Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) ist ein hochkonserviertes, ubiquitär in Eukaryonten vorkommendes Protein. Seine Bezeichnung geht auf die erstmalige Beschreibung in Tumorzellen zurück und weist zugleich auf seine besondere translationelle Regulation hin. Das zugehörige Gen wird als TPT1 bezeichnet und befindet sich beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosom 13. Eine pathophysiologische Bedeutung für TCTP wurde bei Tumorerkrankungen, Erkrankungen des allergischen Formenkreises sowie bei Infektionen durch Parasiten beschrieben. Für diese Arbeit wurde zur Untersuchung grundlegender Regulationsphänomene die TCTP-mRNA des Kaninchens als geeignetes Modell ausgewählt. Es wurden die volllangen TCTP-mRNA1 und 2, die sich in der Länge ihrer 3'UTR unterscheiden, sowie Deletionsvarianten, denen die UTR-Abschnitte fehlen, kloniert. In Proteinbindungsstudien (Electromobility Shift Assays, UV-Crosslinking-Experimente, RNA-Affinitätschromatographie) wurden potentielle Bindungsfaktoren der TCTP-UTRs analysiert. Die an der mRNA des Kaninchens erarbeiteten Ergebnisse wurden durch Untersuchungen an humanen Melanomzellen ergänzt. In in vitro Translationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Regulation der TCTP-mRNA durch ihre 5'UTR und 3'UTR2 vermittelt wird. In RNA-Bindungsstudien konnte eine Reihe potentieller Bindungsfaktoren der UTRs charakterisiert werden. Bei Verwendung von Extrakten aus verschiedenen Kaninchengeweben zeigten sich deutliche gewebsspezifische Unterschiede. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass es in der Melanomzelllinie MeWo bei der Ausbildung einer Chemoresistenz zu einer Expressionssteigerung des TCTP kommt. In einem ersten Schritt wurde der Beitrag von Transkription und Translation in vergleichenden Northern und Western Blot Analysen untersucht. Auf mRNA-Niveau findet man in den resistenten Zellen eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu den sensiblen Zellen. Der mRNA-Menge in den chemosensiblen Zellen steht eine vergleichsweise geringe Menge an Protein gegenüber. Folglich liegt die mRNA in diesen Zellen in einem inaktiven Zustand vor. Es konnten drei Cytoskelettproteine gamma-Actin, beta-Tubulin und alpha-Actinin als Bindungspartner der TCTP-3'UTR in den Melanomzellen identifiziert werden. Eine Bedeutung von TCTP für die Entstehung der Chemoresistenz lässt sich aufgrund seiner anti-apoptotischen Wirkung vermuten. Die Regulation der TCTP-Translation stellt bei durch Cytostatika hervorgerufener Hemmung der Transkription einen wichtigen Pathomechanismus in chemoresistenten Melanomzellen dar. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is a highly conserved protein expressed in all eukaryotic organisms. It was first described in tumor cells showing a special regulation of translation. The chromosomal localisation of the respective human gene TPT1 has been determined (13q14). TCTP has been implicated in cellular processes such as cell growth and apoptosis. Its medical importance has been shown in malignant transformation, allergic reactions and immunity against parasitic organisms. In order to investigate basic mechanisms of translational regulation the rabbit TCTP-mRNA was chosen due to its high homology to its human counterpart. The TPT1 gene is transcribed into two TCTP-mRNAs differing in the length of their 3'untranslated regions. These two mRNAs and variants missing the untranslated regions were cloned into expression vectors. In Electro mobility shift assays, UV-crosslinking assays and RNA affinity purification several TCTP-mRNA binding factors were characterised. Furthermore, the role of TCTP in human chemoresistant melanoma cells was investigated. In cell-free translation assays the importance of the 5'UTR and 3'UTR2 was shown. However, in wheat germ extracts the regulation of the TCTP-mRNA mediated by its 5'UTR is less important. In Electro mobility shift assays and UV-crosslinking assays with radiolabelled transcripts of the untranslated regions great variations in tissue-specific protein binding were found. Recently, TCTP had been implicated in the development of chemoresistance in the human melanoma cell line MeWo. As a first step, the contribution of transcriptional and translational regulation was analysed by comparing TCTP-expression in Northern and Western blot assays. Transcription of the TPT1 gene is increased in chemoresistant melanoma cells whereas translation is inhibited in those cells susceptible to chemotherapeutic agents. Three proteins, gamma-actin, beta-tubulin and alpha-actinin, were identified as factors binding to the TCTP-3'UTR in melanoma cells. For the interaction of these cytoskeleton components their ability to bind intracellular calcium ions could be of great importance. The role of TCTP in the development of chemoresistance can be explained by its anti-apoptotic function. In conclusion, the regulation of TCTP-translation when transcription is blocked by inhibitors of DNA-function is an important mechanism to overcome the effect of these anti-proliferative agents.

Die Therapie von disseminierten malignen Tumoren durch Chemotherapie allein oder in Kombination mit Bestrahlung oder Hyperthermie führt nur in 20-50% zu einem Ansprechen. Dieser Behandlungserfolg wird häufig dadurch limitiert, daß im Verlauf der Therapie zur Entwicklung einer Chemoresistenz kommt. Ziel der Arbeit war es, eine generelle Analyse der Proteinexpression in der in vitro herbeigeführten Chemoresistenz durchzuführen. Dafür wurden Zellkulturen von Magen-, Kolon-, Pankreas, Mammakarzinom und Fibrosarkom die eine Resistenz gegen Daunorubicin und Mitoxantron besitzen benutzt und mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten (pH 4,0-8,0) in der ersten Dimension und einen linearen Polyarcylamidgel (12%) in der zweiten Dimension analysiert. Nach Färbung in Coomassie blau wurde eine rechnergestützte Imageanalyse mit dem PDQuest System durchgeführt. Proteinspots die eine auffällige Änderung zeigten wurden isoliert, und nach enzymatischer Gelhydrolyse mikrosequenziert bzw. durch Massenspektrometrie und anschließender micropore HPLC Analyse identifiziert. Acht Proteine, die in den chemoresistenten Zellinien überexprimiert waren, konnten identifiziert werden: Thioredoxin, Annexin 1; Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-Dissoziations Inhibitor, Fettsäurebindendes Protein(E-FABP), Adenin Phosphoribosyl Transferase, und BCSG-1 / The therapy of advanced cancer using chemotherapy alone or in combination with radiation or hyperthermia yields an overall response rate of about 20-50%. This success is often marred by the development of resistance to cytostatic drugs. The aim was to study the global analysis of protein expression in the development of chemoresistance in vitro. We therefore used a cell culture model derived from the gastric, colorectal, pancreatic, mamma carcinoma and fibrosarcoma cell line selected to daunorubicin and mitoxantrone. These cell lines were analysed using two-dimensional electrophoresis in immobilized pH-gradients (pH 4.0-8.0) in the first dimension and linear polyacrylamide gels (12%) in the second dimension. After staining with coomassie brilliant blue, image analysis was performed using the PDQuest system. Spots of interest were isolated using preparative two-dimensional electrophoresis and subjected to microsequencing after enzymatic hydrolysis in gel, mass spectrometric data and sequencing of the peptides after their fractionation using microbore HPLC identified. Eight proteins were identified that were overexpressed in chemoresistant cell lines: Thioredoxin, Annexin 1, Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-dissoziation Inhibitor, fatty acid binding protein(E-FABP), adenin phosphoribosyl Transferase, and BCSG-1.

Die schlechte Prognose der meisten disseminierten Tumorerkrankungen ist häufig in einer vorbestehenden oder erworbenen Resistenz gegenüber Zytostatika begründet. Da die meisten Zytostatika mit zellulären Strukturen interagieren, war lange angenommen worden, dass der antineoplastische Effekt unmittelbar durch massive Zellschädigung bewirkt wird. Hieraus folgte, dass Chemoresistenz auf Mechanismen beruhen müsse, welche das Zytostatikum an der Wechselwirkung mit seiner intrazellulären Zielstruktur hindern. Arbeiten der letzten Jahre haben jedoch gezeigt, dass die meisten Zytostatika indirekt über DNA-Schädigung ein relativ uniformes, genetisch kodiertes Zelltod-Programm auslösen, demzufolge postuliert wurde, dass auch Apoptosedefekte für "Multi-Drug-Resistenz" verantwortlich sein könnten. Allerdings ist der tatsächlich Beitrag zytostatika-induzierter Apoptose am Therapieerfolg nicht geklärt, wobei der Wahl geeigneter Testsysteme eine wesentliche Bedeutung für diese Kontroverse zuzukommen scheint. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist daher die Etablierung eines transgenen Lymphom-Modells, in welchem chemotherapeutische Effekte an spontan entstandenen Tumoren mit definierten genetischen Läsionen in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden können. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Mutationen in apoptose-relevanten Genloci wie p53, INK4a/ARF oder bcl2 sowohl die Manifestation myc-transgener Lymphome dramatisch beschleunigen, als auch den Therapieerfolg kompromittieren. Neben Apoptose wurde darüberhinaus prämature Seneszenz, ein terminaler Zellzyklus-Arrest, als prognose-relevantes Chemotherapie-Effektorprogramm identifiziert. Damit dokumentiert die vorliegende Arbeit einen wichtigen Zusammenhang von Gendefekten, die während der Tumorigenese erworben wurden, und später evidenter Chemoresistenz, wobei manche Mutationen bereits vor Zytostatika-Exposition Resistenz begründen können. Die Identifikation und pharmakogenomische Charakterisierung potentiell resistenz-vermittelnder Gene und Mutationen in relevanten Testsystemen wird für die Entwicklung spezifischerer, aber weniger toxischer "targeted Therapeutics" von großer Bedeutung sein. / Intrinsic or acquired chemoresistance is the major cause for the adverse outcome of disseminated malignancies. The fact that most anticancer agents bind to subcellular targets prompted the assumption that drug-induced cytotoxicity must be a direct consequence of severe cellular damage. Hence, chemoresistance was thought to arise from mechanisms that prevent or disrupt the drug-target interaction. By contrast, more recent data suggested that DNA damage caused by most, if not all, anticancer agents may trigger a relatively uniform, genetically encoded cell death program. In turn, defects in the apoptotic machinery should account for multi-drug resistance as well. However, due to technical limitations of current test systems, it has been difficult to assess the overall contribution of apoptotic cell death to treatment outcome. In the studies presented here, a transgenic mouse lymphoma model was established in order to exploit drug responses of spontaneously developed malignancies growing at their natural sites but harboring defined genetic defects. Using this model, alterations in apoptosis-related gene loci such as p53, INK4a/ARF or bcl2 result in both dramatic acceleration of myc-driven lymphomagenesis and compromised treatment responses. Importantly, not only apoptosis, but premature senescence, a terminal cell-cycle arrest, was found to impact on treatment outcome. In essence, this work describes and important connection between cancer genes and cancer therapy, i.e. genetic defects acquired during tumorigenesis may already co-select for chemoresistance prior to any drug encounter. The identification and pharmacogenomic evaluation of resistance conferring candidate genes and mutations using adequate test systems is likely to play a key role in the development of novel, more specific but less toxic so called "targeted Therapeutics".

Tumorzellen können vielfältige Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika entwickeln. Untersuchungen an drei humanen Tumorzellinien und ihren cisplatinresistenten Varianten zeigten eine Assoziation von erhöhter MRP2-Expression und dem Auftreten von Cisplatinresistenz. Darüberhinaus waren die cisplatinresistenten Zellinien gegenüber Carboplatin kreuzresistent. Um weitere Faktoren im Zusammenhang mit der Cisplatinresistenz zu untersuchen, wurde der Mutationsstatus von p53 und der zelluläre Glutathiongehalt in den Zellinien bestimmt. Der offene Leserahmen von MRP2 aus der cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS wurde für die Transfektion in die cisplatinsensitive Zellinie A2780 genutzt. Die Transfektanten zeigten eine Überexpression von MRP2 und wiesen eine Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin auf. Dies konnte in Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen unter Cisplatinbehandlung gestätigt werden. Durch computergestützte Faltungsanalysen von Abschnitten der MRP2-mRNA wurden zwei potentielle Ribozymschnittstellen ausgewählt. Die konstruierten Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden im zellfreien System auf ihre Schnittaktivität getestet und erwiesen sich als katalytisch aktiv. Es wurden verschiedene kinetische Parameter für RzM1 und RzM2 ermittelt und mit anderen Ribozymen verglichen. Die Ribozyme zeigten eine gute Effektivität bei der Spaltung ihres Zielmoleküls, wobei RzM1 die höhere Effektivität aufwies. Beide Ribozyme wurden auf ihre Wirksamkeit durch Transfektion in die Zellinie A2780RCIS getestet. Die untersuchten Transfektanten zeigten eine geringere Expression von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene und wiesen eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin und Etoposid auf. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 waren gleichermaßen für die Expressionsregulierung von MRP2 in Tumorzellen geeignet. In Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen wurde funktionell bestätigt, daß die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten auf eine Cisplatinbehandlung stärker ansprechen als die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS. Die Anwendung der Ribozyme RzM1 und RzM2 zur Unterstützung der Chemotherapie von Tumorzellen scheint daher vielversprechend. / Tumour cells can develop a lot of resistance mechanisms against cytostatic drugs. Examinations of three human tumour cell lines and their cisplatinresistant variants showed an association of elevated MRP2 expression and the occurrance of cisplatinresistance. Moreover, the cisplatinresistant cell lines were crossresistant against carboplatin. To examine further factors in context of cisplatinresistance the mutation status of p53 and the cellular glutathione content of the cell lines were determined. The MRP2-open reading frame of the cisplatinresistant ovarian carcinoma cell line A2780RCIS was used for transfection into the cisplatinsensitive cell line A2780. The transfectants showed an overexpression of MRP2 and a resistance against cisplatin and carboplatin. This could be confirmed with analysis of the cell cycle and apoptosis induction after treatment with cisplatin. Using computer aided folding analysis of MRP2 mRNA parts two possible ribozyme cleavage sites were selected. The constructed anti-MRP2 hammerhead ribozymes RzM1 and RzM2 were tested in a cell-free system with respect to their cleavage activities and were found to be catalytic active. Various kinetic parameters of RzM1 and RzM2 were determined and compared with other ribozymes. The ribozymes showed a good effectivity for the substrate cleavage, although RzM1 had the better effectivity. Both ribozymes were tested for their effectiveness after transfection into the cell line A2780RCIS. The transfectants showed a lower MRP2 expression on mRNA and protein level and also a reduced resistance against cisplatin, carboplatin, daunorubicin, and etoposide. The ribozymes RzM1 and RzM2 were both equally suitable for the regulation of MRP2 expression in tumour cells. Analysis of cell cycle and apoptosis induction could confirm functionally the higher sensitivity of the A2780RCIS-anti-MRP2 ribozyme transfectants after treatment with cisplatin in comparison to the cisplatinresistant cell line A2780RCIS. Therefore, the application of the ribozymes RzM1 and RzM2 for the support of cancer chemotherapy seems to be promising.

Palliative Therapie inklusive Chemotherapie und andere Behandlungsmethoden wie Hyperthermie ist oftmals die einzig verbleibende Option bei der Behandlung von bestimmten soliden Tumoren wie Magen- und Pankreaskarzinom. Leider ist der Erfolg dieser Therapien limitiert durch geringes Ansprechen der Tumoren auf die Behandlung und die Entwicklung einer Therapieresistenz. In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181 mit Hilfe von Proteomics (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese, computergestützter Gel-Analyse und Massenspektrometrie) in vitro untersucht, um Kandidatenproteine zu finden, die potentiell mit Thermoresistenz bzw. Chemoresistenz assoziiert sind. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF kompatible Spezialsilberfärbung neu entwickelt. Es zeigte sich eine differentielle Expression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, darunter eine Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten sowie eine Überexpression von Enzymen des Arzneimittelmetabolismus in Zellen mit sowohl chemo- als auch thermoresistentem Phänotyp. Darüber hinaus wurden weitere Proteine identifiziert, welche hinsichtlich ihrer Beteiligung an Resistenzphänomenen im Vorfeld noch gar nicht charakterisiert worden sind (u.a. Aldehyd-Dehydrogenase 1, Transgelin, Phosphoglyceromutase). / Palliative treatment including chemotherapy and other modes of treatment, e.g. hyperthermia, is often the only remaining option in the management of certain solid tumours including gastric and pancreatic carcinoma. Unfortunately, its efficacy is poor due to low tumour sensitivity and the development of therapy resistance. The aim was to study in vitro global protein expression of chemo- and thermoresistant variants of the stomach cancer cell line EPG85-257 and the pancreatic cancer cell line EPP85-181 using proteomics (two-dimensional electrophoresis in combination with computer-assisted image analysis and mass spectrometry) to identify candidate proteins potentially associated with thermoresistance alone or in combination with chemoresistance. In this context, a special silver stain compatible with Maldi-TOF was developed. A large number of proteins was found to be differentially expressed in thermoresistant cells including up-regulation of molecular chaperones at practically every sub-cellular level as well as over-expression of enzymes involved in drug metabolism in both chemo- and thermoresistant cells. Furthermore, other proteins were identified that have not yet been linked to resistance phenomena (e.g. aldehyde dehydrogenase 1, transgelin, phosphoglycerate mutase).

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Die Dissertationsarbeit untersucht genetische Varianten in Zellkulturmodellen des metastatischen und kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Außerdem werden Mechanismen der Chemoresistenz, insbesondere der Resistenz gegen Cisplatin und Docetaxel in diesen Zelllinien untersucht. / This Dissertation evaluates genetic variants found in cell culture models of metastatic castration resistant prostate cancer. Furthermore, mechanisms of resistance against the chemotherapeutic drugs cisplatin and docetaxel are investigated in these cell lines.

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