Clostridium difficile, un bacille à Gram positif anaérobie strict qui forme des spores, est un pathogène opportuniste responsable de simples diarrhées ou de colites pseudomembraneuses qui peuvent provoquer la mort. Le traitement de base réside en l'arrêt des antibiotiques qui ont détruit la flore de l'hôte et provoqué les symptômes, ou en la prescription de vancomycine et/ou de métronidazole. Malheureusement, l'efficacité de ces antibiotiques est variable et le nombre de rechutes est élevé. En outre, de plus en plus de souches deviennent résistantes aux antibiotiques. C'est pour cette raison qu'un besoin d'alternatives thérapeutiques s'est fait ressentir. Une des approches prometteuses est l'utilisation des endolysines, qui sont des enzymes hydrolytiques encodées par les bactériophages et qui se sont déjà révélées être efficaces contre plusieurs bactéries à Gram positif. Dans cette étude, nous avons démontré l'activité lytique d'endolysines encodées par des phages de Clostridium difficile sur des cellules vivantes. Différentes endolysines ont été clonées dans E. coli, exprimées et purifiées, puis leur activité a été vérifiée de plusieurs manières. Certains facteurs biochimiques propres à ces enzymes ont été étudiés, tels que les cofacteurs nécessaires pour une meilleure activité lytique, le pH optimal et le spectre d'efficacité sur différentes souches bactériennes. Finalement, l'étude de ces enzymes comme outil de diagnostic ou de biologie moléculaire est abordée. Les résultats de nos travaux indiquent que les endolysines PlyCD52 et PlyCD38-2 de C. difficile possèdent une faible activité lytique. L'activité des endolysines n'est pas influencée par les cofacteurs Tween 0,5%, Triton 0,1%, MgCl[indice inférieur 2] contrairement à l'EDTA qui inhibe celle-ci. Le pH optimum semble être compris entre 7 et 8,5 et ces enzymes agissent sur différentes souches de C. difficile à l'exception de la souche CD630. Malgré ces résultats encourageants, des travaux supplémentaires seront nécessaires afin de stabiliser les enzymes qui ont une forte tendance à précipiter et d'obtenir une meilleure activité.

RESUME DE LA THESE Le rôle majeur de l’Helicobacter pylori dans l’étiopathogénie des maladies gastroduodénales (gastrite, ulcère gastrique et duodénal, lymphome gastrique) est bien établi aujourd’hui. L’OMS l’a reconnue comme jouant un rôle important dans la survenue des lésions cancéreuses gastriques. La prévalence de l’infection à H. pylori varie selon les pays de 20% à 90% avec des taux supérieurs à 60% dans les pays en développement, dont le Bénin. Les méthodes usuelles de diagnostic sont soit invasives nécessitant une endoscopie gastrique avec biopsies (test rapide à l’urée, histologie, culture et PCR), soit non-invasives (test respiratoire à l’urée marquée au carbone, sérologie, et détection de l’antigène dans les selles). La trithérapie associant un inhibiteur de la pompe à protons (IPP) et deux antibiotiques choisis parmi l’amoxicilline, la clarithromycine et le métronidazole est recommandée pour son traitement. La survenue de résistance des souches H. pylori aux différents antibiotiques devient une cause majeure de l’échec des régimes d’éradication. Afin d’évaluer l’applicabilité et l’efficacité des régimes thérapeutiques recommandés en pratique courante, et à partir d’une étude de cohorte prospective, nous avons étudié la prévalence de l’infection à H. pylori chez les patients consultant à la clinique de Gastroentérologie de l’hôpital universitaire Erasme à Bruxelles, déterminé son taux de résistance primaire aux antibiotiques, et évalué le taux d’éradication d’H. pylori par la trithérapie. Nous avons aussi évalué la performance du test de détection de l’antigène d’H. pylori dans les selles pour le diagnostic chez l’adulte (avant traitement) comparé avec les méthodes de référence (culture, histologie), également dans le contrôle de l’éradication. Au Bénin, nous avons évalué à partir d’une étude transversale prospective, la prévalence de l’infection à H. pylori dans une population en milieu urbain et rural. Nous avons déterminé la distribution par famille des sujets infectés, ainsi que l’influence des variables démographiques individuelles, et les caractéristiques socio-économiques familiales sur le risque de l’infection. La prévalence de résistance primaire à la clarithromycine et au métronidazole fut observée respectivement dans 3% et 31% des souches isolées. Aucune résistance primaire à l’amoxicilline et à la tétracycline n’a été observée. Les analyses en intention de traiter, ont montré que H. pylori a été éradiqué chez 80% des patients inclus dans l’étude thérapeutique. Le taux d’échec d’éradication fut de 20%. Comparé au 14C-TRU, le test HpSA avait une sensibilité de 100%, une spécificité de 91%, VPP de 69%, VPN de 100%. De même, la sensibilité du test HpSA par rapport aux deux méthodes usuelles (culture et histologie) est de 96.5% pour une spécificité de 91.2%, une VPP de 90.3% et une VPN de 96.8%. Au Bénin, la prévalence de H. pylori était de 75.4% en ville et de 72.3% dans le village (p = 0.459). Aucune association n’a été observée avec l’âge, le sexe, le niveau d’instruction, la taille du ménage, l’activité économique ou le mode d’approvisionnement en eau potable. Le taux d’infection était plus élevé chez les enfants dont les parents étaient infectés et chez ceux ayant une mère H. pylori positive (p < 0.001). L’analyse multivariée par régression logistique a montré que la densité d’occupation des dortoirs [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), et le statut des mères dans le ménage ([OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67)] p < 0.001) étaient les prédicteurs indépendants de l’infection par H. pylori. Le risque de l’infection chez les enfants était 13 fois plus élevé quand les deux parents sont simultanément positifs OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22), il l’était respectivement de 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), quand la mère et le père sont positifs p < 0.001. Aussi le risque d’infection à H. pylori comparé aux enfants qui dorment seul dans leur chambre, était élevé pour ceux qui dorment avec un ou deux personnes OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05, et plus élevé chez les enfants qui dorment à 4 ou plus OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005, comparé à ceux qui dorme seuls. Donc, le contact avec des personnes infectées au sein de la famille et la vie en promiscuité, étaient associés avec un risque d’infection plus élevé indiquant une transmission intrafamiliale de l’infection par H. pylori. En conclusion, nos résultats montrent une séroprévalence encore élevée de l’infection à H. pylori dans la population béninoise. Une surveillance de l’épidémiologie accompagnée de mesures de prévention ciblées sur les facteurs potentiels de risque de l’infection doit être poursuivie. La validation du test de détection de l’antigène dans les selles avant traitement et dans le contrôle de l’éradication de la bactérie pour le suivi thérapeutique des patients infectés, est une alternative intéressante notamment au Bénin. Le taux de résistance primaire pour le métronidazole est actuellement stable en Belgique, alors que la prévalence de la résistance à la clarithromycine mérite d’être précisée par d’autres études multicentriques. La trithérapie classique à base d’inhibiteur de la pompe à protons–amoxicilline-clarithromycine reste recommandable en première intention. La surveillance épidémiologique de l’infection basée sur la prévalence locale des souches clarithro-résistantes et métronidazole-résistantes devrait être poursuivie. SUMMARY OF THE THESIS The major role of H. pylori in the etiopathogeny of various gastroduodenal diseases (gastritis, gastric and duodenal ulcers, gastric lymphoma) is well established today. The World Health Organization concluded that H. pylori plays a causal role in the chain of events leading to cancer of the stomach. The prevalence of H. pylori infection varies by country from 20% to 90%, with higher prevalence rates over 60% observed in developing countries, including Bénin. The usual methods allowing the diagnosis of the gastric infection by H. pylori are either invasive, requiring a gastric endoscopy and biopsies (fast urease test, anatomopathological examination, culture and PCR), or noninvasive (breath test with 13C or 14C marked urea, serology and stool antigen detection). Triple therapy associating a proton pump inhibitor (PPI) with two antibiotics, chosen between amoxicillin, clarithromycin and metronidazole, is currently recommended. Resistance of H. pylori strains to antibiotics becomes a major determinant in the failure of eradication of regimens. To evaluate the applicability and efficacy of the therapeutic recommendations in our pratice, based on a prospective study, we studied the prevalence of H. pylori infection in the outpatient population of the Gastroenterology clinic at the Erasme University hospital in Brussels, determined its rate of primary resistance to antimicrobial agents and evaluated the rate of eradication of H. pylori by triple therapy. We also evaluated the performance of a stool antigen detection test for the diagnosis of H. pylori infection in adults (before treatment) compared with reference methods (culture and histology) as well as in control of eradication. In Benin, we evaluated by a cross-sectional study the prevalence of the infection with H. pylori in the population living in urban and rural environment. We determined the family distribution of infected subjects as well as the influence of individual demographic variables and of the socio-economic family characteristics on the risk of infection. In Brussels, primary resistance to clarithromycin and metronidazole was observed in 3% and 31% of the isolates, respectively. No primary resistance to amoxicillin and tetracycline was observed. By intention to treat analysis, H. pylori was eradicated in 80% of patients included in the therapeutic study. The rate of eradication failure was 20%. In comparison with 14C-Urea breath test, the H. pylori Stool Antigen test showed a sensitivity of 100%, a specificity of 91 %, PPV of 69%, and NPV of 100%. Compared to the reference methods (culture and histology), the HpSA test had a sensitivity of 96.5% and a specificity of 91.2%. PPV of 90.3% and NPV of 96.8%. In Benin, the prevalence of H. pylori antibodies was 75.4% in town and 72.3% in the village (P= 0.459). No association was found between infection and age, sex, education level, size of the household, economic activity or source of drinking water. The infection rate was higher in children of parents who were both infected and also in those whose mother was infected (p < 0.001). By logistic regression analysis, the density of occupation of dormitories (more than three persons sharing dormitory, [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), and mother status within the household ( [OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67) ] p < 0.001), were independent predictors for H. pylori infection. The risk of H. pylori infection in children was 13 times higher when the two parents were simultaneously positive: OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22) and it was respectively of 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), when mother and father were positive p < 0.001. H. pylori infection risk in children was higher for a sharing a dormitory with one or two persons, OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05 and was even higher if a dormitory of 4 persons or more, OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005 as compared to sleeping alone. Family contact with infected persons and crowded living conditions were associated with increased risk of infection consistent with intrafamilial H. pylori transmission. In conclusion, our results confirm a still high H. pylori seroprevalence in population in Benin. An epidemiolgic survey with prevention mesures targeted on potential risk predictors should be going on. Validation of antigen detection test in patients stools before treatment and for eradication control could be an interested alternative, notably in Benin. Primary resistance rate on metronidazole is stable today in Belgium, though the resistance prevalence on clarithromycin should be determined by other multicentric studies. Standard triple therapy by (PPI)-amoxicillin-clarithromycin is still recommended in first intention to treat. Epidemiological survey of infection based on local prevalence of claritromycin-resistant and metronidazole-resistant strains should be continued.

Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) de la famille SXT/R391 sont reconnus pour leur rôle prépondérant dans la propagation de la résistance aux antibiotiques parmi des populations de Gammaproteobactéries, en particulier chez Vibrio cholerae, l’agent pathogène causant le choléra. Ces éléments génétiques autonomes possèdent tous les gènes nécessaires à leur dissémination au sein d’une population bactérienne et s’intègrent normalement dans un site précis du chromosome bactérien. L’activateur SetCD et la machinerie de conjugaison encodée par les ICE permettent non seulement leur transfert conjugatif, mais également la mobilisation d’îlots génomiques, les MGI (mobilizable genomic islands). Lorsque leur transfert est enclenché sans excision au préalable, les MGI et les ICE peuvent mobiliser plusieurs centaines de kb d’ADN chromosomique adjacent à leurs sites d’insertions. Cet ADN mobilisé peut alors recombiner avec le génome de la cellule réceptrice, aboutissant à des remplacements d’allèles. En plus du squelette de gènes conservés de cette famille d’ICE, ces éléments portent une cargaison d’ADN variable qui peut coder pour des fonctions adaptatives potentiellement avantageuses pour l’hôte bactérien. Les ICE SXT/R391 portent également les gènes codant pour un système de recombinaison qui promeut la diversité de la famille en générant des ICE hybrides. Ces éléments mobiles sont extrêmement stables dans les populations bactériennes. Cette stabilité est attribuable à leur intégration au chromosome et à plusieurs composantes qu’ils contiennent, par exemple les systèmes toxine-antitoxine de la cargaison d’ADN variable ou encore le système conservé de partition des éléments excisés. La majorité des gènes portés par les ICE SXT/R391 est contrôlée par leur système de régulation qui se situe au cœur de ce projet doctoral. Ce système de régulation comprend SetR, le répresseur responsable du maintien de l’état quiescent dans lequel l’ICE est intégré au chromosome et est propagé verticalement dans la population bactérienne, c’est-à-dire au rythme de la réplication chromosomique et de la division cellulaire. Lorsque l’ADN bactérien est endommagé, il y a activation de la réponse SOS de réparation de l’ADN par RecA, un facteur de l’hôte, qui induit parallèlement l’autoprotéolyse de SetR, levant ainsi la répression exercée sur les gènes setC et setD. Ces derniers codent pour SetCD, le complexe activateur des ICE SXT/R391 qui active l’expression de la machinerie de conjugaison ainsi que d’autres fonctions codées par ces ICE. Ce projet doctoral a permis l’identification de nouvelles composantes importantes pour la régulation des ICE SXT/R391. Premièrement, nous avons généré par génie génétique plusieurs mutants qui ont permis de caractériser CroS par des essais de transfert conjugatif, de PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) et d’expression avec le gène rapporteur lacZ. Nous avons déterminé que CroS est un régulateur transcriptionnel qui, avec SetR, constitue un interrupteur génétique permettant l’induction du transfert conjugatif dépendante de RecA. Nous avons également validé par gel à retardement la liaison par SetR et CroS d’un site opérateur additionnel. Des essais β galactosidase ont montré que ce site contribue à la répression des gènes croS, setC et setD. De plus, les résultats de ce projet doctoral ont clarifié certains points concernant la régulation par SetCD. Des essais d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à la digestion avec une exonucléase (ChIP-exo) combinés avec le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et la détermination des sites +1 d’initiation de la transcription (5’-RACE et extension d’amorces) ont permis d’établir le régulon de SetCD chez les ICE SXT/R391 et chez les MGI qu’ils mobilisent. La nécessité de SetCD dans la cellule réceptrice pour qu’il y ait intégration de l’ICE de manière site-spécifique dans l’extrémité 5’ du gène prfC a été mise en évidence à l’aide de la construction de mutants, d’essais de transfert conjugatif, de buvardage de type Southern, d’électrophorèse en champs pulsés et de PCR en temps réel. Nous avons également observé, grâce à des essais de PCR quantitatif et d’activité β galactosidase, une boucle de rétroaction positive médiée par l’activation de l’excision et de la réplication de l’ICE par SetCD. En somme, ce projet doctoral a mené à une meilleure compréhension des composantes et des mécanismes en scène pour la gouvernance de cette famille d’ICE qui sont, entres autres, d’importants vecteurs de la dissémination des résistances aux antibiotiques.

Résumé : Le Campylobacter est la première cause de gastro-entérites bactériennes dans les pays industrialisés. La grande majorité des cas sont des infections sporadiques dont la source est rarement identifiée. Le Campylobacter fait partie de la flore intestinale normale d’une large diversité d’animaux et peut également se retrouver dans l’eau. Le but de mon projet de recherche était d’étudier l’épidémiologie clinique et moléculaire des infections à Campylobacter en Estrie afin de déterminer les principales sources d’infections sporadiques et de comparer les génotypes des isolats de Campylobacter selon les différentes niches écologiques. Nous avons déterminé le profil de sensibilité aux antibiotiques d’isolats de différentes sources. Nous avons observé un haut taux de résistance à l’érythromycine et à la tétracycline et un faible taux de résistance à la ciprofloxacine chez les isolats de poulet, pouvant refléter l’utilisation de ces antibiotiques dans cet élevage. Le fait que le taux de résistance à l’érythromycine parmi les isolats humains soit significativement moins élevé que chez les isolats de poulet suggérait l’importance d’autres sources de Campylobacter chez l’humain. Afin de déterminer quelle méthode de typage moléculaire serait la mieux adaptée pour notre devis de recherche, nous avons comparé quatre méthodes (AFLP, MLST, typage du gène fla et EGCP). Seul le MLST a pu attribuer des isolats humains à des niches écologiques particulières comme le poulet, le lait cru et l’eau. Afin d’optimiser la technique de MLST, nous avons développé un système complémentaire basé sur le HRM, qui est beaucoup plus rapide et moins coûteux que le MLST. Nous avons démontré que le HRM a le potentiel de complémenter les méthodes d’analyses basées sur du séquençage pour l’étude des mutations ponctuelles et de faciliter une vaste gamme d’études basées sur des méthodes génotypiques, telle la détection de mutations ponctuelles qui confèrent de la résistance aux antibiotiques. Nous avons entrepris par la suite une étude cas-cas et un vaste projet d’isolement et de caractérisation moléculaire de souches de Campylobacter en Estrie, afin de véritablement cerner les mécanismes de transmission de la bactérie et de comparer les sources d’infections sporadiques chez les cas acquis en régions rurales vs urbaines. Nous avons confirmé que le poulet était responsable de la majorité des cas de campylobactérioses. Cependant, nos résultats suggèrent que la saisonnalité ainsi que le gradient urbain-rural de la campylobactériose sont dus à l’exposition aux souches bovines, particulièrement chez le groupe d’âge des 15-34 ans via l’exposition professionnelle. Par la détermination des sources d’infections, nous avons établi des pistes d’interventions utilisables par les autorités de santé publique, afin de diminuer l’incidence de la campylobactériose au Québec. / Abstract : Campylobacteriosis is the leading notifiable enteric disease in industrialised countries. It colonizes a wide range of animal which in turn spread the disease. The majority of campylobacteriosis cases are sporadic infections for which the source is rarely apparent. The main goal of my research project is to determine contamination sources of Campylobacter in the Eastern Townships, to identify the sources and routes of transmission and to establish the main sources of sporadic infections. We determined antimicrobial susceptibility profiles of Campylobacter isolates in order to predict which bacterial population will be resistant, caused by antimicrobial selective pressure administered to the host. High levels of resistance of chicken isolates to erythromycin and tetracycline, and low levels of resistance to ciprofloxacin reflect the use of the former antibiotics in animal husbandry. The fact that the erythromycin and tetracycline resistance levels were significantly lower among human isolates suggests that other transmission sources are important for human infection. In order to determine which molecular typing method will be the most relevant for our research design, we compared four typing methods (AFLP, MLST,/7a typing and PFGE). Only MLST has the potential to link isolates to a particular ecological niche, such as chicken, raw milk and water. In order to optimize MLST, we developed a complementary system based on HRM. We demonstrated that HRM has the potential to complement the analysis methods based on sequencing for SNP and facilitate a wide range of studies based on genotypic methods. We have subsequently undertaken a major project of isolation and molecular characterization of Campylobacter in the Eastern Townships, in order to truly understand the mechanisms of transmission of the bacteria and determine the source of sporadic cases. We confirmed that chicken was responsible for the majority of cases of campylobacteriosis. However, we have shown that the urban-rural gradient of campylobacteriosis in the Eastern Townships could be explained by exposure to bovine, especially for the 15-34 year old age group through occupational exposure. By the identification of infection sources, we proposed courses of action that could be used by public health authorities to reduce the incidence of campylobacteriosis in Quebec.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le complexe Mycobacterium abscessus (MABSC) fait partie des mycobactéries non tuberculeuses. C’est un pathogène opportuniste environnemental pouvant causer des infections pulmonaires chroniques, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose, et extra-pulmonaires sévères. Il est également résistant à la plupart des antibiotiques, et ne connait pas de traitement efficace. Il se divise en trois sous-espèces : Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense et Mycobacterium subsp. bolletii, Ces trois sous espèces possèdent des différences cliniques et de résistance aux antibiotiques, une identification sûre et rapide est don essentielle. De plus, son épidémiologie reste peu connue, notamment au sein des patients atteints de mucoviscidose.Dans un premier temps, nous avons évalué la performance d’identification au sein du MABSC et la caractérisation des principales résistances du kit Genotype NTM-DR. Celui-ci s’est révélé extrêmement efficace, avec une réussite de 100% d’identification de la sous-espèce mais aussi pour la caractérisation des résistances à la clarithromycine et à l’amikacine, qui sont les antibiotiques recommandés pour le traitement d’une infection à MABSC. Ce kit est donc une alternative rapide et robuste aux principales méthodes d’identification et de caractérisation de la résistance chez MABSC.Dans un second temps, nous avons testé l’efficacité de deux molécules différentes, la clofazimine et la tigecycline, en synergie. Une synergie a pu être mise en évidence sur 42 % des isolats, et la présence de clofazimine a permis d’abaisser la concentration minimale inhibitoire de la tigecycline pour 52 % des isolats. Cette association pourrait constituer une alternative thérapeutique efficace et mieux supportable pour le patient.Enfin, nous avons réalisé deux études épidémiologiques : au Vietnam, chez des patients possédant une condition pulmonaire inflammatoire, et en France, chez des patients atteints de la mucoviscidose dans cinq centres hospitaliers différents. En France, un suivi longitudinal a pu être réalisé sur 7 patients de deux centres différents.Le Vietnam présentait un grand nombre de Sequence Type (ST) nouveaux (29/38) ainsi qu’une grande diversité génotypique (0.72 pour 53 isolats). Une majorité de M. massiliense a été mis en évidence. De plus, des ST responsables d’épidémies dans différents pays ont aussi été retrouvés (ST 23 et ST 117). Trois complexes clonaux ont été identifiés, reflétant la grande diversité du complexe M. abscessus dans ce pays. Deux de ces complexes clonaux étaient constitués de M. abscessus subsp. massiliense contenaient les ST 23 et 117. Le grand nombre de nouveaux génotype est dû au manque de données au Vietnam, il s’agit là de la première étude épidémiologique dans ce pays.En France, on retrouvait un plus grand nombre de sequence type connus (20/31), certainement dû au nombre d’études existantes dans cette région. Une majorité de M. abscessus subsp. abscessus a été retrouvé. Sept sequence type d’importance épidémiologique ont été retrouvés, dont le ST 23. Le suivi longitudinal montre que : le risque d’infection exogène est grand ; le pool de génotypes à Brest est plus important qu’à Montpellier, même si les ST persistent chez un même patient, on ne peut exclure le risque d’une infection exogène. Enfin, l’analyse VNTR des isolats des cinq centres suggère une possible transmission nosocomiale ainsi que la diffusion de génotypes en France.En conclusion, ce travail de thèse a permis d’améliorer l’approche de l’identification et du traitement des infections du complexe M. abscessus, en plus d’explorer et de comparer son épidémiologie dans deux populations différentes. Nous montrons la présence ubiquitaire de certains génotypes d’importance cliniques, une grande diversité génotypique, une variabilité du portage chez le patient mucoviscidose ainsi qu’un risque d’infections exogènes et de transmission chez cette population. / The Mycobacterium abscessus complex is a nontuberculous mycobacteria. It is an environmental opportunistic pathogen that can cause chronic lung infections, especially in patients with cystic fibrosis, and severe extra-pulmonary infections. It is also resistant to most antibiotics, and does not have an effective treatment. It is divided into three subspecies: Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense and Mycobacterium subsp. bolletii, These three subspecies have clinical and antibiotic resistance differences, Thus, a safe and rapid identification is essential. In addition, little is known about its epidemiology, particularly among patients with cystic fibrosis.First, we assessed the identification performance within the M. abscessus complex and the characterization of the main resistances of a commercial assay (Genotype NTM-DR). The kit was highly efficient, with 100% success in identifying the subspecies and also in characterizing resistance to clarithromycin and amikacin, which are the recommended antibiotics for the treatment of complex M. abscessus infection. This kit is therefore a fast and robust alternative to the main methods for identifying and characterizing resistance in the M. abscessus complex.Secondly, we tested the efficacy of two different molecules, clofazimine and tigecycline, in synergy. Synergy was demonstrated in 42% of the isolates, and the presence of clofazimine reduced the minimum inhibitory concentration of tigecycline in 52% of the isolates. This combination could be an effective and more tolerable therapeutic alternative for the patient.Finally, we carried out two epidemiological studies: in Vietnam, in patients with inflammatory lung disease, and in France, in patients with cystic fibrosis in five different hospitals. In France, longitudinal follow-up was carried out on 7 patients from two different centres, Brest and Montpellier. Two different typing tools were used: MLST and VNTR.Vietnam had a large number of new Sequence Type (ST) (29/38) and a high genotypic diversity (0.72 for 53 isolates). A majority of M. abscessus subsp. massiliense was found. In addition, STs responsible for epidemics in different countries have also been found (ST 23 and ST 117). Three clonal complexes have been identified, reflecting the great diversity of the M. abscessus complex in this country. Two of these clonal complexes were composed of M. abscessus subsp. massiliense containing ST 23 and 117. The large number of new genotypes is due to the lack of data in Vietnam, this is the first epidemiological study in this country.In France, there was a greater number of known sequence type (20/31), certainly due to the number of existing studies in this region. A majority of M. abscessus subsp. abscessus was found. Seven sequence type of epidemiological importance were found, including ST 23. Longitudinal monitoring shows a high variability of the ST in Brest compared to Montpellier, which is confirmed by the VNTR. This follow-up shows that: the risk of exogenous infection is high; the genotype pool in Brest is greater than in Montpellier, even if STs persist in the same patient, the risk of exogenous infection cannot be excluded. Finally, the VNTR analysis of isolates from the five centres suggests possible nosocomial transmission and the spread of genotypes in France.In conclusion, this thesis work has improved the approach to the identification and treatment of M. abscessus complex infections, as well as exploring and comparing its epidemiology in two different populations. We show the ubiquitous presence of certain clinically important genotypes, a high genotypic diversity, a variability in carrying in the cystic fibrosis patient as well as a risk of exogenous infections and transmission in this population

Les concentrations sous-inhibitrices (sub-CMI) de antibiotiques jouent un rôle important dans la sélection et le développement des résistances. Contrairement à Escherichia coli, Vibrio cholerae induit la réponse SOS en présence de sub-CMI d'aminosides. SOS est également impliquée dans la plasticité du génome et dans l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Afin de sélectionner des mutants de V. cholerae qui n'induisent pas SOS en présence de sub-CMI d'aminosides, nous avons développé un crible génétique pour l'isolement de mutants dans lesquels l'induction de la réponse SOS est perdue. L'un de ces mutants est inactivé pour le gène radD, qui code pour une hélicase ADN/ARN putative. RadD est impliquée dans la résolution de cassures d'ADN double brin (DSB) provoquées par des sub-CMI de tobramycine. Nous avons montré que les R-loops sont à l'origine des DSB formés en absence de radD en tobramycine. Nous suggérons que les lésions de l'ADN formées lors du traitement par aminoglycosides soient réparées par la formation d'intermédiaires ssDNA induisant SOS. L’ARNPol bloquée sur ces lésions peut faciliter la formation de R-loops qui, si elles ne sont pas réparées, peuvent entraîner la formation de DSB et l'instabilité du génome. RadD pourrait jouer un rôle dans la résolution des R-loops. Ces résultats ont mis en évidence le fait que les sub-CMI de tobramycine conduisent à DSB, dues en partie aux R-loops. La tobramycine est un aminoside qui cible le ribosome. La formation de DSB par un tel antibiotique peut être surprenante car la formation de lésions de l'ADN par un antibiotique qui cible la traduction n'est pas attendue. Afin de comprendre les voies impliquées dans la réponse à de sub-CMI de tobramycine, nous avons adopté une approche Tn-seq à haut débit pour déterminer quels gènes sont importants pour maintenir l'intégrité de la cellule en présence d'antibiotiques à faibles doses. / Sub-inhibitory concentrations (sub-MIC) of antibiotics play an important role in selection and development of resistances. Unlike Escherichia coli, Vibrio cholerae induces its SOS response in presence of sub-MIC aminoglycosides. SOS is also involved in genome plasticity and in the acquisition of resistance to antibiotics. In order to select for V. cholerae mutants that do not induce low aminoglycoside-mediated SOS induction, we developed a genetic screen for the isolation of mutants in which induction of the SOS response by sub-MICs of aminoglycosides is lost. One of these mutants is inactivated for the radD gene, which encodes a putative DNA/RNA helicase. RadD is involved in the resolution of double strand DNA breaks caused by treatment with sub-MIC of tobramycine. We demonstrate that R-loops are at the origin of DSBs formed in the absence of radD in tobramycine.We propose that DNA lesions formed upon aminoglycoside treatment are repaired through the formation of ssDNA intermediates, inducing SOS. RNAP could stalls on these lesions and forms R-loops, that, if not repaired, can lead to the formation of DSB and genome instability. RadD could play a role in the resolution of R-loops. These results highlighted the fact that sub-MIC of tobramycine leads to DNA double strand breaks, at least partly through R-loop formation. Tobramycin is an aminoglycoside that targets the ribosome. The formation of DSBs by such an antibiotic can be surprising as DNA damage formation by an antibiotic that targets translation is not expected. In order to understand the pathways involved in the response to low doses of tobramycin we adopted a high throughput Tn-seq approach to determine which genes are important in maintaining the integrity of the cell in the presence of antibiotics at low doses.

Les systèmes de transduction du signal et les transporteurs ABC contribuent de façon conjointe à la réponse adaptative des bactéries aux changements d'environnement. Trois modules, associant un phosphorelais et un transporteur ABC, ont été répertoriés chez B. subtilis et sont impliqués dans la réponse à différents antibiotiques: BceRSAB, PsdRSAB et YxdJKLM. Ils sont caractérisés par une histidine kinase possédant une boucle extracytoplasmique courte et appartenant à la famille des Intramembrane Sensing - Histidine Kinase (IM-HK) et par un transporteur ABC possédant une Membrane Spanning Domain (MSD) à boucle extracytoplasmique exceptionnellement longue. En utilisant une approche phylogénomique, il a été établi que ce type de modules était restreint aux Firmicutes, où ils sont apparus et se sont largement répandus. De plus, cette analyse met en lumière une histoire évolutive très dynamique impliquant de nombreux transferts horizontaux, duplications et pertes de gènes, conduisant à un répertoire de modules Bce-like très varié chez ce phylum. Grâce à une analyse phylogénétique fine, il a été proposé une classification de ces modules en six sous-familles bien définies. Des études fonctionnelles ont été réalisées sur des membres de la sous-famille IV comprenant le module de résistance à la bacitracine BceRSAB de B. subtilis, dont l'expression des gènes codant pour le transporteur requiert, en présence de l'antibiotique, le système de transduction du signal aussi bien que le transporteur lui-même. Les résultats de ces études montrent que d'autres membres de la sous-famille IV, YtsCD de B. licheniformis et BceAB de B. halodurans, sont également impliqués dans la résistance à la bacitracine. Ils suggèrent aussi que dans ces modules le transporteur ABC est le premier senseur de la présence de l'antibiotique et qu'il active le système de transduction une interaction entre une sous unité du transporteur et la kinase du module. De plus, en présence de bacitracine, l'expression des gènes codant pour le transporteur BceAB ainsi que la résistance à cet antibiotique requièrent la présence de la boucle de la MSD BceB ce qui démontre l'importance de cette boucle aussi bien au niveau fonctionnel que structural. Par ailleurs, l'étude que nous avons réalisée suggère que le mécanisme original de régulation des gènes du transporteur BceAB de B. subtilis pourrait être généralisé à tous les modules équivalents présents chez les Firmicutes. Ces modules constitueraient ainsi un mécanisme important de résistance aux antibiotiques peptidiques chez les bactéries de ce phylum qui comprend de nombreux pathogènes.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques stimule le développement de nouveaux médicaments. Ceux ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation des membranes bactériennes sont de bons candidats puisque les pathogènes y développent plus lentement une résistance. La RMN-ÉS in vivo de membranes naturelles marquées au deutérium (2H) devraient permettre des études plus représentatives des interactions entre les membranes et des agents antimicrobiens ce qui poussera le développement de nouveaux antibiotiques moins susceptibles aux phénomènes de résistance. Le but de ce projet est donc de préparer des bactéries Escherichia coli ayant les lipides membranaires deutérés par incorporation d'acides gras exogènes deutérés pour permettre des études in vivo par 2H RMN-ÉS. Le projet a également pour but d'extraire et purifier des pigments de type marennine pour évaluer leur activité biologique et leurs effets sur les membranes d'E. coli. Nos résultats démontrent qu'une souche sauvage d'E. coli incorpore l'acide palmitique deutéré dans les phospholipides membranaires à un taux de 76% (m/m d'acide gras totaux) permettant un bon rapport signal sur bruit sur les spectres 2H RMN-ÉS. Trois agents antimicrobiens avec des mécanismes d'action différents ont été testés afin de vérifier la réponse des membranes deutérée d'E. coli. Les effets de l'antibiotique polymyxine B étaient cohérents avec la rigidification des membranes, tandis que l'exposition aux nanoparticules de fullerénol a restreint légèrement la dynamique des phospholipides. Le spectre du chlorure de cétyltriméthylammonium révèle la formation d'une phase gel de la membrane. Les interactions entre le modèle développé et les agents antimicrobiens sont en accord avec les mécanismes d'action connus ce qui souligne la justesse de l'analyse in vivo 2H RMN-ÉS d'une souche sauvage d'E. coli pour étudier les mécanismes d'action des agents antimicrobiens et les biomembranes. Le modèle développé a été exposé à l'agent antimicrobien marennine pour vérifier si ce pigment algal extrait de diatomées perturbait les membranes d'E. coli. Les travaux ont permis d'optimiser la croissance des diatomées H. provincialis et d'H. karadagensis en réduisant l'intensité lumineuse, ce qui a assuré la qualité et la quantité du pigment marennine. L'analyse 2H RMN-ÉS indique que la forme externe du pigment extrait d'H. provincialis rigidifie les membranes d'E. coli tandis que la forme interne les fluidifie légèrement ce qui est en accord avec leur propriétés antimicrobiennes respectives connues. Les interactions entre les pigments et les membranes bactériennes sont possiblement la cause de leur action antibiotique. Les formes externes d'H. ostrearia et d'H. karadagensis ont été testées sur les cellules Vero pour déterminer leur cytotoxicité et leur effet antiviral sur le virus HSV-1. Le pigment d'H. karadagensis est moins toxique et a un effet antiviral plus important que le pigment d'H ostrearia ce qui oriente la recherche de nouveaux agents antiviraux sur les pigments d'H karadagensis. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bactérie Gram négatif, interactions membranaires, polymyxine B, fullerène polyhydroxylé, chlorure de cétyltriméthylammonium, pigment de type marennine.