Etliche Membran Transport Proteine (MTP) sind essentiell in den Plasmodium Blutstadien, und geraten zunehmend in den Fokus der Wirkstoffentwicklung. Die physiologischen Rollen der Transporter sind jedoch oft ungeklärt. In dieser Arbeit wurden mittels experimenteller Genetik funktionelle Charakteristika der MTPs untersucht. Am Maus Parasiten Plasmodium berghei und der Plasmodium falciparum Blutstadien-Kultur wurden vier MTPs ausgewählt: ein konservierter Folat Transporter (FT2), sowie eine P. falciparum-spezifisches P-Typ ATPase und zwei essentielle MTPs (CRT und ATP4). Diese Auswahl verkörpert ein breites Spektrum an MTP Kandidaten und reflektieren zudem das Potenzial und die Grenzen funktioneller Analysen von Plasmodium MTPs mittels reverser Genetik. Für den Folat Transporter 2 (FT2) wurde eine Kombination von transgenen Strategien auf P. berghei angewandt. Durch ein endogenes tag von FT2 wurde die Lokalisierung im Apicoplast, sowie dessen Expression über fast den kompletten Zyklus hinweg gezeigt. Nach der Deletion von FT2, wiesen die Parasiten einen Defekt während der Sporulation auf. Demzufolge bilden sich nur nicht infektiöse Sporozoiten, was letztendlich zur Unterbrechung des Lebenszyklus der Parasiten führt. Eine Aminophospholipid P-Typ ATPase, wurde mittels CRISPR/Cas9 in P. falciparum genetisch deletiert und die Mutante analysiert. Im Gegensatz zu den meisten vitalen P-Typ ATPasen erweist sich das Gen in den asexuellen Blutstadien als entbehrlich. Des Weiteren bilden die MTPs ATP4 und CRT einen einflussreichen Faktor bei Malaria-Therapien. Eine umfassende Analyse von räumlichen und zeitlichen Expressionsmustern von transgenen Parasiten mit mCherry-getaggten Proteinen zeigt ein Expression der beiden MTPs über die Blutstadien hinaus, was auf zusätzliche Funktionen in den jeweiligen Stadien verweist. Diese Studie trägt, basierend auf Lokalisation, Expression und funktioneller Deletion, zur funktionellen Entschlüsselung der vier untersuchten MTPs bei. / Many membrane transport proteins (MTP) are essential for Plasmodium infection and gain importance as candidate drug targets in malaria therapy, whereas the physiological functions often remain enigmatic. In this thesis, we applied experimental genetics to determine key characteristics of four Plasmodium MTPs. We employed the murine malaria model parasite Plasmodium berghei and in vitro blood cultures of Plasmodium falciparum. We selected one conserved MTP called FT2, which was previously shown to transport folate, a P-type ATPase that is specific for P. falciparum as well as two essential MTPs, CRT and ATP4. These targets exemplify the range of druggable candidates and illustrate the potential and limitations of reverse genetics to decipher their physiological roles. A combination of transgenic and knockout strategies was applied to the P. berghei folate transporter 2 (FT2). We show that endogenously tagged FT2 localises to the apicoplast membranes, and is broadly expressed throughout the parasite’s life cycle. Analysis of FT2-deficient parasites revealed a severe sporulation defect in the vector; the vast majority of ft2– oocysts form large intracellular vesicles which displace the cytoplasm. Very few sporozoites are generated and these are non-infectious to the mammalian host, resulting in a complete arrest of Plasmodium transmission. A candidate aminophospholipid P-type ATPase, was assessed by a CRISPR/Cas9-mediated gene disruption. Compared to many vital P-type ATPases this gene is dispensable for asexual blood replication. Two MTPs, ATP4 and CRT are prime targets for antimalarial therapies. A comprehensive spatio-temporal expression analysis of transgenic parasites expressing mCherry-tagged proteins revealed expression beyond blood infection, indicative of functions in additional parasite stages. The findings of this study contribute towards a better understanding of the roles of the four MTPs based on localisation, expression and functional deletion.

Malaria ist eine Krankheit, die durch den Protozoen Plasmodium verursacht und von Anopheles Moskitos durch infektiöse Stiche übertragen wird. Diese ̈Übertragung kann durch verschiedene Interventionsstrategien blockiert werden. Eine relativ neue Strategie, die bisher nur im Labor getestet wurde, ist der Einsatz genetisch veränderter Moskitos, die den Parasiten nicht auf einen neuen menschlichen Wirt übertragen können. Ein Ansatz ist die Entwicklung von Moskitos, die mit murinen Antikoepern ausgestattet sind, die gegen relevante Oberflächenproteine des Parasiten, dem Circumsporozoite Protein (CSP) gerichtet sind. Es ist jedoch nach wie vor unklar, welches Entwicklungsstadium angegriffen werden soll und welche Antikörper für diesen Ansatz effizient sind. Hier zeige ich, dass in Stechmücken, die mit einem humanen Anti-CSP-Antikörper ausgestattet sind, die Sporogonie der Oozysten in Abhängigkeit von der Parasiten-dichte blockiert wird und somit die Sporozoitenlast in den Mücken signifikant verringern. Insbesondere Antikörper, die sich an die ’Repeat Region’ des CSP binden, können die Sporozoitenlast in der Stechmücke verringern. Des Weitern, zeigen diese Stechmücken kaum Defekte in der Entwicklung und im Überleben. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor beschriebene Bedeutung von CSP während der Sporogonie und unterstreichen die Effizienz von humanen, ’Repeat Region’ bindenden Anti-CSP-Antikörpern bei der Beeinträchtigung der Parasitenentwicklung in dem Vektor. Darüber hinaus ist in Stechmücken, die mit humanen Anti-CSP Antikörpern ausgestattet sind, die Entwicklung von Sporozoiten teils limitiert und teils komplett verhindert. Dies macht sie zu einem vielversprechenden Instrument für Maßnahmen zum Malaria Kontrolle. In dieser Arbeit habe ich weitere Einblicke in den Mechanismus , durch den Anti-CSP-Antikörper die Parasitenentwicklung in der Mücke stören, und gezeigt, dass Oozysten ein effizientes Ziel für diesen Ansatz sind. / Malaria is a disease caused by the protozoan parasite Plasmodium and transmitted by Anopheles mosquitoes trough infectious bites, these transmission events can potentially be blocked by different intervention strategies. A relatively new strategy which has been only tested in the laboratory is the use of genetically modified mosquitoes unable to transmit the parasite to a new human host. In the past, murine derived antibodies directed against relevant parasite surface proteins were used with limited success. It remains unclear which developmental stage is targeted, and which antibodies are useful. Here, I show that in mosquitoes equipped with a human derived anti-CSP repeat binding antibody, oocyst sporogony is blocked in a parasite density dependent manner. Only repeat binding antibodies could decrease sporozoite loads in the mosquito. These results confirm the previously described importance of CSP during sporogony and highlight the efficiency of human derived repeat binding anti-CSP antibodies in interfering with parasite development even in a different host. Additionally, mosquitoes equipped with human derived anti-CSP antibodies show little (in high density infections) to no (in low density infections) sporogonic development, making them a promising tool for malaria transmission blocking interventions. I provided additional insights into the mechanism by which anti-CSP antibodies interfere with parasite development in the mosquito showing that oocysts are an efficient target for this approach. Therefore, the mosquitoes used here are potentially resistant in a more natural setting. Additionally, I provided a new tool allowing a faster screening of antibodies in a mosquito context by injection of single chain Fabs into the mosquito hemolymph. Taken together, this approach could one day give rise to alternative strategies in tackling malaria transmissions.

Die Infektionskrankheit Malaria wird von einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht und stellt vor allem im südlichen Afrika eine große Herausforderung dar. Die Zellen der Parasiten enthalten zwei endosymbiontische Organellen, den Apicoplast und das Mitochondrium. Beide Organellen besitzen ein reduziertes Genom. Die Struktur des mitochondrialen Genoms ist ungewöhnlich. Mit nur 6 kb gehört es zu den kleinsten beschriebenen Genomen und enthält neben drei proteinkodierende Gene auch 34 kleine rRNA-Gene. Um das Genom zu exprimieren wird eine Vielzahl von kernkodierten Faktoren benötigt. Die Regulation der Expression, die Prozessierung der polycistronischen Primärtranskripte und die Regulation des RNA-Metabolismus des Mitochondriums ist jedoch weitestgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnten kurze RNAs in den Mitochondrien von P. falciparum mittels Hochdurchsatzsequenzierung identifiziert werden. Solche RNA-Akkumulationen an Transkriptenden werden in den Organellen höherer Pflanzen durch PPR-Proteine (Pentatricopeptide repeat) verursacht. Um zu untersuchen, ob in P. falciparum PPR-ähnliche, helikale Proteine vorhanden sind, wurde genomweit nach Proteinen mit repetitiven, helikalen Elementen gesucht. Dabei konnte eine vorher unbekannte Proteinfamilie identifiziert werden, die aufgrund ihrer 37 Aminosäure langen Motive Heptatricopeptide repeat Proteine (HPR) genannt wurde. In P. berghei konnte für 7 HPR-Proteine eine mitochondriale Lokalisation betätigt werden. Außerdem zeigten Deletionsversuche, dass die meisten HPR-Proteine in den Blutstadien essentiell sind. In vitro RNA-Bindestudien konnte für ein rekombinantes HPR-Protein eine unspezifische Interaktion mit mitochondrialen Transkripten nachgewiesen werden, während keine Bindung an DNA erfolgt. Eine breite Suche in verschiedenen phylogenetischen Gruppen zeigte, dass HPR-Proteine in verschiedensten eurkaryotischen Taxa vorhanden sind, mithin früh in der Evolution der eukaryotischen Zelle entstanden sind. / Malaria is caused by a single celled parasite of the genus Plasmodium. Especially in Sub-Saharan Africa, -this disease is a huge challenge for the health system. The cells of the parasites contain two organelles of endosymbiotic origin, the apicoplast and the mitochondrion. Both organelles still contain a reduced genome. For the expression of the genome, the organelles depends on a large set of nuclear encoded proteins. The mitochondrial genome has a unique structure. With only 6 kb it is one of the smallest genomes discovered to date and it contains only three protein coding genes along with 34 small ribosomal genes. The regulation of expression, the processing of the polycistronic primary transcript and the regulation of the RNA metabolism in the mitochondria of Plasmodium remains largely unknown. Through high-throughput sequencing of cellular RNA, we discovered a population of small RNAs originating in the mitochondria of P. falciparum. Similar RNA accumulations can be detected in the organelles of higher plants and are caused by helical-hairpin repeat proteins like PPR proteins (pentatricopeptide repeat). To search for plant-like RNA binding proteins similar to PPR proteins we scanned the nuclear genome of P. falciparum for helical-hairpin repeat proteins. We found a novel protein family with repetitive helical elements of 37 amino acid length we termed heptatricopeptide repeat (HPR) proteins. In the rodent Malaria parasite P. berghei, the mitochondrial localization for 7 HPR-Proteins was verified. In knockout studies, we also showed that almost all HPR proteins are essential for blood stages of P. berghei. In RNA-binding assays, one recombinant HPR protein showed unspecific interaction with mitochondrial transcripts but not with DNA. By broadening the search, we discovered that HPR proteins are found in multiple eukaryotic taxa.