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Régulation de la biosynthèse des épitopes sialyl-Lewis[x] et 6-sulfo-sialyl-Lewisx par le TNF dans la muqueuse bronchique humaine et influence sur l’adhésion de Pseudomonas aeruginosa / Control of sialyl-Lewis[x] derivatives expression by TNF in human bronchial mucosa and influence on Pseudomonas aeruginosa adhesion

Colomb, Florent 17 December 2012 (has links)
Les mucines bronchiques des patients atteints de mucoviscidose présentent des modifications de glycosylation qui se traduisent par la sur-expression de motifs sialyl-Lewisx (NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc-R, sLex) et 6-sulfo-sLex (6-sulfo-sLex), qui sont des récepteurs préférentiels de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de l’infection chronique des patients atteints de mucoviscidose. Nous avons montré que le traitement au TNF d’explants bronchiques humains induisait une surexpression de motifs sLex et 6-sulfo-sLex, et que celle-ci était accompagnée d’une surexpression du gène de l’α2,3-sialyltransférase ST3GAL4. Nous avons pu mettre en évidence un effet similaire du TNF dans la lignée A549, et démontrer l’importance du gène ST3GAL4 dans la synthèse de sLex et 6-sulfo-sLex par interférence ARN. Nous avons ensuite identifié un transcrit majeur, BX répondant au TNF dans les explants bronchiques humains et dans les cellules A549, et cloné la région génomique possiblement impliquée dans le contrôle de l’expression de ce transcrit. Cette région présente une activité promotrice de base et répond au TNF. L’étude de différentes constructions de cette région et d’inhibiteurs pharmacologiques de voies de signalisation ont ensuite été utilisé dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant à l’augmentation de l’expression de ST3GAL4 par le TNF. Enfin, nous avons étudié avec la lignée cellulaire NCI-H292 l’effet du TNF sur l’adhésion de différentes souches de Pseudomonas aeruginosa. Nos résultats préliminaires indiquent que le traitement par le TNF induit une surexpression de ST3GAL4, du sLex, et une augmentation de l’adhésion des souches PAO1 et PAK, dépendante de l’adhésine FliD, et de la présence d’acide sialique. / Bronchial mucins from patients suffering from cystic fibrosis (CF) exhibit glycosylation alterations, especially increased amounts of sialyl-Lewisx (NeuAcα2-3Galβ1-4[Fuc[α1-3]GlcNAc-R, sLex) and 6-sulfo-sialyl-Lewisx (6-sulfo-sLex) structures. These epitopes are preferential receptors for Pseudomonas aeruginosa, the bacteria responsible for the chronicity of airway infection of CF patients. Several studies have shown that inflammation may affect glycosylation and sulfation of glycoproteins, including mucins. We previously proposed that the inflammatory context in the respiratory tract of CF patients was responsible for the overexpression of sLex and 6 sulfo-sLex structures. Indeed, we and others have shown that pro-inflammatory cytokines can modulate glycosylation in the bronchial mucosa and in bronchial cell lines. In particular, TNF, IL-6 and IL-8 increase the expression and activity of several members of the sialyl-, fucosyl- and sulfotransferases families in human bronchial explants. During my thesis, I showed that TNF regulates the expression of a specific transcript (BX) of the ST3GAL4 gene that encodes the main α2,3-sialyltransferase (ST3Gal IV) involved in the biosynthesis of sLex and 6-sulfo-sLex epitopes in both human bronchial explants and A549 lung cancer cells. A 2 kb genomic region was cloned and we have shown by reporter gene experiments that this region could be responsible for both basal BX transcript expression and response to TNF treatment in A549 cells. Different genetic constructions of this sequence and the use of pharmacological inhibitors allowed us to study the molecular and cellular mechanisms involved in ST3GAL4 up-regulation induced by TNF treatment. In parallel, we have studied the effect of TNF-induced sLex and 6- sulfo -sLex overexpression on P. aeruginosa adhesion, using the NCI-H292 pulmonary carcinoma cell model. Our preliminary results indicate that TNF treatment induces an enhance expression of sLex derivatives that correlates with an enhance adhesion of both PAO1 and PAK strain. This increased adhesion is dependant of the presence of a functional FliD protein, the bacterial lectin recognizing sLex and 6- sulfo -sLex, and is abolished by sialidase treatment. Identifying mechanisms by which sLex and 6-sulfo-sLex structures are overexpressed on bronchial mucins from CF patients may allow the identification of new targets to fight bronchial inflammation and infection by P. aeruginosa.
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Régulation de la synthétase des acides gras par l'insuline et la T3 : mise en évidence de l'action génomique et non génomique de la T3

Radenne, Anne January 2008 (has links) (PDF)
La synthétase des acides gras (FAS) est une enzyme clef de la lipogenèse hépatique responsable de la synthèse des acides gras saturés à longue chaîne. Cette enzyme est régulée au niveau transcriptionel par les nutriments et les hormones. Ainsi, le glucose, l'insuline et la T3 augmentent son activité alors que les acides gras à moyennes chînes (MCFAs), les acides gras poly-insaturés (PUFAs) et le glucagon la diminuent. Dans des cellules hépatiques, nous avons mis en évidence que la T3 et l'insuline étaient capables d'activer de façon synergique l'activité enzymatique et le niveau d'expression des ARNm de la FAS (14 fois). L'analyse du promoteur a permis de démontrer que cette activation était aussi transcriptionnelle. Par la suite l'élément de réponse à la T3 (TRE) a été localisé dans la région promotrice du gène FAS. Ce TRE fixe un hétérodimère TR/RXR en absence d'hormone et cette fixation est augmentée en présence d'insuline et/ou de T3. L'utilisation de H7, un inhibiteur général des serines/thréonines kinases, nous a permis de mettre en évidence que des mécanismes de phosphorylation sont impliqués dans la régulation transcriptionelle de la FAS par ces deux hormones. En fait, nous avons démontré que la voie de signalisation cellulaire PI3-Kinase/ ERK1/2-MAPK est impliquée dans la régulation de la FAS par la T3 via le TRE. De plus, nous avons aussi mis en évidence un effet de l'insuline sur ce TRE qui impliquerait la même voie de signalisation ainsi qu'une voie qui pourrait aussi impliquer Akt. Les mêmes effets non génomiques de la T3 et de l'insuline sont aussi observés au niveau d'un TRE consensus de type DR4. En conclusion, nos résultats suggèrent que la T3 régule la transcription par un mécanisme d'action à la fois génomique et non génomique impliquant la voie PI3-Kinse/MAPK et que l'insuline est aussi capable de cibler ce TRE par des voies de signalisation spécifiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : FAS, T3, Insuline, PI3-Kinase, Erk1/2-MAPK.
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Relations structure-fonction de Erm, un membre du groupe PEA3 appartenant à la famille des facteurs de transcription Ets

Mauën, Sébastien J. A. P. 13 October 2006 (has links)
La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment. Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm. Pour réaliser l’étude structurelle des trois membres du groupe PEA3, nous les avons produits, via le système d’expression baculoviral, et purifiés. Dans ces conditions, nous avons obtenu plusieurs mg de la protéine Erm purifiée à plus de 95%. Nous avons dès lors réalisé des études par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge qui ont mis en évidence une faible structuration de la protéine. Ces résultats corrèlent avec les prédictions bioinformatiques pour la structuration en hélice alpha. Néanmoins, certaines divergences sont apparues en ce qui concerne la détermination de la structuration en feuillets beta, ces derniers étant probablement surévalués dans les études expérimentales suite à une forte propension à l’agrégation protéique. En parallèle, nous avons pris part à la démonstration du fait que la protéine Erm est modifiée par ubiquitinylation. Cette modification post-traductionnelle a pour conséquence de diriger Erm vers la voie de dégradation par le protéasome et donc de rendre ce facteur de transcription très labile. C’est ainsi qu’à l’heure actuelle, les tentatives de cristallisation de la protéine sont restées sans succès. Afin de mettre en évidence les gènes régulés par les membres du groupe PEA3 dans le cancer mammaire métastatique, nous avons effectué des études par micro-array dans la lignée humaine MDA-MB-231. Lors d’expériences où l’expression de erm et de er81 a été diminuée par la technique des shRNA, nous n’avons malheureusement pas pu identifier de gènes dont l’expression était modulée de façon reproductible. Enfin, dans le but de mieux cerner les mécanismes qui conduisent à la surexpression des facteurs de transcription du groupe PEA3, nous nous sommes intéressés à la régulation de leur expression. Aussi, suite au travail initié préalablement au laboratoire sur le gène erm humain, nous avons déterminé une région de 24 nucléotides au sein du promoteur sensible à l’activation par la voie des PKCs conventionnelles (cPKCs). Cette région contient des sites putatifs de liaison pour plusieurs facteurs de transcription. Les expériences de mutagenèse dirigée et de retard sur gel indiquent que la régulation positive de erm par la voie des cPKCs semble être le résultat de la modification de l'activité d'un ou plusieurs facteur(s) transcriptionnel(s) qui reste(nt) à identifier.
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Rôle de la cyclophiline B dans la régulation de l’activité des macrophages / Rôle of Cyclophilin B in the regulation of macrophages activity

Marcant, Adeline 14 December 2011 (has links)
Les cyclophilines appartiennent à une famille de protéines initialement caractérisées par leur activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase et leur capacité à fixer la cyclosporine A. Les formes sécrétées des cyclophilines A (CyPA) et B (CyPB) induisent la migration de sous-populations leucocytaires, via un mécanisme dépendant de l’interaction avec un récepteur cellulaire commun, le CD147. Des données récentes ont également montré que la CyPA induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNF-α, ce qui suggère un rôle des cyclophilines sécrétées dans la régulation de la réponse inflammatoire. Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse a consisté à étudier le rôle de la CyPB dans la modulation des réponses inflammatoires du macrophage. Contrairement à la CyPA, la CyPB n’induit pas la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. A l’inverse, la pré-incubation des cellules en présence de CyPB réduit leur production en réponse au LPS. L’analyse des réponses induites par la CyPB nous a permis de mettre en évidence l’expression de Bcl-3, un régulateur négatif de l’activité du facteur de transcription NF-κB. Nous avons alors montré que la CyPB inhibe la production de TNF-α induite par le LPS en bloquant l’activation transcriptionnelle du gène codant pour cette cytokine. En complément, nous avons mis en évidence un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle qui pourrait faire intervenir MKP-1, une phosphatase impliquée dans l’inactivation des MAPKs et dans la déstabilisation de l’ARNm du TNF-α. Dans leur ensemble, ces travaux démontrent que la CyPB pourrait agir comme une protéine régulatrice de la réponse inflammatoire. / Cyclophilins are members of a family of proteins initially characterised for their peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity and their ability to interact with cyclosporine A. Secreted forms of cyclophilin A (CyPA) and B (CyPB) induce the migration of leukocyte subsets by a mechanism dependent on the interaction with a common cellular receptor, CD147. Recently published data have also shown that CyPA induced the expression of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α, suggesting a role for secreted cyclophilins in the regulation of inflammatory responses. In this context, the aim of my thesis was to study the implication of CyPB in the modulation of inflammatory responses of macrophages. Unlike CyPA, CyPB did not induce the secretion of pro-inflammatory cytokines. Conversely, pre-treatment with CyPB reduced the production of cytokines from LPS-stimulated macrophages. Analysis of the responses induced by CyPB has highlighted the expression of Bcl-3, a negative regulator of the transcriptional factor NF-κB. Then, we showed that CyPB inhibited LPS-induced production of TNF-α by blocking the transcriptional activation of the gene coding for this cytokine. In addition, we characterized a mechanism of post-transcriptional regulation that could bring into play MKP-1, a phosphatase involved in down-regulation of MAPKs and destabilization of TNF-α mRNA. Altogether, these findings indicate that CyPB could act as a regulatory protein in the inflammatory responses.
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Étude de la survie et de la viabilité de Listeria monocytogenes dans les effluents d’élevages porcins / Study of the survival and viability of Listeria monocytogenes in effluent from pig farms

Desneux, Jérémy 07 December 2015 (has links)
La listériose est une maladie rare mais grave d’origine alimentaire provoquée par Listeria monocytogenes. En raison de sa capacité de survie importante dans les sols, la présence de cette bactérie dans les effluents d’élevages porcins destinés à être épandus constitue un problème de santé publique. L’un des facteurs pouvant expliquer la persistance de L. monocytogenes dans l’environnement est sa capacité à entrer dans un état viable mais non cultivable (VNC). Nos travaux avaient pour objectif, d’une part de suivre le comportement de L. monocytogenes dans les effluents d'élevages porcins (lisier et effluent de lagune) et notamment les formes VNC, et d’autre part d’étudier son adaptation lors de son transfert dans les effluents de lagune et dans le sol. Dans un premier temps, nous avons optimisé les conditions de la qPCR couplée au propidium monoazide (qPCR-PMA) afin d’adapter cette méthode au dénombrement des formes VNC de L. monocytogenes dans le lisier et l’effluent de lagune. Dans un second temps, nous avons comparé par méthode culturale, qPCR-PMA et qPCR, la survie de deux souches de L. monocytogenes RifR de sérogroupes IIb et IVb inoculées dans deux lisiers et dans deux effluents de lagune incubés à 8°C et 20°C. Malgré leur origine et leur sérotype différents, les deux souches ont présenté une survie similaire dans toutes les conditions testées. La survie des deux souches a été affectée par la température (une persistance plus élevée a été observée à 8°C) et par l’origine des effluents. Cette étude a mis en évidence que L. monocytogenes était capable d’entrer dans l’état VNC dans les lisiers et les effluents de lagune indépendamment de la température. Les formes VBNC qui représentaient 83 à 99,8% des bactéries viables après 60 jours d’incubation, sont apparues dès les premières heures de contact avec les effluents. Leur proportion, plus élevée en début d’expérience dans les lisiers que dans les effluents de lagune, était cependant du même ordre de grandeur dans les deux types de matrices après 60 jours. Afin de mieux comprendre l’adaptation de L. monocytogenes lors de son transfert dans l’effluent de lagune et dans le sol, nous avons comparé le transcriptome par la technologie RNA-seq de la souche CIP 110868, isolée d’un lisier, inoculée dans des extraits stériles d’effluent de lagune et de sol. L’analyse du transcriptome a été réalisée à T0 (génome de référence), après 20 minutes et 20 heures d’incubation. L’analyse par enrichissement fonctionnel a révélé des modifications transcriptomiques dès les 20 premières minutes d’incubation dans les deux matrices. Une augmentation du taux de transcrit de gènes impliqués dans le transport de protéines et de sucres a été observée. Le taux de transcrit des gènes contrôlés par le facteur sigmaB est augmenté indiquant la mise en place d’une réponse aux stress osmotiques et thermiques. De plus, l’adaptation de la souche CIP 110868 dans les extraits de sol et d’effluent de lagune s’est accompagnée d’une augmentation au cours du temps des taux de transcrit des gènes impliqués dans la virulence et des gènes sous le contrôle du régulateur prfA. / Listeriosis is a rare but serious illness caused by foodborne Listeria monocytogenes. Because of its important survival capacity in the soil, the presence of this bacteria in effluent from pig farms intended to be spread is a public health problem. One factor that may explain the persistence of L. monocytogenes in the environment is its ability to enter a viable but non-culturable state (VNC). Our studies were aimed, firstly to monitor the behavior of L. monocytogenes in effluent from pig farms (manure and lagoon effluent) including VNC forms, and also to study its adaptation at transfer to the lagoon effluent and soil. First, we have optimized the conditions of qPCR coupled with propidium monoazide (qPCR-LDCs) to adapt this method to count VNC forms of L. monocytogenes in the manure and lagoon effluent. Secondly, we compared by cultivation method, qPCR and qPCR-LDCs, the survival of two strains of L. monocytogenes RifR IIb and IVb serogroups manure inoculated in two and two lagoon effluent incubated at 8 ° C and 20 ° C. Despite their origin and different serotype, the two strains showed a similar survival in all conditions tested. The survival of both strains was affected by the temperature (higher persistence was observed at 8 ° C) and the origin of the effluent. This study showed that L. monocytogenes was able to enter the VNC state in manure and lagoon effluent regardless of temperature. VBNC forms which accounted for 83 99.8% of viable bacteria after 60 days of incubation, appeared in the early hours of contact with effluent. Their proportion, higher at the beginning of experience in the manure lagoon in the effluent, however, was of the same order of magnitude in the two types of matrices after 60 days. To better understand the adaptation of L. monocytogenes when transferred into the lagoon effluent and soil, we compared the transcriptome by RNA-Seq technology CIP 110868 strain, isolated from a slurry inoculated in sterile effluent lagoon and extracts of soil. Transcriptome analysis was performed at T0 (reference genome), after 20 minutes and 20 hours of incubation. Functional enrichment analysis revealed transcriptomic changes during the first 20 minutes of incubation in both matrices. An increase in the gene transcript levels involved in the transport of proteins and sugars was observed. The rate of transcribed genes controlled by the sigmaB factor is increased indicating the establishment of a response to osmotic and thermal stress. In addition, the adaptation of the CIP 110868 strain in soil extracts and lagoon effluent was accompanied by an increase in time of transcript levels of genes involved in virulence and gene under the control the prfA regulator.
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Étude de la régulation transcriptionnelle des éléments intégratifs et conjugatifs de la famille SXT/R391

Poulin-Laprade, Dominic January 2015 (has links)
Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) de la famille SXT/R391 sont reconnus pour leur rôle prépondérant dans la propagation de la résistance aux antibiotiques parmi des populations de Gammaproteobactéries, en particulier chez Vibrio cholerae, l’agent pathogène causant le choléra. Ces éléments génétiques autonomes possèdent tous les gènes nécessaires à leur dissémination au sein d’une population bactérienne et s’intègrent normalement dans un site précis du chromosome bactérien. L’activateur SetCD et la machinerie de conjugaison encodée par les ICE permettent non seulement leur transfert conjugatif, mais également la mobilisation d’îlots génomiques, les MGI (mobilizable genomic islands). Lorsque leur transfert est enclenché sans excision au préalable, les MGI et les ICE peuvent mobiliser plusieurs centaines de kb d’ADN chromosomique adjacent à leurs sites d’insertions. Cet ADN mobilisé peut alors recombiner avec le génome de la cellule réceptrice, aboutissant à des remplacements d’allèles. En plus du squelette de gènes conservés de cette famille d’ICE, ces éléments portent une cargaison d’ADN variable qui peut coder pour des fonctions adaptatives potentiellement avantageuses pour l’hôte bactérien. Les ICE SXT/R391 portent également les gènes codant pour un système de recombinaison qui promeut la diversité de la famille en générant des ICE hybrides. Ces éléments mobiles sont extrêmement stables dans les populations bactériennes. Cette stabilité est attribuable à leur intégration au chromosome et à plusieurs composantes qu’ils contiennent, par exemple les systèmes toxine-antitoxine de la cargaison d’ADN variable ou encore le système conservé de partition des éléments excisés. La majorité des gènes portés par les ICE SXT/R391 est contrôlée par leur système de régulation qui se situe au cœur de ce projet doctoral. Ce système de régulation comprend SetR, le répresseur responsable du maintien de l’état quiescent dans lequel l’ICE est intégré au chromosome et est propagé verticalement dans la population bactérienne, c’est-à-dire au rythme de la réplication chromosomique et de la division cellulaire. Lorsque l’ADN bactérien est endommagé, il y a activation de la réponse SOS de réparation de l’ADN par RecA, un facteur de l’hôte, qui induit parallèlement l’autoprotéolyse de SetR, levant ainsi la répression exercée sur les gènes setC et setD. Ces derniers codent pour SetCD, le complexe activateur des ICE SXT/R391 qui active l’expression de la machinerie de conjugaison ainsi que d’autres fonctions codées par ces ICE. Ce projet doctoral a permis l’identification de nouvelles composantes importantes pour la régulation des ICE SXT/R391. Premièrement, nous avons généré par génie génétique plusieurs mutants qui ont permis de caractériser CroS par des essais de transfert conjugatif, de PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) et d’expression avec le gène rapporteur lacZ. Nous avons déterminé que CroS est un régulateur transcriptionnel qui, avec SetR, constitue un interrupteur génétique permettant l’induction du transfert conjugatif dépendante de RecA. Nous avons également validé par gel à retardement la liaison par SetR et CroS d’un site opérateur additionnel. Des essais β galactosidase ont montré que ce site contribue à la répression des gènes croS, setC et setD. De plus, les résultats de ce projet doctoral ont clarifié certains points concernant la régulation par SetCD. Des essais d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à la digestion avec une exonucléase (ChIP-exo) combinés avec le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et la détermination des sites +1 d’initiation de la transcription (5’-RACE et extension d’amorces) ont permis d’établir le régulon de SetCD chez les ICE SXT/R391 et chez les MGI qu’ils mobilisent. La nécessité de SetCD dans la cellule réceptrice pour qu’il y ait intégration de l’ICE de manière site-spécifique dans l’extrémité 5’ du gène prfC a été mise en évidence à l’aide de la construction de mutants, d’essais de transfert conjugatif, de buvardage de type Southern, d’électrophorèse en champs pulsés et de PCR en temps réel. Nous avons également observé, grâce à des essais de PCR quantitatif et d’activité β galactosidase, une boucle de rétroaction positive médiée par l’activation de l’excision et de la réplication de l’ICE par SetCD. En somme, ce projet doctoral a mené à une meilleure compréhension des composantes et des mécanismes en scène pour la gouvernance de cette famille d’ICE qui sont, entres autres, d’importants vecteurs de la dissémination des résistances aux antibiotiques.
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Abc3, un transporteur vacuolaire exprimé en carence de fer chez la levure à fission

Pouliot, Benoît January 2010 (has links)
De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.
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Élucidation d'un nouveau mécanisme d'inactivation de Php4 en réponse au fer

Vachon, Philippe January 2014 (has links)
Le fer est un cofacteur essentiel à la croissance des organismes. Cependant, un surplus de fer conduit à la production de dérivés toxiques de l’oxygène qui sont dangereux pour les cellules. La concentration intracellulaire de fer doit donc être régulée. Lorsque la biodisponibilité du fer s’amenuise, la plupart des cellules augmentent leur acquisition du fer environnemental tout en réduisant sa consommation en réprimant plusieurs voies métaboliques fer-dépendantes non-essentielles. Alors que les mécanismes qui régissent l’augmentation de l’acquisition du fer sont assez bien caractérisés, les composantes qui contrôlent la promotion de l’économie du fer sont largement méconnues. Mes travaux ont porté sur l’étude des mécanismes de contrôle de l’économie du fer chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Php4, une sous-unité du complexe liant les boîtes CCAAT, est responsable de la répression des gènes codants pour des protéines qui utilisent du fer lorsque ce dernier est en faible concentration. Il est déjà connu qu’en présence de fer, l’expression du gène php4+ est réprimée via le facteur de transcription Fep1. De plus, la protéine Php4 est inactivée et exportée hors du noyau lorsque les cellules croissent en présence de fer. Ce processus est dépendant à la fois de la présence de l’exportine Crm1 et de la monothiol glutarédoxine Grx4. L’objectif de recherche est de découvrir le mécanisme par lequel Grx4 inhibe Php4 en réponse à la présence de fer. L’approche du double-hybride a été utilisée pour quantifier la force de l’interaction entre Php4 et Grx4 et identifier les domaines de ces protéines qui y participent. Ce système nous a permis de déterminer que Php4 interagit de façon constitutive avec le domaine thiorédoxine (TRX) de Grx4, alors que l’interaction entre Php4 et le domaine glutarédoxine (GRX) est dépendante de la présence de fer. Nous avons déterminé que la cystéine 35 du domaine TRX et la cystéine 172 du domaine GRX sont essentiels pour l’interaction de chacun de ces domaines avec Php4. Des régions minimales de Php4 nécessaires pour son interaction avec chacun des domaines GRX et TRX ont aussi été identifiées. Par la suite, nous avons démontré que l’expression du domaine GRX seul de Grx4 est suffisante pour l’inactivation de Php4 en présence de fer. Puis, par des essais de fluorescence par complémentation bimoléculaire (BiFC), nous avons démontré que le domaine GRX de Grx4 interagit de façon fer-dépendante avec Php4 et qu’il est suffisant pour l’exportation de Php4 hors du noyau en présence de fer. Ces résultats révèlent que le mécanisme par lequel Php4 est inhibé en présence de fer dépend de son interaction avec le domaine GRX de Grx4. À la suite des résultats obtenus, un modèle illustrant l’interaction fer-dépendante entre Grx4 et Php4 suggère la présence potentielle d’un centre fer-soufre qui pourrait expliquer la nature de l’interaction fer-dépendante entre les deux protéines.
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Evolution des génomes microsporidiens et mécanisme d'adaptation moléculaire chez les parasites intracellulaires obligatoires

Belkorchia, Abdel 26 September 2007 (has links) (PDF)
Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires caractérisés par un mode d'infestation original, et pour certaines espèces, par un très fort degré de compaction du génome nucléaire. Des travaux portant sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Encephalitozoon cuniculi montrent qu'une organisation polycistronique des gènes est présente. Une maturation aléatoire des messagers conduit à la formation d'une population d'ARNm comprenant des ARNm monocistroniques et polycistroniques. Afin d'améliorer nos connaissances sur la structure des génomes microsporidiens et leur capacité d'adaptation, le sequençage du génome de Brachiola algerae a été initié : 30 bandes d'ADN chromosomiques ont pu être visualisées (taille du génome estimée à 23Mb). Les premières données de séquence ont révélées la présence de plusieurs classes d'éléments transposables ainsi que des gènes codant des enzymes impliquées dans le processus d'ARN interférence
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Passage de la neurotoxine botulique à travers la barrière intestinale

Couesnon, Aurélie 21 November 2007 (has links) (PDF)
flasque, est produite par des bactéries anaérobies du genre Clostridium. Les BoNTs, classifiées en 7 types (A à G), forment divers complexes avec des protéines non toxiques, dont le composant non toxique non hémagglutinant (NTNH) et les hémagglutinines (HAs). Les gènes sont organisés, au sein du locus botulique, selon deux opérons divergents, ntnhbont/ A et ha34-ha17-ha70 pour le type A, dont l'expression est positivement régulée par le facteur sigma alternatif BotR. Un pic d'expression synchrone de tous les gènes du locus de type A est mesuré par RT-PCR en temps réel lors de la transition entre les phases exponentielle et stationnaire de croissance, en parallèle avec l'augmentation du titre en toxine du surnageant de culture. Dans un modèle d'épithélium intestinal, BoNT/A purifiée est transcytosée après liaison via le domaine Hc/A à des récepteurs apicaux comprenant des gangliosides et des protéines potentiellement apparentées à SV2. L'intensité de liaison et l'efficacité de transport de la toxine sont supérieures dans les cellules intestinales de type crypte plutôt qu'entérocyte. Injectés dans la lumière d'une anse iléale ligaturée, BoNT/A inhibe les contractions des muscles lisses et le domaine Hc/A fluorescent progresse de la muqueuse, via certaines cellules des cryptes, vers la sous-muqueuse et la musculeuse où il cible certaines terminaisons nerveuses, majoritairement cholinergiques. Hc/A entre par des voies distinctes dans les cellules neuronales (voie clathrine dépendante de la dynamine) et les cellules intestinales (voie non-clathrine, dépendante de Cdc42 et de la dynamine).

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