Tumorzellen können vielfältige Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika entwickeln. Untersuchungen an drei humanen Tumorzellinien und ihren cisplatinresistenten Varianten zeigten eine Assoziation von erhöhter MRP2-Expression und dem Auftreten von Cisplatinresistenz. Darüberhinaus waren die cisplatinresistenten Zellinien gegenüber Carboplatin kreuzresistent. Um weitere Faktoren im Zusammenhang mit der Cisplatinresistenz zu untersuchen, wurde der Mutationsstatus von p53 und der zelluläre Glutathiongehalt in den Zellinien bestimmt. Der offene Leserahmen von MRP2 aus der cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS wurde für die Transfektion in die cisplatinsensitive Zellinie A2780 genutzt. Die Transfektanten zeigten eine Überexpression von MRP2 und wiesen eine Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin auf. Dies konnte in Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen unter Cisplatinbehandlung gestätigt werden. Durch computergestützte Faltungsanalysen von Abschnitten der MRP2-mRNA wurden zwei potentielle Ribozymschnittstellen ausgewählt. Die konstruierten Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden im zellfreien System auf ihre Schnittaktivität getestet und erwiesen sich als katalytisch aktiv. Es wurden verschiedene kinetische Parameter für RzM1 und RzM2 ermittelt und mit anderen Ribozymen verglichen. Die Ribozyme zeigten eine gute Effektivität bei der Spaltung ihres Zielmoleküls, wobei RzM1 die höhere Effektivität aufwies. Beide Ribozyme wurden auf ihre Wirksamkeit durch Transfektion in die Zellinie A2780RCIS getestet. Die untersuchten Transfektanten zeigten eine geringere Expression von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene und wiesen eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin und Etoposid auf. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 waren gleichermaßen für die Expressionsregulierung von MRP2 in Tumorzellen geeignet. In Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen wurde funktionell bestätigt, daß die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten auf eine Cisplatinbehandlung stärker ansprechen als die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS. Die Anwendung der Ribozyme RzM1 und RzM2 zur Unterstützung der Chemotherapie von Tumorzellen scheint daher vielversprechend. / Tumour cells can develop a lot of resistance mechanisms against cytostatic drugs. Examinations of three human tumour cell lines and their cisplatinresistant variants showed an association of elevated MRP2 expression and the occurrance of cisplatinresistance. Moreover, the cisplatinresistant cell lines were crossresistant against carboplatin. To examine further factors in context of cisplatinresistance the mutation status of p53 and the cellular glutathione content of the cell lines were determined. The MRP2-open reading frame of the cisplatinresistant ovarian carcinoma cell line A2780RCIS was used for transfection into the cisplatinsensitive cell line A2780. The transfectants showed an overexpression of MRP2 and a resistance against cisplatin and carboplatin. This could be confirmed with analysis of the cell cycle and apoptosis induction after treatment with cisplatin. Using computer aided folding analysis of MRP2 mRNA parts two possible ribozyme cleavage sites were selected. The constructed anti-MRP2 hammerhead ribozymes RzM1 and RzM2 were tested in a cell-free system with respect to their cleavage activities and were found to be catalytic active. Various kinetic parameters of RzM1 and RzM2 were determined and compared with other ribozymes. The ribozymes showed a good effectivity for the substrate cleavage, although RzM1 had the better effectivity. Both ribozymes were tested for their effectiveness after transfection into the cell line A2780RCIS. The transfectants showed a lower MRP2 expression on mRNA and protein level and also a reduced resistance against cisplatin, carboplatin, daunorubicin, and etoposide. The ribozymes RzM1 and RzM2 were both equally suitable for the regulation of MRP2 expression in tumour cells. Analysis of cell cycle and apoptosis induction could confirm functionally the higher sensitivity of the A2780RCIS-anti-MRP2 ribozyme transfectants after treatment with cisplatin in comparison to the cisplatinresistant cell line A2780RCIS. Therefore, the application of the ribozymes RzM1 and RzM2 for the support of cancer chemotherapy seems to be promising.

Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) ist ein hochkonserviertes, ubiquitär in Eukaryonten vorkommendes Protein. Seine Bezeichnung geht auf die erstmalige Beschreibung in Tumorzellen zurück und weist zugleich auf seine besondere translationelle Regulation hin. Das zugehörige Gen wird als TPT1 bezeichnet und befindet sich beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosom 13. Eine pathophysiologische Bedeutung für TCTP wurde bei Tumorerkrankungen, Erkrankungen des allergischen Formenkreises sowie bei Infektionen durch Parasiten beschrieben. Für diese Arbeit wurde zur Untersuchung grundlegender Regulationsphänomene die TCTP-mRNA des Kaninchens als geeignetes Modell ausgewählt. Es wurden die volllangen TCTP-mRNA1 und 2, die sich in der Länge ihrer 3'UTR unterscheiden, sowie Deletionsvarianten, denen die UTR-Abschnitte fehlen, kloniert. In Proteinbindungsstudien (Electromobility Shift Assays, UV-Crosslinking-Experimente, RNA-Affinitätschromatographie) wurden potentielle Bindungsfaktoren der TCTP-UTRs analysiert. Die an der mRNA des Kaninchens erarbeiteten Ergebnisse wurden durch Untersuchungen an humanen Melanomzellen ergänzt. In in vitro Translationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Regulation der TCTP-mRNA durch ihre 5'UTR und 3'UTR2 vermittelt wird. In RNA-Bindungsstudien konnte eine Reihe potentieller Bindungsfaktoren der UTRs charakterisiert werden. Bei Verwendung von Extrakten aus verschiedenen Kaninchengeweben zeigten sich deutliche gewebsspezifische Unterschiede. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass es in der Melanomzelllinie MeWo bei der Ausbildung einer Chemoresistenz zu einer Expressionssteigerung des TCTP kommt. In einem ersten Schritt wurde der Beitrag von Transkription und Translation in vergleichenden Northern und Western Blot Analysen untersucht. Auf mRNA-Niveau findet man in den resistenten Zellen eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu den sensiblen Zellen. Der mRNA-Menge in den chemosensiblen Zellen steht eine vergleichsweise geringe Menge an Protein gegenüber. Folglich liegt die mRNA in diesen Zellen in einem inaktiven Zustand vor. Es konnten drei Cytoskelettproteine gamma-Actin, beta-Tubulin und alpha-Actinin als Bindungspartner der TCTP-3'UTR in den Melanomzellen identifiziert werden. Eine Bedeutung von TCTP für die Entstehung der Chemoresistenz lässt sich aufgrund seiner anti-apoptotischen Wirkung vermuten. Die Regulation der TCTP-Translation stellt bei durch Cytostatika hervorgerufener Hemmung der Transkription einen wichtigen Pathomechanismus in chemoresistenten Melanomzellen dar. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is a highly conserved protein expressed in all eukaryotic organisms. It was first described in tumor cells showing a special regulation of translation. The chromosomal localisation of the respective human gene TPT1 has been determined (13q14). TCTP has been implicated in cellular processes such as cell growth and apoptosis. Its medical importance has been shown in malignant transformation, allergic reactions and immunity against parasitic organisms. In order to investigate basic mechanisms of translational regulation the rabbit TCTP-mRNA was chosen due to its high homology to its human counterpart. The TPT1 gene is transcribed into two TCTP-mRNAs differing in the length of their 3'untranslated regions. These two mRNAs and variants missing the untranslated regions were cloned into expression vectors. In Electro mobility shift assays, UV-crosslinking assays and RNA affinity purification several TCTP-mRNA binding factors were characterised. Furthermore, the role of TCTP in human chemoresistant melanoma cells was investigated. In cell-free translation assays the importance of the 5'UTR and 3'UTR2 was shown. However, in wheat germ extracts the regulation of the TCTP-mRNA mediated by its 5'UTR is less important. In Electro mobility shift assays and UV-crosslinking assays with radiolabelled transcripts of the untranslated regions great variations in tissue-specific protein binding were found. Recently, TCTP had been implicated in the development of chemoresistance in the human melanoma cell line MeWo. As a first step, the contribution of transcriptional and translational regulation was analysed by comparing TCTP-expression in Northern and Western blot assays. Transcription of the TPT1 gene is increased in chemoresistant melanoma cells whereas translation is inhibited in those cells susceptible to chemotherapeutic agents. Three proteins, gamma-actin, beta-tubulin and alpha-actinin, were identified as factors binding to the TCTP-3'UTR in melanoma cells. For the interaction of these cytoskeleton components their ability to bind intracellular calcium ions could be of great importance. The role of TCTP in the development of chemoresistance can be explained by its anti-apoptotic function. In conclusion, the regulation of TCTP-translation when transcription is blocked by inhibitors of DNA-function is an important mechanism to overcome the effect of these anti-proliferative agents.

Die Therapie von disseminierten malignen Tumoren durch Chemotherapie allein oder in Kombination mit Bestrahlung oder Hyperthermie führt nur in 20-50% zu einem Ansprechen. Dieser Behandlungserfolg wird häufig dadurch limitiert, daß im Verlauf der Therapie zur Entwicklung einer Chemoresistenz kommt. Ziel der Arbeit war es, eine generelle Analyse der Proteinexpression in der in vitro herbeigeführten Chemoresistenz durchzuführen. Dafür wurden Zellkulturen von Magen-, Kolon-, Pankreas, Mammakarzinom und Fibrosarkom die eine Resistenz gegen Daunorubicin und Mitoxantron besitzen benutzt und mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten (pH 4,0-8,0) in der ersten Dimension und einen linearen Polyarcylamidgel (12%) in der zweiten Dimension analysiert. Nach Färbung in Coomassie blau wurde eine rechnergestützte Imageanalyse mit dem PDQuest System durchgeführt. Proteinspots die eine auffällige Änderung zeigten wurden isoliert, und nach enzymatischer Gelhydrolyse mikrosequenziert bzw. durch Massenspektrometrie und anschließender micropore HPLC Analyse identifiziert. Acht Proteine, die in den chemoresistenten Zellinien überexprimiert waren, konnten identifiziert werden: Thioredoxin, Annexin 1; Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-Dissoziations Inhibitor, Fettsäurebindendes Protein(E-FABP), Adenin Phosphoribosyl Transferase, und BCSG-1 / The therapy of advanced cancer using chemotherapy alone or in combination with radiation or hyperthermia yields an overall response rate of about 20-50%. This success is often marred by the development of resistance to cytostatic drugs. The aim was to study the global analysis of protein expression in the development of chemoresistance in vitro. We therefore used a cell culture model derived from the gastric, colorectal, pancreatic, mamma carcinoma and fibrosarcoma cell line selected to daunorubicin and mitoxantrone. These cell lines were analysed using two-dimensional electrophoresis in immobilized pH-gradients (pH 4.0-8.0) in the first dimension and linear polyacrylamide gels (12%) in the second dimension. After staining with coomassie brilliant blue, image analysis was performed using the PDQuest system. Spots of interest were isolated using preparative two-dimensional electrophoresis and subjected to microsequencing after enzymatic hydrolysis in gel, mass spectrometric data and sequencing of the peptides after their fractionation using microbore HPLC identified. Eight proteins were identified that were overexpressed in chemoresistant cell lines: Thioredoxin, Annexin 1, Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-dissoziation Inhibitor, fatty acid binding protein(E-FABP), adenin phosphoribosyl Transferase, and BCSG-1.

Die schlechte Prognose der meisten disseminierten Tumorerkrankungen ist häufig in einer vorbestehenden oder erworbenen Resistenz gegenüber Zytostatika begründet. Da die meisten Zytostatika mit zellulären Strukturen interagieren, war lange angenommen worden, dass der antineoplastische Effekt unmittelbar durch massive Zellschädigung bewirkt wird. Hieraus folgte, dass Chemoresistenz auf Mechanismen beruhen müsse, welche das Zytostatikum an der Wechselwirkung mit seiner intrazellulären Zielstruktur hindern. Arbeiten der letzten Jahre haben jedoch gezeigt, dass die meisten Zytostatika indirekt über DNA-Schädigung ein relativ uniformes, genetisch kodiertes Zelltod-Programm auslösen, demzufolge postuliert wurde, dass auch Apoptosedefekte für "Multi-Drug-Resistenz" verantwortlich sein könnten. Allerdings ist der tatsächlich Beitrag zytostatika-induzierter Apoptose am Therapieerfolg nicht geklärt, wobei der Wahl geeigneter Testsysteme eine wesentliche Bedeutung für diese Kontroverse zuzukommen scheint. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist daher die Etablierung eines transgenen Lymphom-Modells, in welchem chemotherapeutische Effekte an spontan entstandenen Tumoren mit definierten genetischen Läsionen in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden können. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Mutationen in apoptose-relevanten Genloci wie p53, INK4a/ARF oder bcl2 sowohl die Manifestation myc-transgener Lymphome dramatisch beschleunigen, als auch den Therapieerfolg kompromittieren. Neben Apoptose wurde darüberhinaus prämature Seneszenz, ein terminaler Zellzyklus-Arrest, als prognose-relevantes Chemotherapie-Effektorprogramm identifiziert. Damit dokumentiert die vorliegende Arbeit einen wichtigen Zusammenhang von Gendefekten, die während der Tumorigenese erworben wurden, und später evidenter Chemoresistenz, wobei manche Mutationen bereits vor Zytostatika-Exposition Resistenz begründen können. Die Identifikation und pharmakogenomische Charakterisierung potentiell resistenz-vermittelnder Gene und Mutationen in relevanten Testsystemen wird für die Entwicklung spezifischerer, aber weniger toxischer "targeted Therapeutics" von großer Bedeutung sein. / Intrinsic or acquired chemoresistance is the major cause for the adverse outcome of disseminated malignancies. The fact that most anticancer agents bind to subcellular targets prompted the assumption that drug-induced cytotoxicity must be a direct consequence of severe cellular damage. Hence, chemoresistance was thought to arise from mechanisms that prevent or disrupt the drug-target interaction. By contrast, more recent data suggested that DNA damage caused by most, if not all, anticancer agents may trigger a relatively uniform, genetically encoded cell death program. In turn, defects in the apoptotic machinery should account for multi-drug resistance as well. However, due to technical limitations of current test systems, it has been difficult to assess the overall contribution of apoptotic cell death to treatment outcome. In the studies presented here, a transgenic mouse lymphoma model was established in order to exploit drug responses of spontaneously developed malignancies growing at their natural sites but harboring defined genetic defects. Using this model, alterations in apoptosis-related gene loci such as p53, INK4a/ARF or bcl2 result in both dramatic acceleration of myc-driven lymphomagenesis and compromised treatment responses. Importantly, not only apoptosis, but premature senescence, a terminal cell-cycle arrest, was found to impact on treatment outcome. In essence, this work describes and important connection between cancer genes and cancer therapy, i.e. genetic defects acquired during tumorigenesis may already co-select for chemoresistance prior to any drug encounter. The identification and pharmacogenomic evaluation of resistance conferring candidate genes and mutations using adequate test systems is likely to play a key role in the development of novel, more specific but less toxic so called "targeted Therapeutics".

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Die Dissertationsarbeit untersucht genetische Varianten in Zellkulturmodellen des metastatischen und kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Außerdem werden Mechanismen der Chemoresistenz, insbesondere der Resistenz gegen Cisplatin und Docetaxel in diesen Zelllinien untersucht. / This Dissertation evaluates genetic variants found in cell culture models of metastatic castration resistant prostate cancer. Furthermore, mechanisms of resistance against the chemotherapeutic drugs cisplatin and docetaxel are investigated in these cell lines.

Palliative Therapie inklusive Chemotherapie und andere Behandlungsmethoden wie Hyperthermie ist oftmals die einzig verbleibende Option bei der Behandlung von bestimmten soliden Tumoren wie Magen- und Pankreaskarzinom. Leider ist der Erfolg dieser Therapien limitiert durch geringes Ansprechen der Tumoren auf die Behandlung und die Entwicklung einer Therapieresistenz. In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181 mit Hilfe von Proteomics (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese, computergestützter Gel-Analyse und Massenspektrometrie) in vitro untersucht, um Kandidatenproteine zu finden, die potentiell mit Thermoresistenz bzw. Chemoresistenz assoziiert sind. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF kompatible Spezialsilberfärbung neu entwickelt. Es zeigte sich eine differentielle Expression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, darunter eine Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten sowie eine Überexpression von Enzymen des Arzneimittelmetabolismus in Zellen mit sowohl chemo- als auch thermoresistentem Phänotyp. Darüber hinaus wurden weitere Proteine identifiziert, welche hinsichtlich ihrer Beteiligung an Resistenzphänomenen im Vorfeld noch gar nicht charakterisiert worden sind (u.a. Aldehyd-Dehydrogenase 1, Transgelin, Phosphoglyceromutase). / Palliative treatment including chemotherapy and other modes of treatment, e.g. hyperthermia, is often the only remaining option in the management of certain solid tumours including gastric and pancreatic carcinoma. Unfortunately, its efficacy is poor due to low tumour sensitivity and the development of therapy resistance. The aim was to study in vitro global protein expression of chemo- and thermoresistant variants of the stomach cancer cell line EPG85-257 and the pancreatic cancer cell line EPP85-181 using proteomics (two-dimensional electrophoresis in combination with computer-assisted image analysis and mass spectrometry) to identify candidate proteins potentially associated with thermoresistance alone or in combination with chemoresistance. In this context, a special silver stain compatible with Maldi-TOF was developed. A large number of proteins was found to be differentially expressed in thermoresistant cells including up-regulation of molecular chaperones at practically every sub-cellular level as well as over-expression of enzymes involved in drug metabolism in both chemo- and thermoresistant cells. Furthermore, other proteins were identified that have not yet been linked to resistance phenomena (e.g. aldehyde dehydrogenase 1, transgelin, phosphoglycerate mutase).

Das maligne Melanom ist für 90 % der Sterbefälle bei Hautkrebs verantwortlich (Garbe et al., 2022). Verschiedene Mutationen wirken sich auf die Signalwege aus und fördern die Karzinogenese, was zu einem ständigen Wandel der Melanomtherapie führt. Zusätzlich zu der, in frühen Stadien kurativen, chirurgischen Therapie, erzielt die zielgerichtete Therapie mit BRAF- und MEK-Inhibitoren in den letzten Jahren durchschlagende Erfolge für das Gesamtüberleben der Patienten, bei nicht-resezierbaren Metastasen wird weiterhin die Chemotherapie empfohlen. Zunehmende Therapieresistenzen schränken die Melanomtherapie ein. Müller et al. (2020) weisen auf Wildtyp p53 exprimierende Tumorzellen hin, die mithilfe der Expression von nukleärer Caspase-8 den G2/M-Zellzyklusarrest umgehen und so die Proliferation und Expansion entarteter Tumorzellen fördern. Bei der Untersuchung von 16 Melanomzellproben, die sich in ihrem BRAF-/NRAS- und p53 Mutationsstatus, sowie in ihren klinischen Vortherapien unterscheiden, konnte die potenziell klinische Relevanz der nukleären Caspase-8 herausgearbeitet werden. Wir konnten bestätigen, dass nukleär lokalisierte Caspase-8 bei Wildtyp p53 exprimierenden Tumorzellen zu Chemoresistenz und auch in geringem Maß zur Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien führt. Zunächst wurde die subzelluläre Lokalisation von Caspase-8 in den vorhandenen 16 Melanomzellproben mithilfe immunzytochemischer Färbung bestimmt, wobei sich herausstellte, dass die Melanomzellproben mit nukleärer Caspase-8, alle von Metastasen stammen. Das hohe Metastasierungspotenzial dieser Zellproben wurde weiterhin dadurch betont, dass die Melanomzellproben mit nukleär lokalisierter Caspase-8 die stärkste Migration aufwiesen. Dem gegenüberstehend präsentierten sie die geringste Proliferation, was den direkten Zusammenhang zwischen migrativen und proliferativen Eigenschaften bei Tumorzellen unterstreicht. Ebenso zeigten BRAF-mutierte Zellproben die stärkste Migration und bekräftigen, dass Melanompatienten mit BRAF-Mutation früher Metastasen entwickeln. Das stärkste Wachstum zeigten hingegen die Zellproben mit diffus lokalisierter Caspase-8, was die protektive Relevanz der diffusen Caspase-8 für Tumorzellen verdeutlicht. Ein Einfluss des p53-Mutationsstatus auf die Proliferation und Migration konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Die Zellproben mit Wildtyp p53 migrierten stärker, wohingegen die Zellprobe mit mutp53(E285K) stark proliferierte. Bei Korrelation der subzellulären Caspase-8-Lokalisation mit der Caspase-8- und p53-Expression der Melanomzellproben mithilfe Westernblotanalysen zeigte sich, dass metastatische Zellproben verstärkt Caspase-8 exprimieren. Dies betraf besonders die metastatischen Zellproben mit nukleär lokalisierter Caspase-8, die kein p53 oder wenig Wildtyp p53 exprimieren. Diese inverse Korrelation der Caspase-8- und p53 Expression konnte ebenfalls bei den unstimulierten Zellproben mit zytoplasmatischer Caspase-8 festgestellt werden. Zellprobe M31 mit mutp53(E285K) exprimiert konstant stark p53 und wies Chemoresistenz auf. Bei Untersuchung des Zelltods 24 h und 48 h nach Cisplatinstimulation, sowie 48 h nach Stimulation mit Dabrafenib, Trametinib und deren Kombination mithilfe des IncuCyte® Readers, wurde deutlich, dass die Zellproben mit nukleär lokalisierter Caspase-8 chemoresistenter sind als die restlichen Zellproben, wobei die Zellproben mit diffus lokalisierter Caspase-8 am resistentesten gegenüber den zielgerichteten Therapeutika sind. Die protektive Rolle der diffusen Caspase-8 für die Tumorzellen konnte unterstützend durch die Zunahme der Apoptose bei einigen Zellproben nach Herunterregulierung von Caspase-8 nachgewiesen werden. Hervorzuheben ist, dass die Zellproben mit zytoplasmatischer Caspase-8 am sensitivsten, sowohl auf zielgerichtete Therapeutika als auch auf Chemotherapie reagierten. Insgesamt induzierte Cisplatin deutlich mehr Zelltod als die zielgerichteten Therapien, weshalb die potenzielle Überlegenheit der Chemotherapie, besonders bei rezidivierten Melanomen bedacht werden muss. Es bestätigte sich ebenfalls die Relevanz des BRAF-/NRAS Mutationsstatus für die Therapiesensitivität, wobei BRAF-mutierte Zellproben die größte Chemosensitivität präsentierten und NRAS-mutierte Zellproben vor allem nach der Stimulation mit Trametinib und der Kombination Dabrafenib + Trametinib Zelltod aufwiesen. Überraschenderweise zeigten sich die Zellproben vortherapierter Melanompatienten sensitiver gegenüber Dabrafenib und Cisplatin als die Zellproben therapienaiver Melanompatienten, was die Bedeutung von Chemotherapie und Dabrafenib für vortherapierte, rezidivierte Tumore bzw. Metastasen hervorhebt. Weiterhin konnte der Impact des p53-Mutationsstatus herausgearbeitet werden. Die Zellproben mit mutiertem oder ohne p53 wiesen die größte Cisplatinresistenz auf, wohingegen die Zellproben mit Wildtyp p53 am meisten Zelltod zeigten, gefolgt von den Zellproben mit dem Einzelnukleotidpolymorphismus (wt(P72R)). Nach Herunterregulierung des mutierten p53 nahm die Apoptose nach Cisplatinstimulation hoch signifikant zu. Dahingegen zeigten besonders die Zellproben mit zytoplasmatischer Caspase-8 und Wildtyp p53 eine Hochregulierung von p53 nach Cisplatinstimulation im Westernblot. Wir konnten nachweisen, dass die Wildtyp p53 exprimierende Zellprobe M40 nukleär lokalisierte Caspase-8 aufweist und die stärkste Chemoresistenz zeigte, wohingegen die Zellproben mit diffus oder zytoplasmatisch lokalisierter Caspase-8, die Wildtyp p53 oder den Einzelnukleotidpolymorphismus (wt(P72R)) exprimieren, am chemosensitivsten waren. Die Therapieresponsivität von Melanomen wird durch eine Vielzahl an Faktoren beeinflusst, die für die optimale Behandlung der Patienten bei Beginn einer Therapie möglichst genau bestimmt werden sollten. Wir empfehlen für die Risikostratefizierung und Prognose des Krankheitsverlaufes, sowie für die Entscheidung des Therapiewegs, die Bestimmung der subzellulären Caspase-8-Lokalisation in Kombination mit dem p53-Mutationsstatus. Weiterhin weisen wir auf die Bedeutung des BRAF-/NRAS-Mutationsstatus sowie mögliche Vortherapien in Bezug auf Therapieresistenz hin und stellen die Bedeutung der Chemotherapie, besonders für rezidivierte, BRAF-mutierte Melanompatienten bei Resistenzentwicklung gegen BRAF- und/oder MEK-Inhibitoren heraus. / Malignant melanoma is responsible for 90 % of skin cancer deaths (Garbe et al., 2022). Various mutations affect the signaling pathways and promote carcinogenesis, which leads to a constant change in melanoma therapy. In addition to surgical therapy, which is curative in the early stages, targeted therapy with BRAF and MEK inhibitors has achieved resounding successes for the overall survival of patients in recent years while chemotherapy is still recommended for non-resectable metastases. Increasing therapy resistance limits melanoma therapy, with Müller et al. (2020) pointing to wild-type p53-expressing tumor cells that use the expression of nuclear caspase-8 to bypass the G2/M cell cycle arrest and thus promote the proliferation and expansion of degenerated tumor cells. By investigating 16 melanoma cell samples differing in their BRAF/NRAS and p53 mutation status, as well as in their prior clinical therapies, the potential clinical relevance of nuclear caspase-8 could be elaborated. We were able to confirm that nuclear localized caspase-8 in wild-type p53-expressing tumor cells leads to chemoresistance and, to a lesser extent, to resistance to targeted therapies. First, the subcellular localization of caspase-8 in the existing 16 melanoma cell samples was determined using immunocytochemical staining, which revealed that the melanoma cell samples with nuclear caspase-8 all originated from metastases. The high metastatic potential of these cell samples was further emphasized by the fact that the melanoma cell samples with nuclear localized caspase-8 showed the strongest migration. In contrast, they presented the lowest proliferation, underlining the direct correlation between migratory and proliferative properties in tumor cells. Likewise, BRAF-mutated cell samples showed the strongest migration and verified that melanoma patients with BRAF mutations develop metastases earlier. In contrast, the cell samples with diffusely localized caspase-8 showed the strongest growth, which illustrates the relevance of diffusely localized caspase-8 in its protective function in tumor cells. The impact of the p53 mutation status on proliferation and migration could also be demonstrated. The cell samples with wild-type p53 migrated stronger, whereas the cell samples with mutp53(E285K) showed stronger proliferation. Correlation of subcellular caspase-8 localization with caspase-8 and p53 expression of melanoma cell samples using western blot analysis showed that metastatic cell samples express more caspase-8. This was particularly true for the metastatic cell samples with nuclearly localized caspase-8, which express little wild-type p53 or no p53. This inverse correlation of caspase-8 and p53 expression was also observed in the unstimulated cell samples with cytoplasmically localized caspase-8, respectively. Cell sample M31 with mutp53(E285K) consistently expressed high levels of p53 and exhibited chemoresistance. When examining cell death 24 h and 48 h after cisplatin stimulation, as well as 48 h after stimulation with dabrafenib, trametinib and their combination using the IncuCyte® Reader, it became clear that the cell samples with nuclearly localized caspase-8 are the most chemoresistant, whereby the cell samples with diffusely localized caspase-8 are the most resistant to the targeted therapeutics. The protective role of diffusely localized caspase-8 for the tumor cells was supportively demonstrated by the increase in apoptosis in some cell samples after downregulation of caspase-8. It should be emphasized that the cell samples with cytoplasmically localized caspase-8 responded most sensitively to both targeted therapies and chemotherapy. Overall, cisplatin induced significantly more cell death than the targeted therapies, which is why the potential superiority of chemotherapy, especially in recurrent melanoma, must be considered. The relevance of BRAF/NRAS mutation status for therapy sensitivity was also confirmed, with BRAF-mutated cell samples presenting the greatest chemosensitivity and NRAS-mutated cell samples showing cell death particularly after stimulation with trametinib and the combination dabrafenib + trametinib. Surprisingly, the cell samples of pre-treated melanoma patients were more sensitive to dabrafenib and cisplatin than the cell samples of treatment-naive melanoma patients, which highlights the importance of chemotherapy and dabrafenib for pre-treated, recurrent tumors and metastases. Furthermore, the impact of the p53 mutation status could be worked out. The cell samples with mutated or no p53 showed the highest cisplatin resistance, whereas the cell samples with wild-type p53 showed the highest cell death, followed by the cell samples with the single nucleotide polymorphism (wt(P72R)). After downregulation of mutant p53, apoptosis increased highly significantly after cisplatin stimulation. In contrast, especially the cell samples with cytoplasmically localized caspase-8 and wild-type p53 showed an upregulation of p53 in the Western blot after cisplatin stimulation. We demonstrated that wild-type p53 and nuclear caspase-8 expressing cell sample M40 exhibited the strongest chemoresistance, whereas the cell samples with diffusely or cytoplasmically localized caspase-8 expressing wild-type p53 or the single nucleotide polymorphism (wt(P72R)) were the most chemosensitive. In summary, it is clear that the treatment response of melanoma is influenced by a variety of factors that should be determined as precisely as possible for the optimal treatment of patients at the start of therapy. We recommend the determination of subcellular caspase-8 localization in combination with the p53 mutation status for risk stratification and prognosis of disease progression, as well as for the optimal therapy. Furthermore, we point out the importance of BRAF/NRAS mutation status and possible prior therapies with regard to therapy resistance and emphasize the importance of chemotherapy, especially for relapsed, BRAF-mutated melanoma patients who developed resistance to BRAF and/or MEK inhibitors.

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