Diss. med. Fak. Bern, 1991.

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Zelluläre Seneszenz wird als terminaler Zellzyklusarrest definiert, der mit dem Altern und funktionellen Verlust von Geweben verknüpft ist. Eine Seneszenzreaktion wird ebenso durch Onkogene und zytotoxischen Stress verursacht. Die Ausführung des Seneszenzprogramms wird durch eine zeitlich hochdynamische Aktivität von Transkriptionsfaktoren (TF) bedingt. Interessanterweise kann die Zelllinienzugehörigkeit einer Zelle durch die Expression von linien-aberranten TF überschrieben werden. Die vorliegende Arbeit untersucht Chemotherapie-induzierte Seneszenz (TIS) in Bcl-2 überexprimierenden, deshalb vor Apoptose geschützten, murinen Eµ-Myc B-Zell Lymphomen in An- oder Abwesenheit der Seneszenz-essentiellen Histonmethyltransferase Suv39h1. Analysen auf Transkriptom- und auf Proteinebene ergeben dabei, dass in einer Seneszenz-spezifischen Weise die TF AP-1, PU.1 und C/EBPβ induziert werden, welche normalerweise für die Funktion und Entwicklung myeloischer Zelllinien bedeutend sind. Dementsprechend korreliert der Seneszenzzustand mit Transkripten, Oberflächenmarkern und einer enzymatischen Funktion der myeloischen Linie. Indem die identifizierten TFs heruntergeschaltet oder überexprimiert werden, wird ihre direkte Beteiligung an der Linienuntreue der TIS Lymphome demonstriert. TIS-Kapazität wird als für den Erfolg von Krebstherapie günstige Eigenschaft betrachtet, da sie zu einem Wachstumsblock führt. Nichtsdestotrotz können sich verweilende TIS Zellen krebsbiologisch auch nachteilig auswirken. Anhand von murinen und humanen, klinisch annotieren Transkriptomdatensätzen kann hier in beiden Spezies ein myeloisch verschobenes, Linienuntreue anzeigendes Genexpressionsprofil mit einer besseren Überlebensprognose korreliert werden. Die vorliegenden Befunde legen nahe, dass die Modulation von TF Aktivitäten in Seneszenz einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, um den für den Therapieerfolg nützlichen Zweig des TIS Phänotyps zu befördern. / Cellular senescence is regarded as an irreversible cell cycle arrest associated with tissue aging and its functional decline. A senescence response is also evoked by oncogenic and cytotoxic stress. The execution of the senescence program relies on a highly dynamic sequence of transcription factor (TF) activities. Interestingly, cell lineage commitment can be overridden by the expression of lineage-aberrant TFs. This thesis examines chemotherapy-induced senescence (TIS) in Bcl-2 overexpressing, thus apoptosis-protected, murine Eμ-Myc B-cell lymphomas with or without the senescence-essential histone methyltransferase Suv39h1. Transcriptome as well as protein level analyses reveal senescence-specific induction of the TFs AP-1, PU.1 and C/EBPβ which are typically crucial for myeloid lineage commitment and function. Correspondingly, the senescent state associates with myeloid lineage transcripts, surface markers and enzymatic function, reminiscent of, but not equal to a transdifferentiation phenotype. By knocking down and overexpressing the identified TFs, we demonstrate their direct involvement in the lineage infidelity of TIS lymphomas. TIS-capacity is viewed as beneficial to cancer therapy outcome due to its block on proliferation. However, lingering TIS cells can also be detrimental due to the acquisition of latent stemness properties or tumor-protective remodeling of their microenvironment. By interrogating murine and human, clinical course-annotated transcriptome data sets, an association between a myeloid-skewed, lineage infidelity indicating gene expression profile and better tumor prognosis is established in both species. The presented findings suggest that modulation of the senescent TF activities could be therapeutically exploited to foster the cancer patient-beneficial branch of the TIS phenotype.

Zelluläre Seneszenz beschreibt einen terminalen Zellzyklus-Arrest. Nach zellulärem Stress u. a. durch aktivierte Onkogene oder DNA-schädigende Chemotherapie wird Seneszenz induziert und kann so zur Tumorsuppression bzw. zum Behandlungserfolg beitragen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-kappaB – welcher bisher vor allem durch seine onkogenen Funktionen mit Krebs in Verbindung gebracht wurde - bei der Seneszenz-assoziierten Zytokinausschüttung mitwirkt und den seneszenzten Phänotyp möglicherweise sogar verstärkt, wodurch NF-kappaB potentiell eine tumorsuppressive Rolle zukäme. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des NF-kappaB-Signalweges in Seneszenz und Therapie. In der vorliegenden Arbeit zeige ich die deutliche Aktivierung von NF-kappaB nach Therapie-induzierter Seneszenz (therapy-induced senescence, TIS) und erhöhte Expression NF-kappaB-regulierter Zytokine. TIS ist vor allem in vivo mit starker Aktivität des NF-kappaB-Signalweges assoziiert und von selbiger abhängig. Primäre Eµ-myc-transgene Mauslymphome wurden nach ihrer endogenen NF-kappaB-Aktivität klassifiziert bzw. mit inhibierenden und aktivierenden NF-kappaB-Konstrukten modifiziert, welche auch in diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) als natürlich vorkommende Mutationen gefunden wurden. Über einen neuartigen „Cross-Species“-Vergleich wurden Bcl2-hochexprimierende Keimzentrums-B-Zell-DLBCL (germinal center B-cell type, GCB) als klinisch relevante Gruppe identifiziert, welche nach NF-kappaB-Hyperaktivierung signifikant besser auf Therapie ansprach. Diese Ergebnisse zeigen eine kontextspezifische, d. h. von „onkogenen Netzwerken“ abhängige Rolle des NF-kappaB Signalweges unter Chemotherapie. Diese Information könnte für künftige klinische Studien bedeutsam sein, da sie Bedingungen aufzeigt, unter denen NF-kappaB als Vermittler einer erwünschten Therapie-induzierten Seneszenzantwort eher nicht inhibiert werden sollte. / Cellular senescence is a terminal cell-cycle arrest program that is executed in response to cellular stresses, such as activated oncogenes or DNA-damaging anti-cancer chemotherapy, where it serves as a tumor-suppressive mechanism or contributes to treatment outcome, respectively. Recently, transcription factor NF-kappaB which has long been linked to cancer development primarily through its oncogenic functions, has been postulated to participate in a senescence-associated and possibly senescence-reinforcing cytokine response, thereby suggesting a tumor-restraining role for NF-kappaB. The aim of my PhD project was to understand the role of the NF-kappaB pathway in senescence and cancer treatment outcome. In this thesis, I show markedly elevated NF-kappaB activity upon therapy-induced senescence (TIS), associated with strong upregulation of NF-kappaB-controlled cytokines. TIS is associated with and depends on hyper-activated NF-kappaB signaling. By characterization and genetic engineering of primary mouse lymphomas according to distinct NF-kappaB-related oncogenic networks reminiscent of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) subtypes, Bcl2-overexpressing germinal center B-cell-like (GCB) DLBCL were identified as a clinically relevant subgroup with significantly superior outcome when NF-kappaB is hyperactive. These results demonstrate the context-dependent role of NF-kappaB signaling in cancer therapy and unveil oncogenic scenarios in which NF-kappaB hyperactivity unexpectedly accounts for superior long-term outcome to therapy. This finding has significant ramifications for future clinical trials that aim at inhibiting NF-kappaB activity based on the assumption of its detrimental impact on treatment outcome.

A major challenge in designing cancer therapies is the induction of cancer cell apoptosis, although activation of intrinsic apoptotic pathways by targeting gold nanoparticles to mitochondria is promising. We report an in vitro procedure targeting mitochondria with conjugated gold nanoparticles and investigating effects on apoptosis induction in the human breast cancer cell line Jimt-1. Gold nanoparticles were conjugated to a variant of turbo green fluorescent protein (mitoTGFP) harbouring an amino-terminal mitochondrial localization signal. Au nanoparticle conjugates were further complexed with cationic maltotriose-modified poly(propylene imine) third generation dendrimers. Fluorescence and transmission electron microscopy revealed that Au nanoparticle conjugates were directed to mitochondria upon transfection, causing partial rupture of the outer mitochondrial membrane, triggering cell death. The ability to target Au nanoparticles into mitochondria of breast cancer cells and induce apoptosis reveals an alternative application of Au nanoparticles in photothermal therapy of cancer.

Das metastasierende kolorektale Karzinom stellt eine große Herausforderung in der Krebstherapie dar. Verlässliche und effiziente Biomarker zur Prognose des Krankheitsverlaufes oder der Therapieantwort (Prädiktion) sind rar. Metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) ist ein prognostischer, prädiktiver und kausaler Biomarker für verschiedene Tumorentitäten. Durch die Induzierung von Zielgenen, wie z.B. MET, beeinflusst es Signalwege wie MEK/ERK und AKT/β-catenin und fördert so Zellproliferation und -motilität sowie Tumorprogression und Metastasierung in vivo. Diese Arbeit sollte neue Strategien erforschen diese Prozesse durch die Inhibition von MACC1 auf Transkriptions- und Signaltransduktionsebene zu unterbinden. Mit zwei verschiedenen Screeningmethoden konnten wir Statine als potente transkriptionelle Inhibitoren von MACC1 als auch phosphotyrosin (pY)-abhängige Interaktionen von MACC1 mit essentiellen Signalmolekülen identifizieren: SHP2, GRB2, SHC1, PLCG1 und STAT5B. Statine verringerten MACC1-spezifische Proliferation und Koloniebildung in vitro als auch Tumor Wachstum und Metastasierung in vivo bei Dosen äquivalent der humanen Standardtherapie zur Blutlipidsenkung. Mutation der pY-Bindungsstellen reduzierte die Aktivität des MACC1-induzierten ERK Signalwegs sowie Zellmigration und -proliferation. Anhand unserer Daten orchestriert MACC1, abhängig von MET und EGFR, neue SHP2/SRC/ERK und PKA/SRC/CREB Signalkaskaden zu einem malignen Phänotyp. Gezielte Intervention restringierte die MACC1-abhängige Koloniebildung, was neue therapeutische Interventionspunkte identifiziert und eine hervorragende Basis für Untersuchungen zur Kombinationstherapie darstellt. Die weitere Erforschung der spatiotemporalen Organisation des MACC1 Signalosoms und assoziierter Signalkaskaden soll das volle therapeutische Potential von MACC1 ausschöpfen. Wir empfehlen zudem Statine in der Krebstherapie bzw. -prävention, besonders bei MACC1-stratifzierten Patienten, anzuwenden. / Metastatic colorectal cancer still represents a major challenge in therapy. Reliable and efficient biomarkers for early prognosis of disease course or treatment response (prediction) remain scarce. Metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) has been established as prognostic, predictive and causal biomarker for several tumor entities. Its induction of target genes such as MET affects several signaling pathways including MEK/ERK and AKT/β-catenin. Thus, it promotes cellular proliferation and motility as well as tumor progression and metastasis formation in vivo. This study intended to explore new strategies to inhibit these processes by targeting MACC1 on transcriptional and signaling level. By two distinct screening methods, we identified statins as potent MACC1 transcriptional inhibitors as well as phosphotyrosine (pY)-dependent interactions of MACC1 with crucial signaling molecules: SHP2, GRB2, SHC1, PLCG1 and STAT5B. Statins showed MACC1-specific reduction of proliferation and colony formation in vitro as well as restriction of tumor growth and metastasis formation in vivo at doses equivalent to human standard lipid reduction therapy. Mutation of the pY-interaction sites abrogated MACC1-dependent ERK signaling as well as cell migration and proliferation. Our data further suggest that MACC1 governs SHP2/SRC/ERK and PKA/SRC/CREB axes conferring a malignant phenotype in response to MET and EGFR. Targeted intervention restricted MACC1-dependent colony formation which indicates new drug intervention points for MACC1 signaling and provides an excellent baseline for further investigations of combinatorial treatments. Additional research about the spatiotemporal organization of MACC1 signalosome formation and downstream signaling will reveal the entire potential of MACC1 as therapeutic target, whereas statins should already be considered for cancer therapy or prevention, especially in patients stratified for MACC1 expression.

Die thermische Magnetresonanz (ThermalMR) integriert Radiofrequenz (RF)-induzierte Erwärmung, in vivo Temperaturkartierung mittels MR-Thermometrie, anatomische und funktionelle MR-Bildgebung (MRT) und die Option für die x-Kern-MRT in einem einzigen, vielseitig einsetzbaren RF-Applikator. Der Aufbau erlaubt eine gezielte und überwachte Temperaturmodulation und kann somit als Basis für Studien dienen, welche die Klärung grundlegender Fragen bezüglich der molekularen, biochemischen, sowie physiologischen und therapeutischen Auswirkungen der Temperatur in Organismen ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein kostengünstiges, automatisiertes Open-Source-3D-Mehrzweck-Messsystem mit Submillimeter-Genauigkeit implementiert und validiert, um technische Entwicklungen in der thermischen MR wie Antennendesign, Signalgeneratoren, und simulationsbasierte Methoden zu prüfen. Um den Anforderungen eines modernen ThermalMR-Systems gerecht zu werden, wird ein neuer auf einem Phasenregelkreis basierender RF-Signalgenerator für Hyperthermie entwickelt und über dessen Entwurf, Implementierung, Validierung und Anwendung berichtet. Der Signalgenerator ist in der Lage, 32 unabhängige RF-Signale mit präziser Einstellung der Parameter dieser Signale zu erzeugen. Das in dieser Arbeit entwickelte Mehrkanal-RF-Überwachungsmodul ermöglicht das Detektieren von Abweichungen bezogen auf die gewählten Einstellungen und ermöglicht eine Korrektur der RF-Signale in einem Regelkreis. Darüber hinaus ermöglicht das Überwachungsmodul das Erkennen von Bewegungen und ermöglicht zusätzliche Sicherheit in einem realen Behandlungssetup. In dieser Arbeit wurden Forschung und Entwicklung in Informatik, Physik und Biowissenschaften synergetisch miteinander verbunden. Die in dieser Arbeit entwickelte Infrastruktur bildet eine technologische Basis für zukünftige ThermalMR-Anwendungen. / Thermal magnetic resonance (ThermalMR) integrates radio frequency (RF)-induced heating, in vivo temperature mapping using MR thermometry, anatomic and functional MR imaging (MRI), and the option for x-nuclei MRI in a single, multi-purpose RF applicator. This permits supervised targeted temperature modulation, thus enables pioneering studies to clarify fundamental questions pertaining to the molecular, biochemical, broader physiological and therapeutic effects of temperature in organisms. In this work, a cost-effective, automated open source 3D multipurpose measurement system with submillimeter fidelity was implemented and validated to facilitate technical developments in ThermalMR such as RF antenna design and algorithm verification. The design, implementation, validation, and application of the first phase-locked loop based RF signal generator in hyperthermia that is capable of generating 32 channels of independent RF signals with fine-tuning resolutions of the signals’ parameters meet the demanding requirements of a state-of-the-art RF heating system. The multi-channel RF supervision module developed in this work outperforms state-of-the-art counterparts. The detection of head motion in a hyperthermia setting was demonstrated for the first time with the RF supervision module. This work synergistically connects research and development in computer science, physics, and life science. The infrastructure developed in this work forms a technological basis for future ThermalMR applications.

Das Zytokin Interleukin-7 (IL-7) ist für die Entstehung und das Überleben reifer T Zellen von zentraler Bedeutung. Die Gabe von IL-7 führt sowohl in der Maus als auch im Menschen zu erhöhten T Zellzahlen und einem veränderten T Zellphänotyp. Folglich könnte sich die therapeutische Gabe von IL-7 bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem positiv auswirken. Diese Hypothese wird derzeit in mehreren klinischen Studien untersucht. Bisher wurde allerdings nur die Wirkung von IL-7 auf T-Zellen studiert. Zu dessen Wirkung auf andere Immun- oder Stromazellen sowie deren IL-7-abhängigen Beitrag zur Regulation der T-Zellhomöostase ist nur wenig bekannt. Daher war es Ziel der Arbeit, den Einfluss einer therapeutischen Gabe von IL-7 auf adoptiv-transferierte T-Zellen in IL-7-Rezeptor (IL-7R)-kompetenten und defizienten lymphopenischen Mäusen zu studieren. Die Untersuchungen bestätigen, dass die Gabe von IL-7 T-Zellantworten unterstützt, zeigen jedoch auch, daß viele dieser Effekte von IL-7R-exprimierenden Wirtszellen abhängig sind. Dies weist darauf hin, dass IL-7R-vermittelte Signale in Wirtszellen indirekt T-Zellantworten beeinflussen. Zudem zeigte sich, dass effiziente anti-Tumor-T Zellantworten von IL 7R-vermittelten Signalen in Wirtszellen abhängen. Vor allem nicht-hämatopoetische Wirtszellen fungieren hier als Regulatoren der IL-7-Therapie-vermittelten T Zelldifferenzierung. Unsere Ergebnisse bestätigen außerdem, dass Stromazellen in verschiedenen Organen il-7 exprimieren und zeigen darüber hinaus, dass diese Zellen durch die Gabe von IL-7 beeinflusst werden. Wir folgern daraus, dass die Effekte der IL-7-Therapie auf T Zellhomöostase teilweise indirekt über il-7-exprimierende Stromazellen vermittelt werden. Um diese Zellen genauer identifizieren und untersuchen zu können, haben wir ein neues transgenes Mausmodell charakterisiert, was es erleichtern wird, die beteiligten molekularen Signalwege zu analysieren und den Erfolg der adoptiven T Zelltherapie zu verbessern. / Interleukin-7 (IL-7) is an essential cytokine required for the development and maintenance of mature T cell. Its availability is limited under normal conditions, but rises during lymphopenia, leading to increased T cell proliferation. The administration of recombinant IL-7 to normal or lymphopenic mice and humans results in increased T cell numbers and altered T cell phenotype. Hence, IL-7 administration could mediate therapeutic benefits in immunocompromised patients and is currently tested in several clinical trials. However, besides its well-studied effects on T cells little is known about the effect of IL-7 on other immune and non-immune cells and their influence on T cell homeostasis. Therefore, we evaluated the effect of IL-7 therapy on adoptively transferred T cells in IL-7 receptor (IL-7R)-competent and IL-7R-deficient lymphopenic mice. We confirm the benefits of IL-7 therapy on T cell responses but additionally show that many of these effects are dependent on IL-7R expression by host cells, indicating that IL-7R signaling in host cells modulates T cell responses. We show that efficient T cell responses against cancer are dependent on host IL-7R signaling. Based on studies in bone-marrow chimeric mice, we identify non-hematopoietic host cells as main regulators of IL-7 therapy-modulated T cell differentiation. We conclude from these data that IL-7 therapy affects non-hematopoietic stromal cells that modulate the success of adoptive T cell therapy. Our results confirm that stromal cells in various organs express il-7 and show that these cells are targeted by IL-7 therapy in vivo. Hence, we propose that il-7-expressing cells regulate IL-7 therapy-modulated T cell homeostasis. To identify and study these il-7 expressing stromal cells in more detail, we characterized a new transgenic mouse model that will facilitate determining the molecular pathways to improve the success of adoptive T cell therapy.

Herkömmliche Zytostatika greifen vornehmlich in den Zellzyklus ein und somit werden Zellen mit hoher Proliferationsrate geschädigt. Allerdings fallen hierunter nicht ausschließlich Krebszellen, sondern auch gesunde, schnell proliferierende Gewebearten. Auf Grund dessen verursacht eine klassische Chemotherapie schwerwiegende Nebenwirkungen. Neuere Therapieansätze greifen daher geno- sowie phänotypischer Unterschiede zwischen malignen und gesunden Zellpopulationen auf und können selektiv den zytotoxischen Wirkstoff in die Tumorpopulation einbringen. Dazu werden sogenannte Prodrug-Konzepte verfolgt, bei denen ein möglichst „untoxisches” Prodrug gezielt im entarteten Gewebe enzymatisch zum zytotoxischen Wirkstoff (Drug) aktiviert wird. In diesem Rahmen werden Substrate für die Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT) hergestellt. Bei diesem Konzept wird eine hohe Tumorspezifität durch Konjugate aus Enzymen und Antikörpern erlangt, indem das Immunglobulin selektiv an tumorassoziierte Antigene bindet und durch das konjugierte Enzym die Drugfreisetzung ermöglicht wird. Die natürlichen zytotoxischen Antibiotika (+)-CC 1065 und (+)-Duocarmycin SA dienen hierbei als Leitstrukturen für die Synthese entsprechender Prodrugs. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt zwei neue Duocarmycin-analoge Prodrugs sowie neun neue seco-Drugs synthetisiert, wobei vier Vertreter eine terminale Alkinfunktion aufweisen. Für die Darstellung der Prodrugs wurden auf die Galaktose als Glykosideinheit zurückgegriffen. Zudem wurde ein neuartiges dimeres seco Drug hergestellt, das aus zwei pharmakophoren Einheiten sowie einem verbrückenden Linker mit Alkineinheit besteht. Die jeweiligen Substanzen wurden auf ihre In-vitro-Zytotoxizitäten sowie die Eignung für eine Anwendung im ADEPT-Ansatz evaluiert. Neun der neuen Duocarmycin-Analoga wurden in Form von seco- und Prodrugs wurden im Rahmen des aktivitätsbasierten Protein-Profilings untersucht. Hierbei konnte die Aldehyddehydrogenase 1 als wichtiges Angriffsziel der Duocarmycin-Familie verifiziert werden.

Die Entwicklung von enzymfreien, isothermen Nachweisverfahren für Nukleinsäuren, die mit der PCR konkurrieren können, ist seit langem ein Ziel. Eine potenzielle Strategie besteht darin, Nukleinsäure-templierte Reaktionen zu verwenden, bei denen das Templat (Analyt) als Katalysator fungiert und das Signal verstärkt. Die derzeitig verwendeten Strategien, wie Ligations- oder Transferreaktionen, sind jedoch in ihrer Empfindlichkeit aufgrund des Effekts der Produktinhibierung begrenzt. Um dies zu überwinden, müssen die Reaktanten nicht nur sequenzspezifisch an die DNA oder RNA binden, sondern die Produkte müssen sich auch von der DNA oder RNA wieder lösen können. Diese Arbeit stellt ein neues Paradigma für Nukleinsäure templierte Reaktionen vor: Das Loss-of-Affinity Prinzip. In diesem Prinzip werden Produkte generiert, die eine geringere Affinität zum Templat aufweisen als die Reaktanten. Dadurch wird die Produktinhibierung verhindert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Loss-of-Affinity Prinzip mit triplexbildenden, spaltbaren bis-PNA Sonden untersucht. Diese erfuhren eine C-O-Bindungsspaltung, ausgelöst durch die katalytische Photoreduktion eines Rutheniumkomplexes. Nach mehreren Optimierungsrunden zeigte eine 10-mer bis-PNA Sonde eine beeindruckende katalytische Effizienz. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Loss-of-Affinity Prinzip zur Überwindung der Produktinhibierung genutzt werden kann. Die verwendeten bis-PNAs zeigten jedoch eine stark unspezifische Bindung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die bis-PNA Sonden gegen PNA- und GPNA-Spermin Sonden ausgetauscht, um das Problem der unspezifischen Bindung zu überwinden. Die PNA- und GPNA Spermin Sonden zeigten die wahrscheinlich effizientesten, bisher bekannten Nukleinsäure templierten Reaktionen, welchee die meisten natürlichen Enzyme übertrafen. Darüber hinaus zeigten sie eine ausgezeichnete Sequenzspezifität. / Developing enzyme-free isothermal detection methods of nucleic acids that can challenge PCR has been a long-standing goal. One potential strategy revolves around nucleic acid-templated reactions, in which the template (analyte) can act as a catalyst and amplify the signal. However, current strategies such as ligation reactions or functional group interconversions are plagued by product inhibition, which limits the sensitivity. To overcome this, the reactants must not only bind to DNA or RNA in a sequence-specific manner, but the products must also be able to detach from the DNA or RNA. This work introduces a new paradigm to nucleic acid-templated reactions, the loss-of-affinity principle, which yields products that have a lower template affinity than the reactants. This prevents product inhibition. In the first part of this work, the loss-of-affinity principle was explored with triplex-forming immolative bis-PNA probes that underwent a C-O bond cleavage upon catalytic photoreduction using a ruthenium complex. After several rounds of optimization, a 10-mer bis-PNA demonstrated an impressive catalytic efficiency. These results demonstrate that the loss-of-affinity principle can be used to overcome product inhibition. However, the bis-PNAs demonstrated highly non-specific binding. In the second part of this work, the bis-PNAs were replaced with PNA- and GPNA-spermine probes to address the issue of non-specific binding. The PNA- and GPNA-spermine probes exhibited probably the most efficient nucleic acid-templated reactions to date, outperforming most natural enzymes. In addition, they demonstrated excellent sequence specificity.