Mechanistic insights into how enduring menstrual cycle hormonal signaling promotes tumorigenesis are emerging. We performed a genome-wide screen in primary epithelial cells to identify hormonally-regulated candidates that initiate pro-tumorigenic phenotypes in normal cells. One candidate, DACH2, has been described as part of a network that regulates organogenesis during development. In vitro, we find that DACH2 expression is regulated by estrogen and progesterone in a dosage dependent manner. Lentiviral-mediated shRNA silencing of DACH2 in hormonally responsive tissues promotes expansion of cells with progenitor characteristics. Within gene expression profiles of fallopian tubes, DACH2 is a member of a minimal gene classifier that distinguishes follicular versus luteal phases. Decreased DACH2 is characteristic of luteal-phase tubal cells and the majority of ovarian serous carcinomas. These studies suggest that DACH2 may orchestrate a physiological program that, when deregulated, locks cells in a progenitor-state, induces uncontrolled proliferation, and predisposes cells for breast and ovarian carcinogenesis.

Mechanistic insights into how enduring menstrual cycle hormonal signaling promotes tumorigenesis are emerging. We performed a genome-wide screen in primary epithelial cells to identify hormonally-regulated candidates that initiate pro-tumorigenic phenotypes in normal cells. One candidate, DACH2, has been described as part of a network that regulates organogenesis during development. In vitro, we find that DACH2 expression is regulated by estrogen and progesterone in a dosage dependent manner. Lentiviral-mediated shRNA silencing of DACH2 in hormonally responsive tissues promotes expansion of cells with progenitor characteristics. Within gene expression profiles of fallopian tubes, DACH2 is a member of a minimal gene classifier that distinguishes follicular versus luteal phases. Decreased DACH2 is characteristic of luteal-phase tubal cells and the majority of ovarian serous carcinomas. These studies suggest that DACH2 may orchestrate a physiological program that, when deregulated, locks cells in a progenitor-state, induces uncontrolled proliferation, and predisposes cells for breast and ovarian carcinogenesis.

Glioblastoma is the most common and fatal adult primary brain tumour. Despite maximum therapy, median survival time is 14 months after diagnosis. Senescence is a cellular stress response that results in irreversible growth arrest with continued metabolic activity. It has been shown to be a novel mechanism to inhibit tumorigenesis and tumor progression. However, the role of senescence in glioblastoma is poorly understood. Furthermore, resistance to therapy is believed to be in large part due to extensive heterogeneity in glioblastoma at the molecular level. While this has shed light on the biological understanding of glioblastoma, the impact of such heterogeneity in glioblastoma with respect to therapeutic mechanisms such as senescence induction is largely unknown and warrants further investigation. Primary glioblastoma cells constitute an important model of study as they are a closer representation of the parent disease. In the present study, previously isolated primary glioblastoma cells from human patients were characterized according to their molecular subtype by microarray expression analysis. PriGO7A, PriGO8A and PriGO9A cells were predominantly of the classical subtype whereas PriGO17A were predominantly mesenchymal. I investigated the response of these PriGO cells towards various stress inducing agents to determine their capability to undergo senescence. PriGO8A and PriGO9A cells underwent senescence in response to serum characterized by increased SAβGal activity, PML bodies, p21 and morphological changes characteristic of senescence. This occurred in the absence of a detectable DNA damage response as seen without an increase in γH2AX foci. There was also a lack of a senescence-associated secretory phenotype. Ionizing radiation, known to induce senescence in fibroblasts by inducing double stranded DNA damage, caused cell death but not senescence in PriGO8A and PriGO9A cells. Similarly, exposure of PriGO8A and PriGO9A cells to Triapine (an agent known to cause single stranded DNA damage) induced cell death without senescence. PriGO17A cells did not show evidence of cell death or senescence upon exposure to any of the above agents. In subsequent studies, I investigated the molecular mechanism responsible for induction of senescence in PriGO cells. Microarray expression analysis revealed that serum exposure in PriGO8A cells increased the expression of genes associated with the Transforming growth factor-β (TGFβ) pathway. The response of PriGO8A cells to serum was attributed at least in part to TGFβ that was dependent on basal expression of the TGFβ activator protein thrombospondin. PriGO7A cells lacked basal thrombospondin expression and did not undergo senescence in response to serum, but exhibited senescence in response to TGFβ. PriGO17A cells, on the other hand, exhibited senescence in response to TGFβ only when Ras activity was blocked. In conclusion, primary glioblastoma cells retain a functional senescence program capable of undergoing senescence in response to TGFβ, which suggests senescence can potentially be exploited therapeutically in glioblastoma. In addition, the response to therapeutic agents in glioblastoma is influenced by the molecular heterogeneity present in primary glioblastoma cells not only of different subtypes but also within the same subtype.

L'entrée en sénescence, considérée comme un arrêt irréversible du cycle, se caractérise par une modification de l'organisation de la chromatine formant de véritables foyers d' hétérochromatine spécifiques (SAHF) coordonnée à une modification d'expression génique et à un déclin progressif de la compétence à répliquer le génome. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai voulu comprendre en quoi ces changements d'organisation du génome pouvaient influer sur la distribution et l'activation des origines d e réplication lors de l'entrée en sénescence réplicative ou déclenchée de façon prématurée par l'inhibition d'un modulateur de chromatine, la protéine à activité Histone AcétylTransférase p300. Pour étudier ces régulations, j'ai utilisé le peignage moléculaire d'ADN réplicatif qui permet de suivre les fourches de réplication et d'évaluer la distribution moyenne des origines. De plus, à l'aide de la purification de brins naissants aux origines de réplication couplée à un séquençage haut débit, nous avons cartographié la position de ces origines sur l'ensemble du génome humain et étudier un ensemble de facteurs pouvant intervenir dans ce déterminisme. Grâce à cette étude, nous avons pu suivre finement les modifications d'activité des origines associées à l'entrée en sénescence. De plus, afin de mieux comprendre les mécanismes d'activation des origines de réplication, nous avons étudié en collaboration avec l'équipe du Dr Fisher, le rôle de Cdk1 et de Cdk2 dans l'activation des origines dans le modèle Xénope. / Senescence entry, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by modifications of chromatin organization forming specific heterochromatin foci (SAHF) coordinated to modification of gene expression and the progressive loss of capacity to replicate the genome. During my PhD, we investigated whether these changes in genome organization might induce modifications in the distribution and the activity of replication origins during replicative senescence entry and in prematurely induced senescence by inhibition of a chromatin modulator, the Histone AcetylTransferase p300. To study these regulations, we used the replicating DNA combing allowing to follow the progression of replication forks and to evaluate the mean distribution of origins. By using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing, we mapped the position of replication origins in the whole human genome and studied some factors which could be involve d with this determinism. Thanks to this study, we followed finely the modifications of activity of replication origins associated to senescence entry. Moreover, in order to better understand the mechanisms of activation of origins, we studied in collaboration with Dr Fisher's team, the role of Cdk1 and Cdk2, in the activity of replication origins in the Xenopus model.

La sénescence prématurée est induite chez des fibroblastes diploïdes humains entre deux et trois jours après un traitement avec une concentration sublétale de peroxyde d’hydrogène. Ce phénotype est notamment caractérisé par une morphologie étalée, un arrêt irréversible du cycle cellulaire et une activité ß-galactosidase associée à la sénescence. Selon des études précédentes, il semble que la néosynthèse protéique soit importante pour l’établissement de la morphologie aplatie, élargie et irrégulière des cellules en sénescence induite par H2O2. De plus, il a été montré que la neutralisation du TGF-ß1 par des anticorps spécifiques altère cette morphologie induite par le traitement de fibroblastes avec H2O2. Étant donné que les mécanismes impliqués dans l’apparition de la morphologie sénescente sont peu compris, nous avons étudié la néosynthèse de protéines cytoplasmiques dépendante ou indépendante du TGF-ß1, entre le jour deux et trois après le traitement de fibroblastes avec H2O2 et avons identifié des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette : l’ezrine, la caldesmone et HSP27. Rac1, Cdc42 et la cavéoline 1 ont été définies dans la littérature comme étant impliquées dans la morphogenèse typique lors de la sénescence réplicative et de la sénescence prématurée induite par H2O2 (dans le cas de la cavéoline 1). Nous avons étudié l’activation de Rac1 et Cdc42, la phosphorylation de la cavéoline 1 suite au traitement H2O2 et avons étudié l’effet de l’invalidation de ces protéines ainsi que celle de p38αMAPK sur la morphologie des fibroblastes. De plus, nous avons montré que Cdc42 pouvait activer p38αMAPK vice-versa, pendant le traitement avec H2O2. En parallèle de cette étude, nous avons tenté d’analyser l’abondance différentielle de protéines membranaires au jour 3 après le traitement des fibroblastes avec H2O2. Ceci nous a permis d’étudier la surexpression d’une protéine pouvant être associée aux membranes et au cytosquelette d’actine : l’annexine 2. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les fibroblastes pour entrer en sénescence prématurée, et plus particulièrement pour présenter une morphologie étalée lors de ce processus.

Autophagy (literally to ‘self-eat’) is an intracellular, catabolic mechanism to degrade and recycle cytoplasmic contents in response to metabolic, oxidative, and genotoxic stresses. Autophagy plays an important role in cellular homeostasis, and dysfunctional autophagic activity has been implicated in an array of human diseases. Importantly, autophagy has recently been identified to function in host defence against intracellular pathogens, including viruses. For this reason, many viruses have evolved strategies to subvert or exploit autophagy and block its antiviral effects. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is the etiological agent of Kaposi’s sarcoma (KS), an AIDS-related cancer of the endothelium. KSHV gene products have evolved to support viral replication and evade immune surveillance. Some of these same gene products impact KS tumourigenesis, but the precise mechanisms have yet to be elucidated. Furthermore, the impact of autophagy on KSHV replication and KS tumourigenesis remains unexplored. The KSHV viral G-protein-coupled receptor (vGPCR) is a constitutively active signalling molecule that stimulates a number of host regulatory pathways that would be expected to impact autophagy, including PI3K/Akt/mTOR and JNK. Moreover, vGPCR is expressed during lytic replication when the antiviral autophagic response may threaten virion production. Here, vGPCR activity has been definitively shown to trigger autophagy in endothelial cells using immunoblot analysis, fluorescent reporter proteins, and transmission electron microscopy. Furthermore, preliminary data suggest that this stimulatory effect is evoked through JNK activation. Taken together, these findings indicate that vGPCR likely elicits autophagic responses during KSHV lytic replication. Recently, autophagy has been recognized as a molecular barrier to tumourigenesis, influencing cell survival, cell death, or a form of cell cycle arrest called oncogene-induced senescence (OIS). Remarkably, like many host oncogenes, ectopic expression of vGPCR triggers OIS in endothelial cells. This response is dependent on vGPCR signalling activity, as an inactive form of vGPCR (R143A) fails to trigger OIS. Furthermore, vGPCR OIS is atypical in that it does not involve DNA damage responses (DDRs). Together, these autophagic and senescence responses to ectopic vGPCR expression illustrate the potency of its oncogenic potential. The significance of vGPCR-induced autophagy and senescence during KSHV replication and KS development is presently unclear. I speculate that autophagy represents a hurdle that the virus must overcome in vivo. In my working model, potent vGPCR oncogenic signalling activity sets off the alarm, eliciting autophagic responses. It seems likely that additional lytic viral gene products may serve to undermine these autophagic responses and permit viral replication and dissemination in vivo.

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L'arthrose tardive est la plus répandue des maladies ostéo-articulaires dont la prévalence augmente avec l'âge. Dans le cartilage arthrosique, des changements spécifiques des chondrocytes s'opèrent. Ils présentent une diminution de leur propriété de synthèse de la matrice extracellulaire, une diminution de leur réponse aux facteurs de croissance anabolisants et une augmentation de la sénescence cellulaire. Elle est caractérisée par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, une érosion des télomères, une activation de la voie de dommages à l'ADN (ATM/p53/p21), une activation de la voie p16INK4a/pRb, l'établissement d'un sécrétome associé à un phénotype sénescent/hypertrophique appelé SAPS. Le sujet de ma thèse porte sur l'identification de microARNs impliqués dans le vieillissement prématuré du chondrocyte. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non codant endogènes qui contrôlent un certain nombre de fonctions biologiques comme la prolifération, la différenciation ou la sénescence. Deux études ont montré le rôle préventif des miRs dans l'induction de la sénescence et dans l'hypertrophie. Au cours de ma thèse, nous avons utilisé un modèle de chondrocytes arthrosiques en 3D traités à l'IL-1β afin de récapituler le phénotype sénescent observé dans la pathologie. Cela nous a permit d'identifier deux miRs réprimés en réponse à cette cytokine : miR-24 et miR-199a-5p. Nous montrons que la répression de miR-24 conduit à une induction de p16INK4a et MMP1 associé à un phénotype hypertrophique. De plus, nos données préliminaires montrent que le miR-199a-5p est potentiellement un régulateur négatif de l'hormone anti-vieillissement Klotho qui est retrouvée dérégulée dans notre modèle cellulaire / Osteoarthritis (OA) is an age-related disease whose prevalence increases with late life. In osteoarthritic cartilage, chondrocytes presents age-specific changes such as a decrease in synthesis properties, a decrease in their response to growth and anabolic factors and an increase of cellular senescence. Senescent chondrocytes are characterized by an irreversible cell cycle arrest, DNA damage response activation (ATM/p53/p21), p16INK4a/pRb signaling pathway activation and the establishment of SAPS triggering to hypertrophy. The aim of my PhD project consisting to identify microRNAs involved in chondrocyte premature aging. microRNAs are small endogenous RNAs controlling several biological processes such as proliferation, differentiation and senescence. Two studies show that microRNAs have a preventive role in senescence and hypertrophy. During my PhD, we perform a cellular model based on OA chondrocytes placed in 3D and treated with IL-1β. We identified two miRs: miR-24 and miR-199a-5p. Repression of miR-24 leads to the induction of p16INK4a and MMP1, associated with chondrocyte hypertrophy. Moreover, preliminary datas suggests that miR-199a-5p is a potential regulator of anti-aging hormone Klotho which is deregulated in our model.

La sénescence, considérée comme étant un arrêt irréversible du cycle cellulaire, se caractérise par des changements drastiques de l'expression génique et de l'organisation de la structure de la chromatine. En effet, il se forme des foyers denses d'hétérochromatine au sein du noyau (SAHF) et ces modifications s'accompagnent d'un déclin progressif de la capacité à dupliquer le génome. Au cours de ma thèse, j'ai voulu savoir si ces modifications de la chromatine induite par les SAHF pouvaient influer sur le programme de réplication et changer la distribution des origines de réplication sur le génome au cours du processus d'entrée en sénescence réplicative des cellules. Nous avons donc, dans un premier temps, comparé par peignage moléculaire de l'ADN réplicatif la distribution des origines de réplication de cellules primaires prolifératives et sénescentes. Nous avons également cartographié l'ensemble de leurs origines de réplication sur la totalité du génome en purifiant les brins naissants aux origines de réplication que nous avons couplé à une analyse de séquençage à haut débit.Les protéines HMGA1 et HMGA2 étant des éléments précurseurs essentiels à la mise en place des SAHF, nous avons créé des lignées cellulaires qui, en sur-exprimant de façon inductibles ces protéines, induit une sénescence prématurée. Nous avons réalisé le même type d'analyses sur ces cellules afin de mettre en évidence le rôle de ces protéines dans les modifications du programme de réplication que nous avons observé au cours de l'entrée en sénescence de ces différents types cellulaires. / Senescence, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by dramatic changes in genes expression and chromatin organisation forming dense heterochromatic foci (SAHF). These changes are concomitant to a progressive decline of the capactity to replicate the genome. My PhD topic was to investigate whether the chromatin changes induced by SAHF formation could influence the replication program and modify the origin distribution along the genome at replicative senescence. We first compared the origin distribution of proliferative and pre-senescent primary fibroblasts by DNA molecular combing. Then, we mapped the origins positions in whole human genome by using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing.As HMGA1 and HMGA2 proteins are essential to induce SAHF formation, we designed inducible cell lines wich overexpress these proteins, triggering premature senescence. We made the same type of experiments in these cell lines in order to investigate the implication of these proteins on the changes of the replication program we observed during senescence.