Mit der vorliegenden Arbeit sollte nachgewiesen werden, dass bei in vitro kultivierten kaninen dermalen Fibroblasten einer Hunderasse nach einer bestimmte Kultivierungszeit replikative Seneszenz entsteht und dass das replikative Vermögen dieser Zellen in der Zellkultur abhängig vom Alter des Spendertieres ist. Dreißig Beagle aus zwei Versuchstieranstalten wurden als Hautspender genutzt. Diese Tiere wurden in die drei Altersgruppen jung, adult und alt unterteilt. Mit Hilfe einer Hautstanze wurde bei allen Tieren im Bereich der rechten Skapula ein Hautstück gewonnen. Diese Hautstücken wurden in Zellkulturflaschen verbracht. Die aus diesem Explantat auswandernden Zellen stellten die Grundlage für die Primärkultur dar. Die Zellen wurden in regelmäßigen Abständen subkultiviert. Dabei wurden immer die Gesamtzellzahl und die Vitalität der Kulturen bestimmt. Diese Werte bildeten die Grundlage für die Berechnung der Parameter des replikativen Vermögens der Zellen. Auf Grundlage der erstellten Wachstumskurven konnte die Generationszeit der Zellen berechnet werden. Parallel zur Kultivierung der Zellen erfolgte die morphologische Betrachtung der Zellen mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops und histologischen Färbungen, die unter dem Lichtmikroskop näher beurteilt wurden. / This thesis aims to demonstrate that, after a certain period of time, replicative senescence develops in canine dermal fibroblasts of a certain dog breed when cultured in vitro. It is also shown that the replicative capacity of these cells is related to the age of the donor animal. Thirty Beagles from two experimental facilities were used as skin donors. The animals were divided in three age groups: young, adult and old. Skin samples from the right scapula were taken from all animals by means of a punch biopsy and transferred to cell culture vessels. The primary culture was based on the cells emigrating from these explants. The cells were subcultured at regular intervals, at which the total number of cells and the vitality of the cultures were also determined. Based on these parameters, the replicative capacity of the cells was calculated and growth curves were created, which were then used to calculate the generation times of the cells. Parallel to cultivation, the cells underwent morphological dissection using a phase contrast microscope on the one hand and a light-optical microscope with histological staining on the other hand.

Die Funktionalität von T-Zellen wird von ihrem Differenzierungsgrad beeinflusst, sodass das Ausmaß der Differenzierung von T-Zellen und deren Verteilung auf verschiedene Differenzierungsstadien als Parameter für die T-Zell-Funktionalität gesehen werden kann. Hochdifferenzierte, seneszente T-Zellen werden beispielsweise als eine mögliche Ursache häufig auftretender Tumorerkrankungen im Alter vermutet. Weiterhin wurden in der Literatur Auswirkungen durch das Geschlecht und den Raucherstatus auf das adaptive Immunsystem beschrieben. Eine chronische Tabakrauchexposition könnte in Folge einer chronischen Inflammation und damit andauernden Aktivierung des adaptiven Immunsystems zu einem höheren Differenzierungsgrad von T-Zellen im Sinne eines vorzeitigen Alterungsprozesses führen. Tumorerkrankungen als Folge einer gescheiterten T-Zell-Antwort mit verminderter T- Zell-Funktionalität könnte unter anderem ein höherer Differenzierungsgrad von T-Zellen zugrunde liegen. Auch die T-Zell-Erschöpfung, also die gesteigerte Expression negativer Immuncheckpoints auf T-Zellen, stellt neben der Seneszenz einen für die Tumorgenese relevanten Mechanismus dar. Durch die therapeutische Gabe von Immuncheckpointinhibitoren kann dieser verringert oder unterbunden werden und im Rahmen dieser, die Funktionalität von T-Zellen positiv beeinflussenden, Therapieoption könnte sich auch der Differenzierungsgrad von T-Zellen verändern. Mit der fortschreitenden Differenzierung von T-Zellen gehen Veränderungen von Oberflächenmolekülen einher, sodass durch deren Analyse Rückschlüsse auf den Differenzierungsgrad von T-Zellen und damit deren Funktionalität gezogen werden können. In der Literatur wurden diesbezüglich Oberflächenmoleküle wie CD45RA und CD197 auf T-Zellen beschrieben, anhand derer eine Einteilung in verschiedene Differenzierungsstadien erfolgen kann. Darüber hinaus wurde insbesondere die verminderte Expression von CD28 und CD27 sowie die Reexpression von CD45RA mit fortgeschrittener T-Zell-Differenzierung assoziiert, wobei letztere mit einer veränderten T-Zell-Funktion im Sinne einer verminderten Proliferationskapazität sowie gesteigerten Zytotoxizität einhergeht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Parameter Alter, Geschlecht und Raucherstatus sowie den Einfluss eines vorliegenden Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) und der Therapie mit gegen Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) und Programmed Death Ligand (PD-L1) gerichteten Immuncheckpointinhibitoren auf den Differenzierungsstatus von T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurde zunächst eine durchflusszytometrische Methode zur quantitativen Analyse von T-Lymphozyten etabliert. Sie wurden einerseits anhand ihres Differenzierungsstadiums analysiert, wobei dieses durch die Expression von CD45RA und CD197 definiert wurde und eine Einteilung in naive Zellen (CD45RA+CD197+), Zentrale T-Gedächtniszellen (ZM-Zellen, CD45RA-CD197+), Effektor-T-Gedächtnis-Zellen (EM-Zellen, CD45RA-CD197-) und CD45RA re- exprimierende Effektor-T-Gedächtniszellen (TEMRA-Zellen, CD45RA+CD197-) erfolgte. Weiterhin wurden die T-Lymphozyten anhand der Ausprägungen der Expression von CD27 und CD28 in CD27+CD28+, CD27-CD28-, CD27+CD28- und CD27-CD28+ unterteilt. Drittens wurde darüber hinaus die Verteilung der anhand von CD27 und CD28 definierten Subpopulationen innerhalb der vier anhand von Cd45RA und CD197 definierten Differenzierungsstadien untersucht. Für die Untersuchung der T-Zellen gesunder Personen wurden venöse Blutproben von 35 gesunden Personen verwendet. Dabei wurden sowohl bezüglich der Verteilung auf naive, ZM-, EM- und TEMRA-Zellen als auch bezüglich der Expression von CD27 und CD28 durch T-Zellen allgemein sowie innerhalb der Differenzierungsstadien Hinweise auf eine weiter fortgeschrittene Differenzierung bei CD8+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ T-Zellen beobachtet. Um den Einfluss von Alter, Geschlecht und Raucherstatus auf die Differenzierung von T-Zellen zu untersuchen, wurden die gesunden Probandinnen und Probanden jeweils in zwei Gruppen unterteilt und diese miteinander verglichen: jünger (n = 19) vs. älter (n = 16), männlich (n = 19) vs. weiblich (n = 16) und rauchend (n = 12) vs. nicht rauchend (n = 13). Dabei lag das mediane Alter der jüngeren Personen bei 23 Jahren und das der älteren Probandinnen und Probanden bei 68 Jahren. Bei der Untersuchung altersabhängiger Unterschiede in der Verteilung von T-Zellen auf die anhand von CD45RA, CD197, CD27 und CD28 definierten Populationen wurde eine mit dem Alter fortschreitende Differenzierung und Seneszenz von T-Zellen beobachtet. Diese äußerte sich einerseits in einem signifikanten Abfall naiver CD8+ T-Zellen und signifikanten Anstieg von CD8+ TEMRA-Zellen. Andererseits wurde eine verminderte Expression von CD27 und CD28 auf CD8+ T-Zellen beobachtet und jüngere Personen wiesen sowohl signifikant mehr CD27+CD28+ T-Zellen als auch signifikant weniger CD27-CD28- T-Zellen auf. Innerhalb CD4+ T-Zellen wurden dieselben Unterschiede beobachtet, erreichten jedoch mit Ausnahme zweier signifikanter negativer Korrelationen zwischen der Zahl zirkulierender CD4+ naiver sowie CD27+CD28+ Zellen und dem Alter keine statistische Signifikanz. Auch innerhalb der CD8+ naiven T-Zellen sank die Expression von CD27 und CD28 altersabhängig und die Zellzahl CD27+CD28+ und CD27+CD28- naiver Zellen war bei den jüngeren Personen signifikant höher als in der Gruppe älterer. Weiterhin wiesen diese beiden Subpopulationen innerhalb CD4+ und CD8+ naiver T-Zellen sowie CD4+ TEMRA-Zellen eine signifikante negative Korrelation mit dem Alter auf. Bei der Untersuchung der Differenzierungsmuster von T-Lymphozyten auf geschlechtsabhängige Unterschiede konnte hingegen kein Einfluss durch das Geschlecht beobachtet werden. Weiterhin wurde ein Einfluss des Raucherstatus untersucht. Dabei wurden Unterschiede zwischen rauchenden und nicht rauchenden Personen beobachtet sowie nicht-signifikante Trends im Rahmen der Gruppenvergleiche, welche einen Hinweis auf eine fortgeschrittene Differenzierung von T- Zellen im Blut von rauchenden Personen darstellen könnten. Darüber hinaus wurde eine signifikante negative Korrelation zwischen der Zellzahl CD8+ naiver Zellen mit der kumulativen inhalierten Rauchdosis beobachtet. Diese auch altersabhängig beobachtete Veränderung deutet auf eine höhere Differenzierung von T-Zellen bei Raucherinnen und Rauchern hin. Neben gesunden Probandinnen und Probanden wurden auch elf NSCLC-Patientinnen und - Patienten in die Untersuchungen eingeschlossen. Auch die CD4+ T-Zellen von NSCLC- Patientinnen und Patienten wiesen wie die CD4+ T-Zellen der gesunden Probandinnen und Probanden einen weniger seneszenten Phänotyp auf als CD8+ T-Zellen. Weiterhin wurde ein Vergleich des untersuchten T-Zell-Phänotyps zwischen gesunden und erkrankten Personen durchgeführt, wobei als Unterschied eine bei den erkrankten Personen gegenüber älteren gesunden Personen signifikant geringere Lymphozytenzahl sowie nicht-signifikant verminderte Zahl zirkulierender T-Zellen auffiel. Insgesamt konnten darüber hinaus bei dem Vergleich des Differenzierungsgrades von T-Zellen kleine Unterschiede festgestellt werden, wie eine signifikant kleinere Zahl CD8+ CD27-CD28+ TEMRA-Zellen bei den Patientinnen und Patienten im Vergleich zu der gesunden Vergleichsgruppe mit älteren Personen. Limitierend ist dabei die im Vergleich zu durchgeführten Untersuchungen in der Literatur geringe Stichprobengröße, die die Beurteilung von zentralen Tendenzen erschwert. Im letzten Schritt wurden die T-Zell-Populationen im Verlauf der antitumorösen Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren untersucht, wobei signifikante negative Korrelationen zwischen der Zellzahl CD4+ CD27+CD28+ ZM-Zellen sowie CD4+ CD27-CD28+ EM-Zellen und dem Therapietag ermittelt wurden. Diese könnte einerseits durch allgemein abnehmende Zellzahlen im Rahmen der Therapie erklärt werden sowie andererseits im Zusammenhang mit einer gesteigerten T-Zell-Aktivierung im Rahmen einer Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren stehen. Zusammenfassend konnte somit im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Assay zur Untersuchung des Differenzierungsmusters von T-Zellen anhand der Oberflächenmoleküle CD45RA, CD197, CD27 und CD28 erarbeitet und etabliert werden. Es wurden starke Hinweise auf einen Einfluss des Alterns im Sinne einer altersabhängig zunehmenden Differenzierung von T-Zellen beobachtet sowie diskretere Hinweise auf einen Einfluss durch chronische Tabakrauchexposition, das Vorliegen eines NSCLC und die Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren. Ein geschlechtsspezifischer Einfluss wurde hingegen nicht beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen damit einerseits den aktuellen Kenntnisstand insbesondere in Bezug auf den Einfluss des Alterns auf T-Zellen. Die bezüglich der anderen untersuchten Parameter gewonnen Erkenntnisse wurden hingegen in der Literatur noch nicht beschrieben. Als limitierend ist die begrenzte Stichprobengröße einzuordnen. Perspektivisch können die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit durch eine Untersuchung mit mehr eingeschlossenen Personen validiert werden. Darüber hinaus können Untersuchungen der T-Zellen von Personen mit anderen Tumorerkrankungen mithilfe des in der vorliegenden Arbeit erarbeiteten Assays durchgeführt werden. Auch funktionelle Untersuchungen beispielsweise der Zytotoxizität und Proliferationskapazität von T-Zellen in Abhängigkeit des untersuchten Expressionsmusters würden eine neue Perspektive eröffnen.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Grundlagen des menschlichen Immunsystems 1.2 Grundlagen der Funktionsweise der Aktivierung und Differenzierung von T-Zellen 1.3 Immunphänotypische Quantifizierung der T-Zell-Differenzierung 1.4 Alter, Raucherstatus und Geschlecht als Einflussfaktoren auf die T-Zell-Differenzierung 1.5 T-Zellen in der Prävention von Tumoren und Immuncheckpointinhibitoren als T-Zell-basierte Tumortherapie 2 Aufgabenstellung 3 Probandinnen und Probanden, Material und Methoden 3.1 Charakterisierung der untersuchten Personen bezüglich Alter, Geschlecht und Raucherstatus 3.2 Material und Methoden 3.2.1 Blutentnahme und durchflusszytometrische Immunphänotypisierung 3.2.2 Graphische Auswertung der durchflusszytometrisch gewonnenen Daten 3.2.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Unter CD8+ T-Zellen ist die Seneszenz stärker ausgeprägt als unter CD4+ T-Zellen 4.1.1 Seneszente Differenzierungsstadien sind innerhalb CD8+ T-Zellen größer als innerhalb CD4+ T-Zellen 4.1.2 Der Verlust von CD27 und CD28 ist unter CD8+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ T-Zellen stärker ausgeprägt 4.1.3 Der Verlust von CD27 und CD28 durch EM- und TEMRA-Zellen ist bei CD8+ T-Zellen ausgeprägter als bei CD4+ T-Zellen 4.2 Die T-Zell-Seneszenz steigt altersabhängig und die Veränderungen sind unter CD8+ T-Zellen ausgeprägter als unter CD4+ T-Zellen 4.3 Das Geschlecht beeinflusst die T-Zell-Seneszenz nicht und T-Zellen von rauchenden Personen weisen verstärkte Zeichen der Seneszenz auf 4.4 Die Zahl zirkulierender Lymphozyten ist bei NSCLC-Erkrankten vermindert und T-Zellen NSCLC-Erkrankter weisen diskrete Zeichen verstärkter Seneszenz auf 4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Diskussion der Methoden 5.1.1 Die Durchflusszytometrie stellt eine gut etablierte und geeignete Untersuchungsmethode dar 5.1.2 Die Verwendung von Vollblut ermöglicht eine exakte Untersuchung von T-Zell-Populationen in vivo 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Unter CD8+ T-Zellen ist die Seneszenz stärker ausgeprägt als unter CD4+ T-Zellen 5.2.2 Die T-Zell-Seneszenz steigt altersabhängig und die Veränderungen sind unter CD8+ T-Zellen ausgeprägter als unter CD4+ T-Zellen 5.2.3 Das Geschlecht beeinflusst die T-Zell-Seneszenz nicht und T-Zellen von rauchenden Personen weisen verstärkte Zeichen der Seneszenz auf 5.2.4 Die Zahl zirkulierender Lymphozyten ist bei NSCLC-Erkrankten vermindert und T-Zellen NSCLC-Erkrankter weisen diskrete Zeichen verstärkter Seneszenz auf 6 Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Verzeichnis der wissenschaftlichen Präsentationen Danksagung

Die schlechte Prognose der meisten disseminierten Tumorerkrankungen ist häufig in einer vorbestehenden oder erworbenen Resistenz gegenüber Zytostatika begründet. Da die meisten Zytostatika mit zellulären Strukturen interagieren, war lange angenommen worden, dass der antineoplastische Effekt unmittelbar durch massive Zellschädigung bewirkt wird. Hieraus folgte, dass Chemoresistenz auf Mechanismen beruhen müsse, welche das Zytostatikum an der Wechselwirkung mit seiner intrazellulären Zielstruktur hindern. Arbeiten der letzten Jahre haben jedoch gezeigt, dass die meisten Zytostatika indirekt über DNA-Schädigung ein relativ uniformes, genetisch kodiertes Zelltod-Programm auslösen, demzufolge postuliert wurde, dass auch Apoptosedefekte für "Multi-Drug-Resistenz" verantwortlich sein könnten. Allerdings ist der tatsächlich Beitrag zytostatika-induzierter Apoptose am Therapieerfolg nicht geklärt, wobei der Wahl geeigneter Testsysteme eine wesentliche Bedeutung für diese Kontroverse zuzukommen scheint. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist daher die Etablierung eines transgenen Lymphom-Modells, in welchem chemotherapeutische Effekte an spontan entstandenen Tumoren mit definierten genetischen Läsionen in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden können. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Mutationen in apoptose-relevanten Genloci wie p53, INK4a/ARF oder bcl2 sowohl die Manifestation myc-transgener Lymphome dramatisch beschleunigen, als auch den Therapieerfolg kompromittieren. Neben Apoptose wurde darüberhinaus prämature Seneszenz, ein terminaler Zellzyklus-Arrest, als prognose-relevantes Chemotherapie-Effektorprogramm identifiziert. Damit dokumentiert die vorliegende Arbeit einen wichtigen Zusammenhang von Gendefekten, die während der Tumorigenese erworben wurden, und später evidenter Chemoresistenz, wobei manche Mutationen bereits vor Zytostatika-Exposition Resistenz begründen können. Die Identifikation und pharmakogenomische Charakterisierung potentiell resistenz-vermittelnder Gene und Mutationen in relevanten Testsystemen wird für die Entwicklung spezifischerer, aber weniger toxischer "targeted Therapeutics" von großer Bedeutung sein. / Intrinsic or acquired chemoresistance is the major cause for the adverse outcome of disseminated malignancies. The fact that most anticancer agents bind to subcellular targets prompted the assumption that drug-induced cytotoxicity must be a direct consequence of severe cellular damage. Hence, chemoresistance was thought to arise from mechanisms that prevent or disrupt the drug-target interaction. By contrast, more recent data suggested that DNA damage caused by most, if not all, anticancer agents may trigger a relatively uniform, genetically encoded cell death program. In turn, defects in the apoptotic machinery should account for multi-drug resistance as well. However, due to technical limitations of current test systems, it has been difficult to assess the overall contribution of apoptotic cell death to treatment outcome. In the studies presented here, a transgenic mouse lymphoma model was established in order to exploit drug responses of spontaneously developed malignancies growing at their natural sites but harboring defined genetic defects. Using this model, alterations in apoptosis-related gene loci such as p53, INK4a/ARF or bcl2 result in both dramatic acceleration of myc-driven lymphomagenesis and compromised treatment responses. Importantly, not only apoptosis, but premature senescence, a terminal cell-cycle arrest, was found to impact on treatment outcome. In essence, this work describes and important connection between cancer genes and cancer therapy, i.e. genetic defects acquired during tumorigenesis may already co-select for chemoresistance prior to any drug encounter. The identification and pharmacogenomic evaluation of resistance conferring candidate genes and mutations using adequate test systems is likely to play a key role in the development of novel, more specific but less toxic so called "targeted Therapeutics".

Mit der vorliegenden Arbeit sollte nachgewiesen werden, dass bei in vitro kultivierten kaninen dermalen Fibroblasten einer Hunderasse nach einer bestimmte Kultivierungszeit replikative Seneszenz entsteht und dass das replikative Vermögen dieser Zellen in der Zellkultur abhängig vom Alter des Spendertieres ist. Dreißig Beagle aus zwei Versuchstieranstalten wurden als Hautspender genutzt. Diese Tiere wurden in die drei Altersgruppen jung, adult und alt unterteilt. Mit Hilfe einer Hautstanze wurde bei allen Tieren im Bereich der rechten Skapula ein Hautstück gewonnen. Diese Hautstücken wurden in Zellkulturflaschen verbracht. Die aus diesem Explantat auswandernden Zellen stellten die Grundlage für die Primärkultur dar. Die Zellen wurden in regelmäßigen Abständen subkultiviert. Dabei wurden immer die Gesamtzellzahl und die Vitalität der Kulturen bestimmt. Diese Werte bildeten die Grundlage für die Berechnung der Parameter des replikativen Vermögens der Zellen. Auf Grundlage der erstellten Wachstumskurven konnte die Generationszeit der Zellen berechnet werden. Parallel zur Kultivierung der Zellen erfolgte die morphologische Betrachtung der Zellen mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops und histologischen Färbungen, die unter dem Lichtmikroskop näher beurteilt wurden. / This thesis aims to demonstrate that, after a certain period of time, replicative senescence develops in canine dermal fibroblasts of a certain dog breed when cultured in vitro. It is also shown that the replicative capacity of these cells is related to the age of the donor animal. Thirty Beagles from two experimental facilities were used as skin donors. The animals were divided in three age groups: young, adult and old. Skin samples from the right scapula were taken from all animals by means of a punch biopsy and transferred to cell culture vessels. The primary culture was based on the cells emigrating from these explants. The cells were subcultured at regular intervals, at which the total number of cells and the vitality of the cultures were also determined. Based on these parameters, the replicative capacity of the cells was calculated and growth curves were created, which were then used to calculate the generation times of the cells. Parallel to cultivation, the cells underwent morphological dissection using a phase contrast microscope on the one hand and a light-optical microscope with histological staining on the other hand.

Zelluläre Seneszenz wird als terminaler Zellzyklusarrest definiert, der mit dem Altern und funktionellen Verlust von Geweben verknüpft ist. Eine Seneszenzreaktion wird ebenso durch Onkogene und zytotoxischen Stress verursacht. Die Ausführung des Seneszenzprogramms wird durch eine zeitlich hochdynamische Aktivität von Transkriptionsfaktoren (TF) bedingt. Interessanterweise kann die Zelllinienzugehörigkeit einer Zelle durch die Expression von linien-aberranten TF überschrieben werden. Die vorliegende Arbeit untersucht Chemotherapie-induzierte Seneszenz (TIS) in Bcl-2 überexprimierenden, deshalb vor Apoptose geschützten, murinen Eµ-Myc B-Zell Lymphomen in An- oder Abwesenheit der Seneszenz-essentiellen Histonmethyltransferase Suv39h1. Analysen auf Transkriptom- und auf Proteinebene ergeben dabei, dass in einer Seneszenz-spezifischen Weise die TF AP-1, PU.1 und C/EBPβ induziert werden, welche normalerweise für die Funktion und Entwicklung myeloischer Zelllinien bedeutend sind. Dementsprechend korreliert der Seneszenzzustand mit Transkripten, Oberflächenmarkern und einer enzymatischen Funktion der myeloischen Linie. Indem die identifizierten TFs heruntergeschaltet oder überexprimiert werden, wird ihre direkte Beteiligung an der Linienuntreue der TIS Lymphome demonstriert. TIS-Kapazität wird als für den Erfolg von Krebstherapie günstige Eigenschaft betrachtet, da sie zu einem Wachstumsblock führt. Nichtsdestotrotz können sich verweilende TIS Zellen krebsbiologisch auch nachteilig auswirken. Anhand von murinen und humanen, klinisch annotieren Transkriptomdatensätzen kann hier in beiden Spezies ein myeloisch verschobenes, Linienuntreue anzeigendes Genexpressionsprofil mit einer besseren Überlebensprognose korreliert werden. Die vorliegenden Befunde legen nahe, dass die Modulation von TF Aktivitäten in Seneszenz einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, um den für den Therapieerfolg nützlichen Zweig des TIS Phänotyps zu befördern. / Cellular senescence is regarded as an irreversible cell cycle arrest associated with tissue aging and its functional decline. A senescence response is also evoked by oncogenic and cytotoxic stress. The execution of the senescence program relies on a highly dynamic sequence of transcription factor (TF) activities. Interestingly, cell lineage commitment can be overridden by the expression of lineage-aberrant TFs. This thesis examines chemotherapy-induced senescence (TIS) in Bcl-2 overexpressing, thus apoptosis-protected, murine Eμ-Myc B-cell lymphomas with or without the senescence-essential histone methyltransferase Suv39h1. Transcriptome as well as protein level analyses reveal senescence-specific induction of the TFs AP-1, PU.1 and C/EBPβ which are typically crucial for myeloid lineage commitment and function. Correspondingly, the senescent state associates with myeloid lineage transcripts, surface markers and enzymatic function, reminiscent of, but not equal to a transdifferentiation phenotype. By knocking down and overexpressing the identified TFs, we demonstrate their direct involvement in the lineage infidelity of TIS lymphomas. TIS-capacity is viewed as beneficial to cancer therapy outcome due to its block on proliferation. However, lingering TIS cells can also be detrimental due to the acquisition of latent stemness properties or tumor-protective remodeling of their microenvironment. By interrogating murine and human, clinical course-annotated transcriptome data sets, an association between a myeloid-skewed, lineage infidelity indicating gene expression profile and better tumor prognosis is established in both species. The presented findings suggest that modulation of the senescent TF activities could be therapeutically exploited to foster the cancer patient-beneficial branch of the TIS phenotype.

Eine seneszente Zelle erfährt proteotoxischen Stress durch einen Prozess, der als “Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP)” bezeichnet wird. SASP Faktoren involvieren vermehrte Produktion von Cytokinen und Chemokinen, die die Proteinhomöostase stören. Das führt zu Stress im Endoplasmatischen Retikulum (ER), Unfolded Protein Response (UPR) sowie erhöhter Autophagie in seneszenten Zellen. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Therapie-induzierte Seneszenz (TIS), ausgelöst durch Adriamycin (ADR) oder Cyclophosphamid (CTX), zu einer erhöhten Expression von Alzheimer-assoziierten Genen führt. Das ist allerdings nur der Fall, wenn TIS mit SASP und Proteotoxizität korreliert. Außerdem zeigen wir, dass transgene Mäuse mit Alzheimer ebenso Eigenschaften von Seneszenz aufweisen. Mutationen in Genen wie Amyloid-Precursor-Protein (APP) und Presenilin 1 (PSEN1) erzeugen nicht nur Alzheimer, sondern verstärken auch Seneszenz. In APPPS1+/- transgenen Mäusen treten seneszente Zellen zusammen mit Amyloid β (Aβ) Plaques auf. Gleichfalls führt die Überexpression von APP in der Neuroblastom Zelllinie SH-SY5Y zu einer Erhöhung von Seneszenz-Markern, einschließlich ER Stress und Autophagie-assoziierten Lysosomen. Diese Beobachtungen implizieren einen Zusammenhang zwischen Seneszenz und Alzheimer. Wir präsentieren Proteotoxizität als gemeinsamen Nenner dieser beiden Pathologien. Allerdings kommen wir zu dem Ergebnis, dass APP und PSEN1 keine Regulatoren von TIS sind. APP trägt zur TIS-assoziierten Proteotoxizität bei, da ein knock-down von APP zu einer Reduzierung des ER Stress führt. Außerdem, können seneszente Zellen mittels Blockierung der APP Spaltung und somit Bildung von Aβ Plaques durch den Gamma-Sekretase Inhibitor Semagacestat, selektiv getötet werden. Das deutet auf ein senolytisches Potential hin. Allerdings hat Semagacestat keinen Einfluss auf die Expression von ER Stress Marker. Dies suggeriert, dass APP in Eμ-myc Lymphomen Aβ-unabhängig zu ER Stress beiträgt, während diese in Alzheimer eine zentrale Rolle in der Phathophysiologie spielen. / A senescent cell experiences proteotoxic stress in consequence to senescence-associated secretory phenotype (SASP). SASP factors involve increased production of cytokines and chemokines, which overload and disrupt protein homeostasis. This induces endoplasmic reticulum (ER) stress, unfolded protein response (UPR) as well as elevated autophagic-lysosomal burden in senescent cells, further promoting the formation of misfolded proteins. In this thesis we found, in Eμ-myc transgenic mice lymphomas, therapy-induced senescence (TIS) by Adriamycin or Cyclophosphamide treatment leads to an up regulation of genes involved in Alzheimer’s disease (AD). However, this is true only when TIS correlates with SASP, leading to proteotoxicity. On the other hand, we demonstrate that transgenic AD inflicted mice also present with features of senescence. Mutations of genes such as amyloid precursor protein (APP) and presenilin1 (PSEN1), not only engender AD, but also augment senescence. In APPPS1+/- transgenic mice, the senescent cells co-occur with amyloid β (Aβ) plaques. Likewise, in neuroblastoma cell line SH-SY5Y, APP overexpression results in upregulation of senescence markers, including markers for ER stress and autophagic-lysosomal burden. These observations imply that there is a crosstalk between senescence and AD. We demonstrate proteotoxicity as a common denominator between the two pathologies. However, we found that APP and PSEN1 are not regulators of TIS. APP contributes to proteotoxic stress associated with TIS as knocking down of APP leads to a reduction of ER stress. Inhibiting Aβ formation by targeting the processing of APP using Semagacestat- a gamma-secretase inhibitor, selectively targets senescent cells resulting in cell death. This indicates its senolytic potential. However, Semagacestat has no impact on the expression of ER stress markers. This suggested that in Eμ-myc lymphomas, APP contributes to ER stress in an Aβ-independent fashion, unlike in AD, where Aβ is considered central to its pathophysiology.

Zelluläre Seneszenz beschreibt einen terminalen Zellzyklus-Arrest. Nach zellulärem Stress u. a. durch aktivierte Onkogene oder DNA-schädigende Chemotherapie wird Seneszenz induziert und kann so zur Tumorsuppression bzw. zum Behandlungserfolg beitragen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-kappaB – welcher bisher vor allem durch seine onkogenen Funktionen mit Krebs in Verbindung gebracht wurde - bei der Seneszenz-assoziierten Zytokinausschüttung mitwirkt und den seneszenzten Phänotyp möglicherweise sogar verstärkt, wodurch NF-kappaB potentiell eine tumorsuppressive Rolle zukäme. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des NF-kappaB-Signalweges in Seneszenz und Therapie. In der vorliegenden Arbeit zeige ich die deutliche Aktivierung von NF-kappaB nach Therapie-induzierter Seneszenz (therapy-induced senescence, TIS) und erhöhte Expression NF-kappaB-regulierter Zytokine. TIS ist vor allem in vivo mit starker Aktivität des NF-kappaB-Signalweges assoziiert und von selbiger abhängig. Primäre Eµ-myc-transgene Mauslymphome wurden nach ihrer endogenen NF-kappaB-Aktivität klassifiziert bzw. mit inhibierenden und aktivierenden NF-kappaB-Konstrukten modifiziert, welche auch in diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) als natürlich vorkommende Mutationen gefunden wurden. Über einen neuartigen „Cross-Species“-Vergleich wurden Bcl2-hochexprimierende Keimzentrums-B-Zell-DLBCL (germinal center B-cell type, GCB) als klinisch relevante Gruppe identifiziert, welche nach NF-kappaB-Hyperaktivierung signifikant besser auf Therapie ansprach. Diese Ergebnisse zeigen eine kontextspezifische, d. h. von „onkogenen Netzwerken“ abhängige Rolle des NF-kappaB Signalweges unter Chemotherapie. Diese Information könnte für künftige klinische Studien bedeutsam sein, da sie Bedingungen aufzeigt, unter denen NF-kappaB als Vermittler einer erwünschten Therapie-induzierten Seneszenzantwort eher nicht inhibiert werden sollte. / Cellular senescence is a terminal cell-cycle arrest program that is executed in response to cellular stresses, such as activated oncogenes or DNA-damaging anti-cancer chemotherapy, where it serves as a tumor-suppressive mechanism or contributes to treatment outcome, respectively. Recently, transcription factor NF-kappaB which has long been linked to cancer development primarily through its oncogenic functions, has been postulated to participate in a senescence-associated and possibly senescence-reinforcing cytokine response, thereby suggesting a tumor-restraining role for NF-kappaB. The aim of my PhD project was to understand the role of the NF-kappaB pathway in senescence and cancer treatment outcome. In this thesis, I show markedly elevated NF-kappaB activity upon therapy-induced senescence (TIS), associated with strong upregulation of NF-kappaB-controlled cytokines. TIS is associated with and depends on hyper-activated NF-kappaB signaling. By characterization and genetic engineering of primary mouse lymphomas according to distinct NF-kappaB-related oncogenic networks reminiscent of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) subtypes, Bcl2-overexpressing germinal center B-cell-like (GCB) DLBCL were identified as a clinically relevant subgroup with significantly superior outcome when NF-kappaB is hyperactive. These results demonstrate the context-dependent role of NF-kappaB signaling in cancer therapy and unveil oncogenic scenarios in which NF-kappaB hyperactivity unexpectedly accounts for superior long-term outcome to therapy. This finding has significant ramifications for future clinical trials that aim at inhibiting NF-kappaB activity based on the assumption of its detrimental impact on treatment outcome.

In Krebszellen induzieren Onkogene und Chemotherapie zelluläre Seneszenz. Dabei handelt es sich um einen terminalen Wachstumsarrest, bei dem durch Trimethylierung der Aminosäure Lysin an Position 9 (K9) des Histons H3 (H3K9me3) die Aktivierung S-Phase-relevanter Gene epigenetisch blockiert ist. Obwohl Therapie-induzierte Seneszenz (TIS) das Gesamtüberleben von Mäusen mit einer Lymphomerkrankung verbessert, stellt eine Elimination seneszenter Zellen aufgrund weiterhin bestehender und neu erworbener tumorigener Eigenschaften ein wichtiges therapeutisches Ziel dar. Die Arbeit zeigt anhand des transgenen Eμ-myc Mausmodells, in dem TIS in Abhängigkeit von der H3K9-Histonmethyltransferase Suv39h1 durch Chemotherapie induziert wird, dass TIS-Zellen in vitro und in vivo einer metabolischen Reprogrammierung unterliegen, die therapeutisch genutzt werden kann. TIS-kompetente Lymphome erhöhen im Gegensatz zu TIS-kompromittierten, Suv39h1- defizienten Lymphomen den Glukoseumsatz und die Produktion von ATP. Diese Umstellung des Stoffwechsels erfolgt als Antwort auf eine erhöhte Proteotoxizität, die durch Bestandteile des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) hervorgerufen wird. SASP-Faktoren lösen in TIS-Zellen erhöhten Stress im endoplasmischen Retikulum (ER) aus und forcieren die Fehlfaltung von Proteinen, die nach vermehrter Ubiquitinierung durch Autophagie unter Energieverbrauch abgebaut werden. Deshalb sind stark SASP-exprimierende TIS-Lymphome im Vergleich zu genetisch durch die Inhibition des Transkriptionsfaktors NfκB veränderten und dadurch SASP-supprimierten TIS-Lymphomen empfindlich gegenüber der Inhibition des Glukosestoffwechsels oder der Blockade von Autophagie. Beides führt zur Elimination von TIS Zellen durch Caspase-12- und Caspase-3-abhängige, ER-initiierte Apoptose. Folglich erwirkt die pharmokologische Inhibition dieser veränderten Stoffwechselbedürfnisse nach TIS Induktion eine Tumorregression und ein verbessertes Gesamtüberleben in vivo. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine katabole Stoffwechsellage seneszenter Zellen, die therapeutisch durch konzeptionell neue „synthetisch-letale“, metabolische Therapien eliminiert werden können. Damit wird erstmals in der Krebstherapie ein Tumor-selektives Seneszenzprogramm zusammen mit der Blockade von Stoffwechselwegen genutzt. / Cellular senescence is a terminal growth arrest of viable cells characterized by S-phase entry-blocking histone 3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3) in response to oncogene activation and anticancer chemotherapy. Although therapy-induced senescence (TIS) improves long-term outcome, senescent tumor cells acquire potentially harmful characteristics. Therefore, their quantitative elimination presents a therapeutic opportunity. In this thesis the Eμ-myc transgenic mouse lymphoma model, in which TIS depends on the H3K9 histone methyltransferase Suv39h1, is used to show mechanism and therapeutic exploitation of senescence-related metabolic reprogramming in vitro and in vivo. After senescence-inducing chemotherapy, TIS- competent lymphomas but not TIS-incompetent Suv39h1- lymphomas displayed increased glucose turnover and higher ATP production. The thesis demonstrates that this was due to massive proteotoxic stress, which is a consequence of the enhanced production of secretory proteins - referred to as the senescence-associated secretory phenotype (SASP) - of senescent cells. Consequently, SASP-producing TIS cells exhibited endoplasmic reticulum stress, an unfolded protein response (UPR), and increased ubiquitination, thereby targeting toxic proteins for autophagy in an acutely energy-consuming fashion. Accordingly, TIS lymphomas, unlike senescence models that lack a strong SASP response, for example due to the inhibition of the transcription factor NfκB, were more sensitive to blocking glycolysis or autophagy, which lead to their selective elimination through caspase-12- and caspase-3-mediated endoplasmic reticulum-related apoptosis. Consequently, pharmacological targeting of these metabolic liabilities upon TIS induction in vivo prompted tumor regression and improved treatment outcome further. These findings unveil the hypercatabolic nature of TIS that is therapeutically exploitable by synthetic lethal metabolic targeting. Thus, this treatment approach for the first time combines the inhibition of a tumor-specific senescence program with the interference of a metabolic pathway.

Apoptose und Seneszenz sind stress-responsive, genetisch verankerte „Failsafe“- Mechanismen, welche die Zelle vor maligner Transformation schützen. Onkogenes Ras induziert zelluläre Seneszenz über den p16/Retinoblastoma (Rb)-Signalweg und führt dabei zu einem permanenten Zellzyklusarrest - das tumorsuppressive Potential von Seneszenz in vivo bleibt jedoch bis heute fraglich. In seneszenten Zellen ist die Expression von S-Phase relevanten Gene durch die lokale Ausbildung von Heterochromatin, bzw. der Methylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me) blockiert. Dies lässt vermuten, dass Seneszenz ein epigenetische kontrollierter Prozess ist und von Proteinen wie der Rb-assozierte Histonmethyltransferase Suv39h1 reguliert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eµ-N-Ras transgene Mäuse mit heterozygoten Läsionen im Suv39h1 oder p53 Lokus aggressive T-Zell Lymphome entwickeln, die gegen Suv39h1, bzw. p53-Expression selektieren. Im Gegensatz dazu entwickeln N-Ras-transgene Wildtyp-Tiere („Kontrollen“) vorrangig nicht-lymphoide Tumoren und sterben signifikant später. In primären Lymphozyten induziert onkogenes Ras einen Suv39h1-abhängigen, H3K9me-assoziierten Proliferationsarrest und kann dadurch Lymphomgenese verhindern. Suv39h1-defiziente Lymphomzellen wachsen exponentiell und sind, entgegen p53 defizienten Zellen, sensitiv gegenüber Adriamycin-induzierten Zelltod (Apoptose). Jedoch arretieren nur Kontroll-Lymphome unter Therapie in vitro wenn Apoptose blockiert ist, nicht aber Suv39h1 oder p53-defiziente Lymphomzellen. Diese Resultate identifizieren Ras-induzierte Seneszenz als einen neuen, H3K9me-abhängigen Tumorsuppressor-Mechanismus, wobei dessen Inaktivierung die Entwicklung von aggressiven, aber dennoch Apoptose-kompetenten Lymphomen herbeiführt. / Cellular “failsafe” programs like apoptosis or senescence are genetically encoded, stress-responsive mechanisms that ultimately counteract malignant transformation. Acute induction of oncogenic Ras provokes cellular senescence that involves the p16/Retinoblastoma (Rb) pathway to induce a permanent arrest, but the tumor suppressive mechanism in vivo still remains questionable. Senescent cells display heterochromatic features on S-phase relevant genes involving methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), which may depend on the Rb-associated histone methyltransferase Suv39h1. In the present thesis it was shown that Eµ-N-Ras transgenic mice harboring targeted heterozygous lesions at the Suv39h1, or the p53 locus for comparison, succumb to invasive T cell lymphomas that lack expression of Suv39h1 or p53, respectively. By contrast, most N-Ras-transgenic wildtype (“control”) animals develop a non-lymphoid neoplasia significantly later. Proliferation of primary lymphocytes is directly stalled by a Suv39h1-dependent, H3K9me-related senescent growth arrest in response to oncogenic Ras, thereby cancelling lymphomagenesis at an initial step. Suv39h1-deficient lymphoma cells grow rapidly but, unlike p53-deficient cells, remain highly susceptible to adriamycin-induced apoptosis. In contrast, only control, but not Suv39h1-deficient or p53-deficient lymphomas senesce after drug therapy when apoptosis is blocked. These results identify H3K9me-mediated senescence as a novel Suv39h1-dependent tumour suppressor mechanism whose inactivation permits the formation of aggressive but apoptosis-competent lymphomas in response to oncogenic Ras.

Die Aufrechterhaltung der sogenannten failsafe Programme ist ein wichtiges Kennzeichen des zellulären Lebens, da das genaue Gleichgewicht zwischen Proliferation und Wachstumsarrest es sicherstellt, dass die Zelle sich selber vor potentiell gefährlichen Mutationen schützen kann. Apoptose und Seneszenz bewahren die Zellhomeostase und sind von aüsserster Bedeutung dafür, die Zelle vor maligner Transformation zu bewahren. Die Seneszens zeichnet sich dabei durch Veränderungen des Heterochromatins bei Genen aus, welche für den Eintritt in die DNA-Synthese-Phase des Zellzyklus verantwortlich sind. Insgesamt wurde die Bedeutung epigenetischer Modifikationen bei malignen Erkrankungen in den letzten Jahren immer deutlicher. So konnte gezeigt werden, dass die Rb-assoziierte Histon-Methyltransferase Suv39h1 ein entscheidender Vermittler der Seneszenz in Ras-induziertem Maus Lymphom-Modell ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die transgenen Eµ-myc Maüse (ähnlich dem Burkitt''s Lymphom im Menschen), wenn sie mit Suv39h1-defizienten Maüsen gekreuzt werden. Die Überexpression von Myc, wie sie in humanen und murinen Tumoren zu beobachten ist, induziert primär ein apoptotische Antwort mit dem zentralen Vermittler p53. Allerdings bewirkte die Suv39h1 Defizienz, obwohl sie die Lebenserwartung signifikant verkürzte, keine Veränderung der Apoptose-Rate in diesem Modell. Dieses Ergebnis demonstriert die Tumor-suprimierende Wirkung des Suv39h1 in Myc-getriebener Lymphomagenese. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein zusätzlicher Mechanismus zur Vermittlung Myc-induzierter Seneszenz unter Einbeziehung des Zytokin-Signaling identifiziert. Im Falle der Expression von intaktem Suv39h1 in der Tumorzelle kann TGF-beta die Myc-induzierte Seneszenz in vivo beeinflussen. Schliesslich ergaben die Untersuchungen, dass die Suv39h1-defizienten Lymphome über eine beeinträchtigte Therapie-Anwort verfügen, da sie keine Therapeutika-induzierte Seneszenz ausführen können. / Maintenance of cellular failsafe pathways (apoptosis and senescence) is one of the hallmarks of life, as fine equilibrium between proliferation and growth arrest ensures that the cell can protect itself from the potentially dangerous mutations. Senescence is a mechanism distinguished by heterochromatin modifications leading to silencing of the genes responsible for the entry to the DNA synthesis [S] phase of the cell cycle. Involvement of epigenetic modifications in cancer development has been subject of a more intense research in the past few years. It was shown that the Rb-associated histone methyltransferase Suv39h1 is a critical mediator of senescence in a Ras-induced mouse lymphoma model. Additional mechanisms of the senescence regulation are currently being under investigation. In this thesis Eµ-myc transgenic mice, crossed to mice deficient for Suv39h1, were shown to succumb to the same type of B-cell lymphoma (similar to Burkitt''s lymphoma in humans). Overexpression of Myc, as seen in human and mouse tumors will primarily induce an apoptotic response using p53 as a mediator of this response. In Eµ-myc, Suv39h1-/- mouse model deficiency in Suv39h1 has significantly shortened life expectancy, but it did not affect spontaneous apoptosis rates. This finding established Suv39h1 as a tumor suppressor in Myc-lymphomagenesis. Further, an additional mechanism of mediating oncogene-induced senescence involving cytokine signaling was identified and reported here. When intact Suv39h1 is present in the tumor, TGF-beta is able to mediate oncogene-induced senescence in vivo. Finally, in the treatment studies it was shown that Suv39h1 deficient lymphomas have an impaired response to chemotherapy, caused by their inability to execute drug-induced senescence. This finding can be of use for the design of novel cancer therapies.