV) across single cells. We further characterized properties unique to genes with high CV. Highly expressed genes tended to have a low CV and were enriched for cell cycle genes. In contrast, High CV genes were co-expressed with other High CV genes, were enriched for bivalent promoters and showed enrichment for response to DNA damage and DNA repair. Bivalent promoters in ESCs grouped in four distinct classes of variable biological functions according to Polycomb occupancy and three RNAPII variants. To study the dynamics of epigenetic and transcription control at promoters during development, we collected ChIPseq data for two chromatin modifications (H3K4me3 and H3K27me3) and RNAPII (8WG16 antibody) as well as expression data (RNA-seq) across 8 cell types (ESCs and seven committed cell types) in mouse. Hierarchical clustering of 22,179 unique gene promoters across cell types, showed that H3K4me3 peaks are in agreement with the expression data while H3K27me3 and RNAPII peaks were not highly consistent with the hierarchical tree of gene expression. Unsupervised clustering of ChIP-seq and RNA-seq profiles has resulted in 31 distinct profiles, which were subsequently narrowed down to nine major profile groups across cell types. TF enrichment at individual clusters using ChIP sequencing data did not fully agree with the classification of 8 major profile groups. Considering all the above results, three major epigenetic profiles (active, bivalent and latent) seem to be conserved across the species and cell types in our study. These states could recapitulate only a fraction of the transcriptional information - adding other chromatin marks could enrich it - since they are seemingly unaffected by their respective expression profiles. H3K27me3 only state has low CpG density and shows stronger signatures at differentiated cell types. Transcriptional control is tighter in active than bivalent promoters and the different occupancy levels of PcG subunits and RNAPII can be reflected at the expression variance of bivalent genes, where a fraction of them are involved in developmental functions while others are more tissue-specific. Last, there is a striking similarity in the pausing patterns of RNAPII in the progenitor cell types, which suggests that RNAPII pausing is correlated with the developmental potential of the cell type. Finally, this analysis will serve as a resource for future studies to further understand transcriptional regulation during development.