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<p>Enterotoxigenic <italic>Escherichia coli</italic> (ETEC) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. The causative agent of traveler's diarrhea, ETEC is often associated with cholera-like disease, especially in developing countries. One major virulence factor released by ETEC is the heat-labile enterotoxin LT, which upsets the balance of electrolytes in the intestine. LT is highly similar to cholera toxin (CT) produced by <italic>Vibrio cholerae</italic>, both in structure and function. The toxin consists of a single catalytically active A subunit and a ring of five B subunits mediating its binding and secretion. Previous work from our lab has shown that, after export by the type II secretion (T2S) system, LT associates with lipopolysaccharide (LPS) on the bacterial surface. However, little is known about what identifies LT as a T2S substrate, and the portion of the toxin that mediates LPS binding has not previously been defined. Site-directed mutagenesis of residues in a peripheral sugar binding pocket of the toxin was performed, revealing mutations that affect its binding to LPS, as determined by an in vitro cell surface binding assay. One binding mutant, which is expressed and secreted at wild-type levels from ETEC, holds particular promise for further studies of the role of the LT-LPS interaction. Interestingly, some mutations made affected the secretion of the toxin as detected by ganglioside-binding ELISAs of cell-free supernatant, and several mutations affected both secretion and LPS binding. These mutations identify residues of the toxin that are involved in its secretion and association with LPS. In addition, we introduced mutations affecting the secretion of LT into CT, due to the high similarity between the two toxins. While one mutation affects the secretion of each, other mutations affect one toxin but not the other. These results demonstrate that LT and CT are recognized in different ways during T2S. Combined with an analysis of the effects of secretion mutations on the stability of the toxin, the results described here highlight the delicate balance between structure and function of the LT B subunit.</p> / Dissertation

Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) é frequentemente associada com diarreia dos viajantes, e é uma das principais causas de mortalidade infantil em países em desenvolvimento. Para melhor colonizarem os diferentes nichos em que se encontram, essas bactérias precisam se adaptar às diferentes condições impostas pelo ambiente regulando assim, a expressão dos seus genes. ETEC adere-se aos enterócitos por meio de fatores de colonização (CFA) e provoca diarreia aquosa pela secreção das toxinas termolábil (LT) e termoestável (ST). Não há um padrão único de secreção das toxinas LT e ST pelos isolados de ETEC. Sendo assim, decidimos investigar como seria o perfil de expressão dos genes que regulam a produção e secreção dessas toxinas. O objetivo do presente trabalho é comparar o perfil de secreção e produção das proteínas LT e ST, bem como analisar a expressão dos genes envolvidos na produção dessas toxinas em isolados de ETEC. Os resultados obtidos nesse estudo permitiram concluir que os genes eltA, sta1 e sta2 presentes nas cepas H10407 e 5 são expressos diferencialmente nas bactérias cultivadas em caldo EC. Apesar da semelhança, não há correlação entre a expressão gênica e secreção e produção das toxinas, sugerindo que há outros mecanismos envolvidos no controle da produção dessas toxinas. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is often associated with travelers diarrhea, and is a major cause of infant mortality in developing countries. To better colonize different niches in which they are, these bacteria need to adapt to different conditions imposed by the environment thus regulating the expression of their genes. ETEC adhere to the enterocytes by colonization factors (CFs) and causes watery diarrhea for secretion of heat-labile toxin (LT) and heat-stable (ST). There is no single pattern of secretion of toxins LT and ST by isolates of ETEC. Therefore, we decided to investigate how would the expression profile of genes that regulate the production and secretion of these toxins. The objective of this study is to compare the profile of secretion and production of proteins LT and ST, as well as to analyze the expression of genes involved in the production of toxins in isolated ETEC. The results of this study showed that the eltA, sta1 and sta2 genes present in strains H10407 and 5 are differentially expressed in bacteria grown in EC broth. Despite the similarity, there is no correlation between gene expression and secretion and production of toxins, suggesting that there are other mechanisms involved in controlling the production of these toxins.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

A História da educação profissional no Brasil pode ser compreendida a partir do desenvolvimento das forças produtivas enquanto superestrutura derivada das relações econômicas e, também, a partir das diversas formas de trabalho e cultura que os grupos sociais produzem. Nesse sentido, a educação profissional requer, além do domínio operacional de um determinado fazer, a compreensão do saber tecnológico, a valorização da cultura do trabalho e a mobilização dos valores necessários à tomada de decisões. A modernização do sistema de produção em vista das necessidades do mercado, implicou uma série de reformas, incialmente no que tange à prática profissional, na diligência política e nas relações sociais. Nesse sentido, a presente pesquisa pretende analisar as experiências vividas pela escola agrícola, do Centro Paula Souza, a ETEC Manoel dos Reis Araújo, Santa Rita do Passa Quatro, Estado de São Paulo, e suas contribuições para com a formação de mão de obra especializada, ou seja, busca-se verificar especificamente como os estudantes percebem a formação que recebem e o papel da instituição. Para tanto, será analisado, a partir das expectativas do estudante, o que esperam com relação à sua formação ao longo do curso, se as competências e habilidades adquiridas foram de encontro aos seus anseios, em vista do espaço que pretendem ocupar no mercado de trabalho. Sendo assim, acreditou-se na hipótese de que os recursos humanos formados, nessa instituição, interessam ao mercado de trabalho afim, o agronegócio. O percurso metodológico da pesquisa está pautado em análises de dados quantitativos e qualitativos oferecidos pela Secretaria Tecnológica do Estado de São Paulo, pelas Escolas Técnicas do Centro Paula Souza, as ETECs e, em entrevistas com estudantes do 3o ano, do Ensino Médio Integrado ao Técnico-ETIM, professores e matérias práticas (técnicas) e produtores rurais (locais), com finalidade de identificar o atual perfil do público alvo dessa instituição. Espera-se, com essa pesquisa, enriquecer o quadro historiográfico da educação profissionalizante do Estado de São Paulo, desenvolvendo um estudo das experiências da ETEC Agrícola, tanto da sua estrutura passada quanto da atual, discutindo a formação dos alunos a partir de suas expectativas de mercado e a possibilidade de inserção no agronegócio. / The history of professional education in Brazil can be understood from the development of the productive forces as the superstructure derived from economic relations, and also from the different forms of work and culture that social groups produce. In this sense, professional education requires, besides the operational domain of a particular task, the understanding of technological knowledge, the work culture valorization and the mobilization of the necessary values for decision making. The modernization of the production system in view of the market needs, implied a series of reforms, initially with regard to work itself, political diligence and social relations. In view of this, the present research intends to analyze the experiences lived in the agricultural school, of Centro Paula Souza, Etec Manoel dos Reis Araújo, in the city of Santa Rita do Passa Quatro, State of São Paulo and its contributions to the supply of skilled labor, that is, we will specially check the current student profile of this institution. For this purpose, it will be analyzed, based on the student\'s expectations, what he/she expects in relation to his/her qualification during the course, if the abilities and acquired skills were found according to his/her wishes, in view of what the ones who intend to follow in the job market. Therefore, it is believed that the human resources graduated there are of interest to the labor market, agribusiness. The methodological course of the research will be based on analyzes of quantitative and qualitative data offered by the Technological Department of the State of São Paulo, by the Technical Schools of Centro Paula Souza, the Etecs, and in interviews with students of the 3rd grade Etim (High School Integrated to Technical) teachers and practical subjects (technicals) and rural producers (local) with the purpose of identifying the current profile of the target public of this institution. It is expected, therefore, to enrich the historiographic chart of professional education in the State of São Paulo, by studying the experiences of Etec Agrícola, both its past structure and its current structure, discussing the students\' education based on their market expectations and the possibility of insertion in agribusiness. In order to do so, it will be analyzed, based on the expectations of the student, what he expects in relation to his training during the course, if the skills and acquired skills were in agreement with his wishes, in view of what they intend to follow in the job market. Thus, it is believed that the human resources trained there are of.

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