Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. / Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

Malaria ist die Erkrankung, die durch Infektion eines Säugetiers mit dem eukaryotischen Parasiten Plasmodium entsteht. Die Symptome dieser Erkrankungen reichen von Fieber und Gelenkschmerzen bis zu schweren Organschäden in Hirn, Lunge, Niere und Leber bei einem geringen Teil der Erkrankten. Diese klinischen Symptome treten nur auf, während der Parasit sich asexuell in roten Blutzellen vermehrt. Die Zerstörung von Erythrozyten und die daraus resultierende Freisetzung von Zytokinen sind die Verursacher der malariatypischen wiederkehrenden Fieberzyklen. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Gewebsschäden führt, ist hingegen nur unzureichend bekannt. Eine notwendige Bedingung für das Auftreten von Gewebeschäden ist, dass infizierte rote Blutzellen an das Endothel der Mikrovaskulatur bin. Die Schwere der Erkrankung ist direkt mit dem extrazellulären Auftreten von Stoffen verbunden, die normalerweise von neutrophilen Granulozyten im Zellinnern gespeichert werden. Neutrophile sind dafür bekannt sind, ein ganzes Arsenal an Waffen bereitwillig durch Degranulierung oder programmierten Zelltod einzusetzen. In dieser Studie berichten wir von einem direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem aktiven inflammatorischen Zelltod (NETose) von Neutrophilen und der Entstehung von Organschäden bei einer Plasmodium-Infektion. Wir zeigen, dass NETs in Zirkulation freigesetzt und von extrazellulären DNase verdaut werden. Dadurch werden systemisch Aktivierungssignale für eine weitere Immunantwort zur Verfügung gestellt und es kommt zur Freisetzung von Zytokinen, Notfallgranulopoese und der Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmarkern auf Endothelzellen. Dies erlaubt das Binden von infizierten Erythrozyten und Immunzellen an die Mikrovaskulatur bestimmter Organe. Wir zeigen außerdem, dass eine Intervention mit der Entstehung von NETs oder der Freisetzung neuer Neutrophiler diesen Prozess unterbindet und einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz darstellt. / Malaria is the disease caused by an infection of a mammalian host by the mosquito borne eukaryotic parasite Plasmodium. The symptoms of the disease are diverse, ranging from fever and rigor in most patients to severe damage in solid organs such as brain, lung, kidney and liver in a small fraction of the afflicted. Clinical symptoms of the disease only occur when the parasite undergoes asexual replication within the red blood cells of the host. Destruction of these cells and subsequent release of cytokines are responsible for the recurring fever cycles of mild malaria. The mechanism underlying the occurrence of tissue damage however, remain mostly elusive. The adhesion of infected red blood cells to the endothelial wall of the microvasculature in the affected organs is a necessary requirement and pathology is associated with the activation of specific immune cells residing within the blood stream. Severity of disease is linked to extracellular accumulation of neutrophil proteins. Neutrophils are abundant white blood cells, known to readily deploy an arsenal of weaponry either by degranulation or by externalization of chromatin. In this study we report a direct causal relationship between the active inflammatory neutrophil cell death (NETosis) and the development of organ damage during a Plasmodium infection. We show that NETs are released in circulation, digested by extracellular DNase and thereby supply immune activation signals that drive inflammation. The systemic dissemination of these factors leads to the release of cytokines, emergency granulopoiesis and upregulation of cellular adhesion markers on endothelial cells thereby allowing for the binding of both infected red blood cells and immune cells to the microvasculature of specific organs. Furthermore we supply evidence, that repression of NETosis or inhibition of granulopoiesis abrogate these processes and present promising therapeutic strategies.

Ein Kennzeichen der Plasmodium-Infektion ist die Induktion von strukturellen Veränderungen der Membranen der Wirtszelle. Die Parasiten bilden sich Membranstrukturen im Zytoplasma der Wirtszelle aus. Die Maurersche Fleckung ist einer der am besten charakterisierten Struktur von Plasmodium falciparum, die für den Transport von Virulenzfaktoren an die Oberfläche der infizierten Erythrozytenmembran wichtig ist. Plasmodium berghei, eine Nagetier-infizierende Spezies, bildet ähnliche Strukturen aus, die als intra-erythrozytäre P. berghei induzierte Strukturen (IBIS) bezeichnet werden. In beiden Strukturen können Proteine gefunden werden, die für die Sequestrierung von infizierten roten Blutkörperchen innerhalb des Wirts verantwortlich sind. Zwei P. berghei Proteine, IPIS2 und IPIS3, sind im Leber- und Blutstadium der Infektion präsent. Im Blutstadium werden sie in die IBIS-Kompartimente exportiert. Das speziesübergreifende Vorkommen von IPIS2 und IPIS3 deutet darauf hin, dass sie konservierte Funktionen haben könnten, die für das intrazelluläre Wachstum von Plasmodium wichtig sind. Diese Arbeit beschreibt Rollen für beide Proteine an der Wirts-Parasit Schnittstelle während der Infektion. Um einen Einblick in die induzierten Veränderungen zu erhalten, wurde die Infektion von P. berghei in Abwesenheit von IPIS2 beziehungsweise IPIS3 charakterisiert. Darüber hinaus interessierte uns auch, wie sich die Orthologe von IPIS2- und IPIS3 in den Blutstadien von P. knowlesi verhalten. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, dass die Deletion von entweder IPIS2 oder IPIS3 zu leicht reduzierten Wachstumsraten der Parasiten im Blut infizierter Tiere führte und die Anzahl der zirkulierenden Schizonten im peripheren Blut erhöhte, während das Leberstadium unbeeinflusst blieb. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass IPIS2 und IPIS3 für den Wirtszell-Umbau erforderlich sind, der für die effiziente Sequestrierung von infizierten Erythrozyten aus dem Blutkreislauf verantwortlich ist. / One characteristic of Plasmodium infection is the induction of structural changes in the membranes of the host cell. The parasites form membrane structures in the cytoplasm of the host cell. Maurer's clefts are one of the best characterised structures of Plasmodium falciparum, which are important for the transport of virulence factors to the surface of the infected erythrocyte membrane. Plasmodium berghei, a rodent-infecting species, forms similar structures called intra-erythrocyte P. berghei induced structures (IBIS). In both structures, proteins can be found that are responsible for sequestering infected red blood cells within the host. Two P. berghei proteins, IPIS2 and IPIS3, are present in the liver and blood stages of infection. In the blood stage, they are exported to the IBIS compartments. The cross-species presence of IPIS2 and IPIS3 suggests that they may have conserved functions important for Plasmodium intracellular growth. This work describes roles for both proteins at the host-parasite interface during infection. To gain insight into the induced changes, infection of P. berghei was characterized in the absence of IPIS2 and IPIS3, respectively. Furthermore, we were also interested in how the orthologues of IPIS2- and IPIS3 behave in the blood stages of P. knowlesi. Furthermore, this work shows that deletion of either IPIS2 or IPIS3 resulted in slightly reduced parasite growth rates in the blood of infected animals and increased the number of circulating schizonts in the peripheral blood, while the liver stage was unaffected. Taken together, these data suggest that IPIS2 and IPIS3 are required for host cell remodeling, which is responsible for the efficient sequestration of infected erythrocytes from the bloodstream.

Die Infektionskrankheit Malaria wird von einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht und stellt vor allem im südlichen Afrika eine große Herausforderung dar. Die Zellen der Parasiten enthalten zwei endosymbiontische Organellen, den Apicoplast und das Mitochondrium. Beide Organellen besitzen ein reduziertes Genom. Die Struktur des mitochondrialen Genoms ist ungewöhnlich. Mit nur 6 kb gehört es zu den kleinsten beschriebenen Genomen und enthält neben drei proteinkodierende Gene auch 34 kleine rRNA-Gene. Um das Genom zu exprimieren wird eine Vielzahl von kernkodierten Faktoren benötigt. Die Regulation der Expression, die Prozessierung der polycistronischen Primärtranskripte und die Regulation des RNA-Metabolismus des Mitochondriums ist jedoch weitestgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnten kurze RNAs in den Mitochondrien von P. falciparum mittels Hochdurchsatzsequenzierung identifiziert werden. Solche RNA-Akkumulationen an Transkriptenden werden in den Organellen höherer Pflanzen durch PPR-Proteine (Pentatricopeptide repeat) verursacht. Um zu untersuchen, ob in P. falciparum PPR-ähnliche, helikale Proteine vorhanden sind, wurde genomweit nach Proteinen mit repetitiven, helikalen Elementen gesucht. Dabei konnte eine vorher unbekannte Proteinfamilie identifiziert werden, die aufgrund ihrer 37 Aminosäure langen Motive Heptatricopeptide repeat Proteine (HPR) genannt wurde. In P. berghei konnte für 7 HPR-Proteine eine mitochondriale Lokalisation betätigt werden. Außerdem zeigten Deletionsversuche, dass die meisten HPR-Proteine in den Blutstadien essentiell sind. In vitro RNA-Bindestudien konnte für ein rekombinantes HPR-Protein eine unspezifische Interaktion mit mitochondrialen Transkripten nachgewiesen werden, während keine Bindung an DNA erfolgt. Eine breite Suche in verschiedenen phylogenetischen Gruppen zeigte, dass HPR-Proteine in verschiedensten eurkaryotischen Taxa vorhanden sind, mithin früh in der Evolution der eukaryotischen Zelle entstanden sind. / Malaria is caused by a single celled parasite of the genus Plasmodium. Especially in Sub-Saharan Africa, -this disease is a huge challenge for the health system. The cells of the parasites contain two organelles of endosymbiotic origin, the apicoplast and the mitochondrion. Both organelles still contain a reduced genome. For the expression of the genome, the organelles depends on a large set of nuclear encoded proteins. The mitochondrial genome has a unique structure. With only 6 kb it is one of the smallest genomes discovered to date and it contains only three protein coding genes along with 34 small ribosomal genes. The regulation of expression, the processing of the polycistronic primary transcript and the regulation of the RNA metabolism in the mitochondria of Plasmodium remains largely unknown. Through high-throughput sequencing of cellular RNA, we discovered a population of small RNAs originating in the mitochondria of P. falciparum. Similar RNA accumulations can be detected in the organelles of higher plants and are caused by helical-hairpin repeat proteins like PPR proteins (pentatricopeptide repeat). To search for plant-like RNA binding proteins similar to PPR proteins we scanned the nuclear genome of P. falciparum for helical-hairpin repeat proteins. We found a novel protein family with repetitive helical elements of 37 amino acid length we termed heptatricopeptide repeat (HPR) proteins. In the rodent Malaria parasite P. berghei, the mitochondrial localization for 7 HPR-Proteins was verified. In knockout studies, we also showed that almost all HPR proteins are essential for blood stages of P. berghei. In RNA-binding assays, one recombinant HPR protein showed unspecific interaction with mitochondrial transcripts but not with DNA. By broadening the search, we discovered that HPR proteins are found in multiple eukaryotic taxa.

Die Allele (*R1, *R2, *S1 und *S2) des A. gambiae complement-like thioester-containing Protein 1 (TEP1) bestimmen die Fitness der Mücken, welches die männlichen Fertilität und den Resistenzgrad der Mücke gegen Pathogene wie Bakterien und Malaria-Parasiten. Dieser Kompromiss zwischen Reproduktion und Immunnität hat Auswirkungen auf die Größe der Mückenpopulationen und die Rate der Malariaübertragung. Wie die genetische Diversität von TEP1 die genetische Struktur natürlicher Vektorpopulationen beeinflusst, ist noch unklar. Die Zielsetzung dieser Doktorarbeit waren: i) die biogeographische Kartographierung der TEP1 Allele und Genotypen in lokalen Malariavektorpopulationen in Mali, Burkina Faso, Kamerun, und Kenia, und ii) die Bemessung des Einflusses von TEP1 Polymorphismen auf die Entwicklung humaner P. falciparum Parasiten in der Mücke. Die Analysen der TEP1 Polymorphismen zeigten, dass die natürliche Selektion auf Exone, sowie Introne wirkt, was auf eine starke funktionale Beschränkung an diesem Lokus hindeutet. Außerdem zeigen unsere Daten die strukturierte Erhaltung natürlicher genetischer Variation im TEP1 Lokus, in welchem die Allele und Genotypen spezifische evolutionäre Wege verfolgen. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz von arten- und habitatspezifischen Selektionsdrücken hin, die auf den TEP1 Lokus wirken. Resultate haben gezeigt, dass TEP1*S1 und *S2 Mücken gleichermassen empfänglich für Plasmodium-Infektionen sind. Insgesamt tragen die Resultate der biogeographischen Kartographierung des TEP1 Lokus und der Züchtungs- und Infektionsexperimente zu einem besseren Verständnis über den Einfluss der verschiedenen Vektorarten und lokale Umwelteinflüsse auf die Vektorpopulationen und Malariaübertragung bei. Des weiteren kann die hier beschriebene hochdurchsatz-genotypisierungs Methode, zur Studie lokaler A. gambiae Mückenpopulationen, in der Feldforschungsarbeit eingesetzt werden. Dieser neue Ansatz wird die epidemiologisch relevante Überwachung und Vorhersage dynamischer Prozesse in lokalen Malariavektorpopulationen unterstützen, welche die Entwicklung neuer Strategien der Vektorkontrolle ermöglichen könnten. / The alleles (*R1, *R2, *S1 and *S2) and genotypes of A. gambiae complement-like thioester-containing protein 1 (TEP1) determine the fitness in male fertility and the degree of mosquito resistance to pathogens such as bacteria and malaria parasites. This trade-off between the reproduction and the immunity impacts directly on mosquito population abundance and malaria transmission respectively. How TEP1 genetic diversity influences the genetic structure of natural vector populations and development of human malaria parasites is unclear. The aims of this thesis were to: i) map distribution of TEP1 alleles and genotypes in local malaria vector populations in Mali, Burkina Faso, Cameroon and Kenya, and ii) assess the impact of TEP1 polymorphism on development of human P. falciparum parasites in mosquitoes. Analyses of TEP1 polymorphism revealed that natural selection acts in concert on both exons and introns, suggesting strong functional constrains acting at this locus. Moreover, our data demonstrate a structured maintenance of natural TEP1 genetic variation, where the alleles and the genotypes follow distinct evolutionary paths. These findings suggest the existence of species- and habitat-specific selection patterns that act on TEP1 locus. Results revealed that the TEP1*S1 and *S2 mosquitoes are equally susceptible to Plasmodium infections. Collectively, results of my thesis on the biogeographic TEP1 mapping, and on the breeding and infection experiments contribute to a better understanding of how the vector species and local environmental factors, shape vector population structures and malaria transmission. Furthermore, the high throughput TEP1 genotyping approach reported here could be used for field studies of local A. gambiae mosquito populations. This new approach will benefit surveilance and prediction of dynamics in local malaria vector populations that may have epidemiological significance, and therefore inform the development of novel vector control measures.