Mikrotubuli sind filamentöse intrazelluläre Polymere, die als grundlegende Bestandteile subzellulärer Strukturen in Eukaryoten dienen. Diese Studie verwendet einen vergleichenden Ansatz, um zu untersuchen, wie sich die intrinsischen dynamischen und biochemischen Eigenschaften von Tubulin zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden, und zeigt ihre Konsequenzen in zwei verschiedenen physiologischen Kontexten: 1) Bestimmung der Spindelgröße bei Fröschen der Gattung Xenopus und 2) Spezifität von Mikrotubuli-Inhibitoren für Plasmodium falciparum-Mikrotubuli über denen ihres menschlichen Wirts. In den Eiern der Froschgattung Xenopus wird die Länge der meiotischen Spindel biochemisch festgelegt und erreicht unabhängig von räumlichen Einschränkungen eine Obergrenze. Messungen der Dynamik von Xenopus-Mikrotubuli zeigen, dass X. laevis-Mikrotubuli sowohl schneller wachsen als auch länger leben als die von X. tropicalis. Darüber hinaus spielt die Quantifizierung der Länge und Massenverteilung der Xenopus-Mikrotubuli zusammen mit den Reaktionen der Eiextrakt-Spindelanordnung eine Rolle für die intrinsische Dynamik der Mikrotubuli bei der Modulation der Spindellänge. Mikrotubuli sind auch Wirkstofftargets bei Pilz- und parasitären Helmintheninfektionen und haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit als potenzielles Wirkstoffziel beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum auf sich gezogen. Um die Dynamik und Medikamentspezifität von Mikrotubuli von P. falciparum zu charakterisieren, haben wir Tubulin direkt von den Parasiten gereinigt. Zum ersten Mal wurden hier dynamische P. falciparum-Mikrotubuli in vitro rekonstituiert und eine parasitenspezifische Unterdrückung der Dynamik von Mikrotubuli durch Oryzalin und Amiprofos-Methyl direkt nachgewiesen. Diese Studie legt einen experimentellen Rahmen fest, um direkt auf parasitenspezifische Hemmung von Mikrotubuli zu testen, die bisher unter Verwendung bestehender in-vitro-Ansätze nicht beobachtet wurden. / Microtubules are filamentous intracellular polymers that are fundamental components of subcellular structures including the spindle, the cytoskeleton, and flagella in eukaryotes. This study uses a comparative approach to investigate how the intrinsic dynamic and biochemical characteristics of tubulin vary between species and demonstrates their consequences in two different physiological contexts: 1) Spindle size control in Xenopus frogs, and 2) The specificity of microtubule inhibitors for Plasmodium falciparum microtubules over those of their human host. In Xenopus frog eggs, the length of the spindle is biochemically controlled and reaches an upper limit independent of spatial constraints. In this study, in vitro measurements of Xenopus microtubule dynamics show that X. laevis microtubules are both faster-growing and longer-lived X. tropicalis, independent of the influence of microtubule-associated proteins. Furthermore, quantification of Xenopus microtubule length and mass distributions, combined with egg extract spindle assembly reactions, establishes a role for intrinsic microtubule dynamics in modulating spindle length. Microtubules are also established drug targets in fungal and parasitic helminth infections and have in the past decades drawn attention as a potential drug target in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In order to characterize P. falciparum microtubule dynamics, structure, and drug specificity, we have used an affinity chromatography-based approach to purify tubulin directly from blood-stage parasites. For the first time, dynamic P. falciparum microtubules have been reconstituted in vitro and parasite-specific suppression of microtubule dynamics by oryzalin and amiprofos methyl has been directly demonstrated. This study establishes an experimental framework to directly test for parasite-specific microtubule inhibition, microtubule structure, and interactions with MAPs that previously have not observed using existing in vitro approaches.

Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. / Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

Malaria ist noch immer die häufigste parasitäre Erkrankung in den Tropen. Vor allem afrikanische Kinder < 5 Jahren sind betroffen. Die steigende Chloroquinresistenz ist für einen deutlichen Anstieg der Kindersterblichkeit verantwortlich. Mehrere Studien belegen, dass die Kombination von Chloroquin (CQ) mit Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP) in Afrika bei niedriggradiger CQ-Resistenz die therapeutische Wirksamkeit erhöht und damit auch die Resistenzentwicklung gegenüber beiden Medikamenten verzögern kann. Bei 315 Kindern im Alter von 6-59 Monaten wurde von Nov. 2000 bis Nov. 2001 eine Studie zur Epidemiologie der Malaria und zum Therapieausgang von CQ und SP in Tamale/Nord-Ghana durchgeführt. Bei Vorliegen einer Malaria wurde mit CQ und SP behandelt und der Therapieausgang gemäß eines modifizierten WHO-Protokolls von 1996 ermittelt. Die Gesamtzahl der Malaria-Episoden im Zeitraum betrug 836. In der Regenzeit erkrankte mit 23,7% ein signifikant höherer Anteil der Kinder an Malaria als in der Trockenzeit mit 9,4%. Ein frühes Therapieversagen (ETF) wurde in 5% der Fälle beobachtet, ein spätes Therapieversagen (LTF) in 19,5% der Fälle. 211 Fälle (68,7%) hatten einen klinischen Therapieerfolg (ACR). Alter < 3 Jahren war ein unabhängiger Einflussfaktor für ETF und Gesamttherapieversagen. Eine hohe Parasitendichte war ein unabhängiger Einflussfaktor für LTF und Gesamttherapieversagen. Das Risiko, ein Gesamttherapieversagen (ETF + LTF) zu entwickeln, war in der Regenzeit um das 6-fache gegenüber der Trockenzeit erhöht. Bei allen erstmalig mit CQ und SP behandelten Fällen (n = 206) war der ACR (72,3%) statistisch grenzwertig höher als bei zweiter oder mehrfacher Behandlung (61,4%; n = 101). Bei den mehrfach therapierten Fällen bestand mit 27% gegenüber 16% bei den erstmalig therapierten Fällen ein signifikant höheres Risiko, ein LTF zu entwickeln. Die Erholung des Hb-Gehalts bei den erfolgreich therapierten Fällen betrug 0,6 g/dl und unterschied sich signifikant vom Hb-Anstieg (0,4 g/dl) bei Fällen mit LTF. Ein Vergleich des ACR der beschriebenen Studie mit einer zuvor durchgeführten CQ-Studie ergab keinen signifikanten Unterschied. Die Ergebnisse dieser Studie legen die Schlussfolgerung nahe, dass sich die Therapie aus CQ und SP wegen der hohen CQ-Resistenz und der sich rasch entwickelnden SP-Resistenz zumindest in Nordghana nicht eignet. / Malaria remains the most frequent parasite disease in the tropics. Especially African children under 5 years are at risk. The rising chloroquine resistance is the cause for a significant increase in childhood mortality. Several studies indicate that the combination of chloroquin (CQ) and sulfadoxine-pyrimethamine (SP) in Africa with low-grade CQ resistance increases the therapeutic efficacy and can thus slow down the development of resistance to both drugs. The epidemiology of malaria and the therapeutic outcome of CQ and SP was assessed in a cohort study of 315 children aged 6-59 months from November 2000-November 2001 in Tamale/Northern Ghana. In the case of malaria a combination therapy of CQ and SP was given and the therapeutic outcome was assessed in a modified WHO protocol. The total number of all malaria episodes in the observation period was 836. In the rainy season, the amount of the children with malaria was significantly higher than in the dry season (23,7% vs. 9,4%). Early treatment failure (ETF) was observed in 5% of the cases and late treatment failure (LTF) in 19,5%. 211 cases (68,7%) fulfilled the criteria for adequate clinical response (ACR). Age under 3 years was an independent predictor for ETF and overall therapeutic failure. High initial parasite density was an independent predictor for LTF and overall therapeutic failure. The risk of developing an overall therapeutic failure (ETF + LTF) was 6 times greater in the rainy season than in the dry sason. In all cases with the first treatment of CQ and SP (n = 206), the percentage of ACR (72,3%) was significantly greater than in cases treated twice or more (61,4%, n = 101). Cases with 2 or more treatments were at a significantly higher risk of developing a LTF than cases with one treatment (27% vs. 16%). The recovery of the hb levels in cases with successful treatment was 0,6 g/dl and was significantly different from the haemoglobin increase in cases with LTF. A comparison between the therapeutic success of CQ and SP with CQ alone did not show a significant difference. The results of this study indicate that the combination therapy of CQ and SP is no longer useful for treatment of uncomplicated malaria in Northern Ghana because of the high CQ resistance and the increasing resistance of SP.

Malariakontrolle ist von Resistenzen gegen Malariamedikamente wie Chloroquin (CQ) und Artemisininderivaten (ART) bedroht. Hier untersuchten wir das Ausmaß dieser Resistenzen in Fünf Feldstudien in Nigeria, Ruanda und Südwestindien unter Beurteilung der Prävalenzen Arzneimittelresistenz-assoziierter Mutation der Plasmodium-Parasiten (P. falciparum: K13, dhps, dhfr, mdr1 und P. vivax: mdr1) z.T. in Korrelation mit klinischen Patientendaten und ex-vivo Überlebensraten (ÜLR) unter Zugabe von ART. K13 wurde in 360 zwischen 2010-2018 gesammelte ruandischen P. falciparum Isolaten genotypisiert. Erstmals fanden wir dort niedrige Frequenzen der mit ART-Resistenz assoziierten K13-Mutation. Jedoch lassen Mutation mit niedrigen ÜLR, sowie ein Isolat mit hohen ÜLR aber ohne K13-Mutation eines Patienten der die Infektion unter Therapie nicht eliminieren konnte, Fragen offen. Ca.100 indische P. falciparum und P. vivax Isolaten aus 2015 wurden auf Mutationen in P. falciparum Markern für die Resistenz gegen Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP) (d.h. pfdhps/pfdhfr), Artesunat (AS) (d.h. K13) und Lumefantrin (d.h. pfmdr1) sowie P. vivax Marker für CQ-Resistenz (pvmdr1) untersucht. Der Großteil der Isolate zeigt Mutationen die SP-Resistenz hervorrufen, daher könnte die Effizienz der AS+SP-Therapie begrenzen sein. Außerdem eignet sich Lumefantrin nicht als alternatives Medikament auf Grund der beobachteten Dominanz des pfmdr1-Haplotyps „NFD“. Die Abwesenheit der pvmdr1-Mutation Y976F und erfolgreiche Behandlungen zeigen, die Wirksamkeit von CQ gegen vivax Malaria im Studiengebiet. Auch Isolate von nigerianischen Schwangeren mit asymptomatischer P. falciparum Infektion zeigten hohe Prävalenzen von pfdhfr/pfdhps Vier- und Fünffachmutanten darum ist die Wirksamkeit der präventiver Therapie Schwangerer mit SP in Nigeria ernsthaft gefährdet. Die Daten spiegeln die Häufigkeit der Resistenzen gegen Malariamittel in diesen Gebieten wieder mit großen Unterschieden zwischen Regionen und Medikamenten. / The spread of resistance to antimalarial drugs such as chloroquine (CQ) and artemisinins (ART) is a great threat to malaria control. Here, we investigated the extent of such resistance in Nigeria, Rwanda and south-western India. We assessed the prevalence of mutations in few Plasmodium parasites’ markers of resistance, namely P. falciparum genes K13 (ART), pfdhps/pfdhfr (sulfadoxine-pyrimethamine, SP) and pfmdr1 (lumefantrine) as well as P. vivax gene pvmdr1 (CQ) in 5 field studies conducted in 2010-2018, and partially correlated the results to patients’ clinical outcome. Few isolates from Rwanda, were also evaluated for their parasite ex vivo survival rates (SR) upon exposure to ART. We tracked ART resistance in Rwanda by genotyping K13 in 360 P. falciparum isolates from 2010-2018. We showed for the first time that K13 mutations associated with ART resistance are present here, thus in Africa, at a low frequency. However, mutations occurred in patients who recovered and/or had low SR. Of note, one patient with high SR but no K13 mutation was still parasitemic after ART treatment. Moreover, we assessed the presence of mutations in K13, pfdhps/pfdhfr, pfmdr1 and pvmdr1 in ca 100 P. falciparum and 100 P. vivax isolates from south-western India. Most of P. falciparum isolates carried pfdhfr/pfdhps mutations conferring SP resistance, menacing the efficacy of SP-ART treatment. Also, the high prevalence of pfmdr1 haplotype “NFD” advised against the introduction of lumefantrine. The low rates of P. vivax pvmdr1 Y976F and patients’ successful parasite clearance, indicated that CQ remains effective in the area. Finally, a high rate of pfdhfr/pfdhps quadruple and quintuple mutant was observed in Nigerian pregnant women with asymptomatic P. falciparum infection, hence the effectiveness of preventive treatment with SP in pregnancy might be threatened. The data reflected the abundance of antimalarials resistance in these areas with important differences between regions and drugs.

Malaria ist die Erkrankung, die durch Infektion eines Säugetiers mit dem eukaryotischen Parasiten Plasmodium entsteht. Die Symptome dieser Erkrankungen reichen von Fieber und Gelenkschmerzen bis zu schweren Organschäden in Hirn, Lunge, Niere und Leber bei einem geringen Teil der Erkrankten. Diese klinischen Symptome treten nur auf, während der Parasit sich asexuell in roten Blutzellen vermehrt. Die Zerstörung von Erythrozyten und die daraus resultierende Freisetzung von Zytokinen sind die Verursacher der malariatypischen wiederkehrenden Fieberzyklen. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Gewebsschäden führt, ist hingegen nur unzureichend bekannt. Eine notwendige Bedingung für das Auftreten von Gewebeschäden ist, dass infizierte rote Blutzellen an das Endothel der Mikrovaskulatur bin. Die Schwere der Erkrankung ist direkt mit dem extrazellulären Auftreten von Stoffen verbunden, die normalerweise von neutrophilen Granulozyten im Zellinnern gespeichert werden. Neutrophile sind dafür bekannt sind, ein ganzes Arsenal an Waffen bereitwillig durch Degranulierung oder programmierten Zelltod einzusetzen. In dieser Studie berichten wir von einem direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem aktiven inflammatorischen Zelltod (NETose) von Neutrophilen und der Entstehung von Organschäden bei einer Plasmodium-Infektion. Wir zeigen, dass NETs in Zirkulation freigesetzt und von extrazellulären DNase verdaut werden. Dadurch werden systemisch Aktivierungssignale für eine weitere Immunantwort zur Verfügung gestellt und es kommt zur Freisetzung von Zytokinen, Notfallgranulopoese und der Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmarkern auf Endothelzellen. Dies erlaubt das Binden von infizierten Erythrozyten und Immunzellen an die Mikrovaskulatur bestimmter Organe. Wir zeigen außerdem, dass eine Intervention mit der Entstehung von NETs oder der Freisetzung neuer Neutrophiler diesen Prozess unterbindet und einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz darstellt. / Malaria is the disease caused by an infection of a mammalian host by the mosquito borne eukaryotic parasite Plasmodium. The symptoms of the disease are diverse, ranging from fever and rigor in most patients to severe damage in solid organs such as brain, lung, kidney and liver in a small fraction of the afflicted. Clinical symptoms of the disease only occur when the parasite undergoes asexual replication within the red blood cells of the host. Destruction of these cells and subsequent release of cytokines are responsible for the recurring fever cycles of mild malaria. The mechanism underlying the occurrence of tissue damage however, remain mostly elusive. The adhesion of infected red blood cells to the endothelial wall of the microvasculature in the affected organs is a necessary requirement and pathology is associated with the activation of specific immune cells residing within the blood stream. Severity of disease is linked to extracellular accumulation of neutrophil proteins. Neutrophils are abundant white blood cells, known to readily deploy an arsenal of weaponry either by degranulation or by externalization of chromatin. In this study we report a direct causal relationship between the active inflammatory neutrophil cell death (NETosis) and the development of organ damage during a Plasmodium infection. We show that NETs are released in circulation, digested by extracellular DNase and thereby supply immune activation signals that drive inflammation. The systemic dissemination of these factors leads to the release of cytokines, emergency granulopoiesis and upregulation of cellular adhesion markers on endothelial cells thereby allowing for the binding of both infected red blood cells and immune cells to the microvasculature of specific organs. Furthermore we supply evidence, that repression of NETosis or inhibition of granulopoiesis abrogate these processes and present promising therapeutic strategies.

Bisher gibt es keine effektive Impfung gegen Malaria und der beste immunologische Schutz wird durch wiederholte intravenöse Injektion von nicht-vermehrungsfähigen Sporozoiten erreicht. Im Gegensatz dazu bietet die Infektion im Blutstadium nur eine Teilimmunität gegen schwere Verläufe der Krankheit. Um beide Prozesse besser zu verstehen, ist eine tiefgehende Untersuchung der Reaktion des angeborenen Immunsystems auf Sporozoiten, sowie Parasiten im Blutstadium erforderlich. Erkenntnisse hieraus können dabei helfen, die Überlegenheit des Sporozoiten-Impfstoffs zu verstehen und, letztendlich, seine Wirksamkeit in einem sichereren, kostengünstigeren und skalierbaren Impfstoff zu rekapitulieren. Um sterile Sporozoiten aus Mückenprärationen für in-vitro experimente zu gewinnen, wurden die Parasiten FACS sortiert und anschließend mit Makrophagen co-kultivert. RNA Sequenzierung der Makrophagen, zeigte ein von Sporozoiten induziertes Expressionsprofil, das durch die Expression von inflammatorischen Genen gekennzeichnet ist. Insbesondere CD201 wurde auf Makrophagen stark hochreguliert und könnte eine Rolle bei der gamma-delta T-Zell-Aktivierung spielen. Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die Aktivierung von Makrophagen durch Sporozoiten teilweise von TLR2 und MyD88 abhängig ist. Interessanterweise waren die genetischen Signaturen „Reaktion auf Verwundung" und „Makroautophagie" in Makrophagen überrepräsentiert die mit Sporozoiten co-kultiviert wurden und sind wahrscheinlich Folgen von aktiver Sporozoiten-Traversierung durch Makrophagen. In der Tat zeigten Mäuse, die mit Traversierungs-defizienten Sporozoiten geimpft wurden stark reduzierte CD8 T-Zell Antworten. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der Zelltraversion bei der Induktion effektiver adaptiver Immunantworten hin. Insgesamt tragen diese Ergebnisse zu dem Verständnis der angeborenen Immunantwort auf Plasmodium-Parasiten bei und bieten weitere Möglichkeiten zur zukünftigen Forschung. / Effective vaccination against malaria remains a critical element in the effort to eradicate the disease. So far, best protection is induced by repeated intravenous injection of irradiated, non-replicating sporozoites. In contrast, blood stage infection only affords semi-immunity after several disease episodes are endured. Therefore, in-depth analyses of innate immune responses to sporozoite and blood stage parasites are needed to understand the superiority of the attenuated sporozoite vaccine and ultimately, to recapitulate its efficacy in a safer, cheaper and more practical vaccine. To probe sporozoite-induced innate cell activation, parasites were flow sorted from salivary gland extracts. In a reductionist system, sorted P. berghei sporozoites were co-cultured with primary mouse macrophages. Transcriptomic analysis of sporozoite-experienced macrophages revealed a distinct expression profile characterized by NF-κB driven expression of inflammatory mediators. In particular, CD201, a CD1d-like transmembrane receptor with lipid presentation capabilities, was strongly upregulated on macrophages and might play a role in gamma-delta T-cell activation. In addition, first evidence is provided that macrophage activation by sporozoites is partly dependent on TLR2 and MyD88. Intriguingly, ‘response to wounding’ and ‘macroautophagy’ signatures were enriched in sporozoite-stimulated macrophages and are likely consequences of active sporozoite traversal through innate cells. Indeed, in vivo vaccination with spect1 knockout sporozoites, which are deficient in cell traversal, induced a defective CD8 T-cell response, showcasing a potential role for cell traversal in the induction of effective adaptive responses. Taken together, these findings open up several interesting avenues for future research which will paint a clearer picture of innate immune responses to Plasmodium parasites.