L’océan domine la surface de notre planète et joue un rôle majeur dans la régulation de notre biosphère. Par exemple, les microorganismes photosynthétiques vivant dans l’océan produisent 50% de l’oxygène que nous respirons tous les ans, et une grande partie de notre alimentation et des ressources minérales en proviennent. En cette époque de crise écologique liée à l’accumulation anthropogénique de gaz à effet de serre dans l’atmosphère, il est impératif de développer des énergies plus durables que les carburants fossiles. Le biodiesel pourrait être une source de carburant viable et durable pour remplacer le pétrodiesel mais jusque-là, nos efforts visant à produire des lipides à base de microalgues se sont essentiellement concentrés sur des algues vertes. Dans cette thèse je propose des méthodes pour mieux caractériser une autre catégorie de microalgue : les diatomées. Les diatomées sont une composante importante du phytoplancton et contribuent 40% de la production marine de biomasse primaire. Les diatomées accumulent des lipides en réponse à la carence en nutriments, et même si elles semblent accumuler tout autant de lipides que les microalgues vertes, les voies métaboliques menant à l’accumulation de lipides sont encore peu connues.Dans cette thèse je décris notre caractérisation du glycerolipidome de la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum ainsi que notre étude du remodelage de lipides suite à la carence d’azote ou de phosphate. Des accessions de P. tricornutum isolées dans différentes régions de l’océan ont aussi été étudiées afin de comparer leurs réponses au stress nutritif. Nous avons trouvé que la réponse métabolique menant à l’accumulation de lipides en carence d’azote ou de phosphate est différente. En effet, la carence en azote semble déclencher le recyclage des galactoglycerolipides chloroplastiques ainsi qu’une augmentation de la biosynthèse de novo d’acides gras, alors que la carence en phosphate est plus sévère car nous avons observé une accumulation plus significative de triacylglycerols ainsi que la déplétion totale des phospholipides. De plus, nous avons observé des réponses au stress différentes entre les accessions de P. tricornutum, et en particulier concernant leur capacité à accumuler des lipides. Nous proposons l’hypothèse que ces différences sont liées à leur aptitude à recycler du carbone issu de molécules de stockage non lipidiques.Des approches génomiques ont permis de nombreuses avancées pour mieux comprendre le métabolisme des lipides de microalgues mais notre compréhension des voies de biosynthèse de lipides chez les diatomées est encore limitée. Il y a eu diverses tentatives de caractérisation de la réponse au stress de carence par approche transcriptomique mais l’étude de ces données est incomplète du fait de l’annotation insuffisante des gènes encodant les voies métaboliques pertinentes. Ainsi, dans cette thèse je décris nos tentatives d’annotation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides de P. tricornutum ainsi que les approches d’ingénierie génétique visant à mieux caractériser certains de ces gènes. J’ai également utilisé notre nouvelle annotation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides pour effectuer une étude comparative de plusieurs transcriptomes de P. tricornutum en conditions de carence trouvés dans la littérature. J’ai ainsi pu produire une liste de gènes potentiellement impliqués dans l’accumulation de lipides. Enfin, nous avons pu utiliser ces données pour aider l’interprétation de données génomiques et transcriptomiques issues de la diatomée oléagineuse Fistulifera solaris afin de mieux comprendre comment elle accumule des quantités importantes de lipides pour des applications dans le secteur des biotechnologies et des bioénergies. / The ocean dominates the surface of our planet and plays a major role in regulating the biosphere. For example, the microscopic photosynthetic organisms living in the ocean provide 50% of the oxygen we breathe every year, and much of our food and mineral resources are extracted from the ocean. In a time of ecological crisis linked to the accumulation of anthropogenic greenhouse gases in the atmosphere, we must investigate more sustainable energies than fossil fuels. Much attention has been given to biodiesel but so far most efforts to efficiently produce triacylglycerols in microalgae have focused on green algae. In this thesis I propose approaches to better understand another type of microalgae that is significantly divergent from green lineages: diatoms. Diatoms are a major phylum of phytoplankton in the ocean and account for 40% of marine primary productivity. While diatoms appear to be at least as effective as green algae for producing lipids, the fatty acid and glycerolipid biosynthetic pathways leading to their production have not yet been well characterized. Therefore, I propose to better characterize these pathways in the model diatom Phaeodactylum tricornutum in order to help unlock the potential of diatoms for lipid-based biotechnological applications.In this thesis, I discuss our attempts to establish a reference for the glycerolipidome of P. tricornutum and of our assessment of the lipid remodeling and accumulation that occurs in response to nitrogen- and phosphorus-starvation. A range of accessions of P. tricornutum isolated from different parts of the ocean were also examined to compare their responses to nutrient deprivation. We found that the metabolic response leading to lipid accumulation in different nutrient-deprived conditions are distinct. Nitrogen-deprivation appears to trigger the recycling of chloroplastic galactoglycerolipids as well as a strong increase in de novo fatty acid synthesis while the response to phosphorus-deprivation was more severe as we observed a higher triacylglycerol pool and the complete depletion of phospholipids. Furthermore, we observed several differences among accessions of P. tricornutum regarding their ability to accumulate triacylglycerol in response to nutrient starvation and propose the hypothesis that these differences are linked to their ability to recycle intracellular carbon from non-lipid storage molecules.Genome-enabled approaches have also allowed significant steps towards elucidating the lipid metabolism of microalgae in the past decade, but our understanding of diatom metabolic pathways is still limited compared to that of other microalgae and higher plants. There have been several attempts to characterize the stress response in P. tricornutum by using transcriptomic approaches but this data is difficult to exploit to its full potential without a better annotation of genes encoding the relevant pathways. Therefore, in this thesis I discuss our attempts to annotate P. tricornutum lipid metabolism genes. Based on this annotation I have attempted to better characterize a selection of genes by genetic engineering and have pursued a comparative study of several published transcriptomes of P. tricornutum in nutrient deprived conditions to produce a list of candidate genes likely to be involved in triacylglycerol accumulation. Finally, we used this data to help interpret genome and transcriptome data of the newly sequenced oleaginous diatom Fistulifera solaris to help understand how it accumulates unusually high amounts of triacylglycerol for applications in the biotechnology and bioenergy industry.

Le microphytobenthos (MPB) des latitudes tempérées est dominé par les diatomées. Deux grands groupes se distinguent, les épipéliques (mobiles) des sédiments vaseux, et les épipsammiques (fixées) des sédiments sablo-vaseux. Afin de mieux comprendre la production des vasières, le MPB a été étudié par des approches du niveau physiologique au niveau écologique. Dans un premier temps, l’étude s’est focalisée sur des expérimentations en laboratoire. La réponse des différents groupes à la lumière a montré que la forme de vie et la mobilité sont en lien étroit avec la capacité de photoprotection physiologique. Ainsi, les diatomées non-mobiles présentent une meilleure photoprotection physiologique que les diatomées mobiles qui peuvent fuir les excès de lumière. Dans une deuxième partie, le travail s’est effectué sur des échantillons ramenés en laboratoire. Des profils de migrations ont été réalisés par mesure continue de la fluorescence. Il a été établi que le MPB présente un rythme de migration interne pouvant être modulé par la lumière. De plus la qualité de la lumière modifie les profils de migration. Il est communément admis que les phases de division cellulaire se dérouleraient en profondeur. La cytométrie en flux permet de vérifier cette hypothèse. Finalement les mesures effectuées en laboratoire ont été comparées à des mesures effectuées directement sur le terrain à l’échelle de la communauté. Il a ainsi pu être vérifié que la photoprotection sous lumière fluctuante est fonction de la population. Pour les populations épipéliques, la photoprotection physiologique ne varie pas au cours des fluctuations lumineuses, laissant supposer que la migration module ces fluctuations. Les populations épipsammiques, quant à elles, modifient leur réponse physiologique en fonction des fluctuations lumineuses. / Microphytobentos (MPB) from temperate latitude is mainly composed of diatoms. Those microorganisms can be separated in two groups: the epipelic one from muddy sediments (composed of mobile diatoms) and the epipsammic one from sandy-muddy sediments (composed of diatoms living attached to their substrate). In order to investigate mudflats’ primary production, the MPB compartment was studied through diverse approaches from the physiological level to the ecological one. In the first place, laboratory experiments (in vitro experiments), focusing on light reaction of epipelic and epipsammic diatoms, showed that their life form and their mobility were strongly connected to their physiological photoprotection ability. Thereby, the motionless diatoms were characterized by higher physiological photoprotection abilities than the mobile ones, which could avoid excess of light. In the second place, the fluorescence of collected samples (in vivo experiments) was measured to acquire diatoms’ migration profiles. The results pointed out an internal and light-regulated migration pattern of the MPB and furthermore highlighted the effect of light quality on migration profiles. Besides, the commonly accepted hypothesis of deep cell division phases was tested and confirmed through flow cytometry experiments. Eventually, laboratory measurements were compared to in situ ones realized at the scale of the whole community. These comparisons revealed that diatoms photoprotection in fluctuating light depended on the targeted populations. Epipelic organisms were indeed characterized by an unvarying photoprotection, diatoms migration regulating alone the effect of light fluctuations. On the contrary, motionless epipsammic populations required a light-regulated photoprotection.

Haslea ostrearia est une diatomée cosmopolite pouvant proliférer en milieu naturel et dont les efflorescences sont particulièrement fréquentes dans les claires à huîtres de la côte Atlantique française. Cette diatomée produit la marennine, un pigment bleu-vert hydrosoluble connu pour induire le verdissement des branchies des huîtres, augmentant ainsi leur valeur marchande. La marennine présente des activités allélopathiques, antioxydantes ou encore antibactériennes in vitro et son utilisation en aquaculture a été envisagée suite à la mise en évidence d’effets prophylactiques chez des bivalves. Les objectifs de ce doctorat étaient 1) d’identifier les effets de ce pigment sur la croissance des bactéries du genre Vibrio, fréquemment impliquées dans la mortalité massive de bivalves et 2) de s’assurer de son innocuité sur des organismes marins (e.g. mollusques, échinodermes). Nos résultats sur la croissance bactérienne ont montré que les relations dose-effet ne présentaient pas systématiquement une tendance linéaire et également que la marennine pouvait totalement inhiber ou bien stimuler la croissance de Vibrio en fonction de la souche testée. De plus, des concentrations écologiquement pertinentes ont induit des effets négatifs sur la survie et le développement d’animaux marins. Ces effets indésirables n’ont cependant été observés que chez des stades fragiles de développement tels que les embryons et les larves. Enfin, nos résultats questionnent l’utilisation de H. ostrearia en aquaculture et soulignent la nécessité d’établir des doses seuils d'exposition afin de prévenir tout effet indésirable, tout en bénéficiant des effets prophylactiques de la marennine. / Blooms of the diatom Haslea ostrearia are recorded worldwide in marine environments and occur frequently in oyster ponds in the Western French coast. This diatom produces a blue-green water soluble pigment named marennine that is known to turn oyster gills green, which provides a higher market value to the bivalves. Although H. ostrearia has been identified centuries ago, little is known about the ecological significance of the blue pigment. Marennine displays allelopathic, antioxidant or antibacterial activities in vitro and its use in aquaculture was considered as some prophylactic effects were demonstrated on farmed shellfish. The aims of this thesis were thus 1) to further identify the effects of this pigment on the growth of bacteria from the genus Vibrio that are frequently involved in bivalve mass mortality and 2) to ensure its safety on marine organisms (e.g. molluscs, crustaceans, echinoderms). Our results on bacterial growth demonstrated that the dose-response curves did not systematically present a linear pattern (e.g. “U shape”, hormetic responses) and that marennine could either totally inhibit the growth of Vibrio or stimulate it depending on the strain tested. Also, ecologically relevant doses could impair the survival and the development of the marine organisms tested. Such noxious effects seemed to only target early and fragile developmental stages as embryos and larvae, while adults appeared unaffected. Finally, our results question the exploitation of H. ostrearia in aquaculture and highlight the need to set exposure threshold doses to prevent any adverse effects but to benefit from the prophylactic strategy resulting from the use of marennine.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques stimule le développement de nouveaux médicaments. Ceux ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation des membranes bactériennes sont de bons candidats puisque les pathogènes y développent plus lentement une résistance. La RMN-ÉS in vivo de membranes naturelles marquées au deutérium (2H) devraient permettre des études plus représentatives des interactions entre les membranes et des agents antimicrobiens ce qui poussera le développement de nouveaux antibiotiques moins susceptibles aux phénomènes de résistance. Le but de ce projet est donc de préparer des bactéries Escherichia coli ayant les lipides membranaires deutérés par incorporation d'acides gras exogènes deutérés pour permettre des études in vivo par 2H RMN-ÉS. Le projet a également pour but d'extraire et purifier des pigments de type marennine pour évaluer leur activité biologique et leurs effets sur les membranes d'E. coli. Nos résultats démontrent qu'une souche sauvage d'E. coli incorpore l'acide palmitique deutéré dans les phospholipides membranaires à un taux de 76% (m/m d'acide gras totaux) permettant un bon rapport signal sur bruit sur les spectres 2H RMN-ÉS. Trois agents antimicrobiens avec des mécanismes d'action différents ont été testés afin de vérifier la réponse des membranes deutérée d'E. coli. Les effets de l'antibiotique polymyxine B étaient cohérents avec la rigidification des membranes, tandis que l'exposition aux nanoparticules de fullerénol a restreint légèrement la dynamique des phospholipides. Le spectre du chlorure de cétyltriméthylammonium révèle la formation d'une phase gel de la membrane. Les interactions entre le modèle développé et les agents antimicrobiens sont en accord avec les mécanismes d'action connus ce qui souligne la justesse de l'analyse in vivo 2H RMN-ÉS d'une souche sauvage d'E. coli pour étudier les mécanismes d'action des agents antimicrobiens et les biomembranes. Le modèle développé a été exposé à l'agent antimicrobien marennine pour vérifier si ce pigment algal extrait de diatomées perturbait les membranes d'E. coli. Les travaux ont permis d'optimiser la croissance des diatomées H. provincialis et d'H. karadagensis en réduisant l'intensité lumineuse, ce qui a assuré la qualité et la quantité du pigment marennine. L'analyse 2H RMN-ÉS indique que la forme externe du pigment extrait d'H. provincialis rigidifie les membranes d'E. coli tandis que la forme interne les fluidifie légèrement ce qui est en accord avec leur propriétés antimicrobiennes respectives connues. Les interactions entre les pigments et les membranes bactériennes sont possiblement la cause de leur action antibiotique. Les formes externes d'H. ostrearia et d'H. karadagensis ont été testées sur les cellules Vero pour déterminer leur cytotoxicité et leur effet antiviral sur le virus HSV-1. Le pigment d'H. karadagensis est moins toxique et a un effet antiviral plus important que le pigment d'H ostrearia ce qui oriente la recherche de nouveaux agents antiviraux sur les pigments d'H karadagensis. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bactérie Gram négatif, interactions membranaires, polymyxine B, fullerène polyhydroxylé, chlorure de cétyltriméthylammonium, pigment de type marennine.

Parmi les milliers d'espèces de phytoplancton connues on retrouve le genre Pseudo-nitzschia. Sur les 37 espèces actuellement décrites (et seulement 28 testées), 14 sont capables de produire une toxine amnésiante, l'acide domoïque, mortelle pour l'être humain mais aussi pour les oiseaux et mammifères marins. La production d'acide domoïque dépend non seulement des espèces, mais aussi des souches et de leur environnement. Pour mieux comprendre quand et pourquoi cette toxine est produite, il apparait donc important de s'intéresser à la physiologie de la cellule. Le but de cette thèse était de tester l'effet de différents facteurs biotiques et abiotiques non seulement sur la production d'acide domoïque mais aussi sur la physiologie des cellules. L'effet de la compétition avec les bactéries et une autre diatomée a été testé sur Pseudo-nitzschia sp., ainsi que la limitation en fer et/ou cuivre ou l'ajout de doses toxiques de cuivre.

Les éléments génétiques transposables (ET) sont des séquences d’ADN capables de se déplacer dans tous lesgénomes sous certaines conditions. Les ET ont des structures et des modes de transposition qui lesdifférencient en plusieurs groupes. Les éléments de la famille mariner sont ubiquistes ; lorsqu’ils sont actifs, ilsproduisent une transposase qui coupe l’élément et l’insère dans un autre locus. Des fragments d’éléments detype mariner (MLE) ont été précédemment identifiés chez la diatomée marine Amphora acutiuscula et ils semblaientactifs en condition de stress thermiques. Les diatomées sont caractérisées par une paroi siliceuse ornementée et,dans le milieu marin, elles jouent un rôle primordial dans les chaînes alimentaires.Dans le présent travail, par des méthodes de biologie moléculaire et de bioinformatique, nous avons recherché et caractérisé des MLE complets, et précisé leur activité en conditions de chocs thermiques et métalliques (cuivre et zinc). L’analyse des séquences amplifiées a mis en évidence la présence de MLE particuliers chez cette diatomée qui code une transposase ayant une triade catalytique DD43D jamais décrite jusqu’à présent.L’analyse phylogénétique place les MLE de diatomées dans une sousfamille différente mais proche de celle desMLE de plantes. Parmi les nombreuses copies de MLEprésentes dans le génome d’A. acutiuscula, certaines sont exprimées lorsque la diatomée est placée pendant 2 à 5 heures à unetempérature inférieure à sa température de culture. Par contre, l’expression des MLE n’a pas été mise en évidence chez cette espèce soumise aux stress métalliques appliqués. / Transposable elements (TE) are DNA sequences able to move in all genomes depending on conditions. TE have different structures and transposition mechanisms. Tc1-mariner elements are ubiquist ; when they are active, they produce a transposase which cuts and inserts the element into another locus. Fragments of mariner-like elements (MLE) hadpreviously been identified in the marine diatom Amphora acutiuscula and they seemed active under thermal stress. Diatoms are characterized by a siliceous ornamented cell wall and, in the ocean, they play a major role in trophic networks.In this work, with biomolecular and bioinformatic methods, we have searched for and characterized full length MLE, and precised their activity under thermal and metal (copper and zinc) stresses. The analyse of the DNA sequences obtained highlighted that MLE in diatoms are particular and that they encode a transposase which has a DD43D catalytic triad neverso far depicted. The phylogenetic analyse arranged diatom MLE in a subfamily different and close to that of plant MLE. Among the numerous MLE copies present in the genome of A.acutiuscula, some were expressed when the microalga was put at a lower temperature than the culture temperature for 2 to 5 hours. Conversely, metal stresses we applied did notinduce MLE expression in this species.

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Différentes approches ont été utilisées pour évaluer les effets de deux formes de nanoparticules de carbone (NPC), nanotubes et graphène, afin de comprendre les mécanismes de la réponse générée par la diatomée benthique d'eau douce Nitzschia palea. Les effets à l'échelle de la communauté ont démontré un impact temporaire sur la croissance du biofilm et une accumulation des NPC dans la matrice extracellulaire. L'application d'une étude transcriptomique a mis en évidence l'importance de l'interaction physique, à l'origine d'altération du frustule, dans la mise en place de cette réponse extracellulaire se traduisant par une surproduction des substances exo-polymériques (EPS). Cette approche a également révélé l'impact des NPC sur l'activité photosynthétique des diatomées et une modification du métabolisme énergétique, suggérant une allocation énergétique en faveur de la production d'EPS. L'étude du protéome extracellulaire a permis d'avoir un premier aperçu de la composition de la matrice extracellulaire, principalement constituée de protéines à caractère hydrophobe. Lors de l'exposition aux NPC, les diatomées semblent produire un système adhésif complexe permettant de renforcer la matrice extracellulaire et d'augmenter la stabilité du biofilm tout en piégeant les NPC. L'exposition des diatomées face au deux formes de NPC induit une réponse présentant une forte similitude notamment pour les plus fortes concentrations testées. / Different approaches were used to assess the effect of two forms of carbon-based nanoparticles (CNP) nanotubes and graphene, in order to determine the mechanism of the response generated by the benthic freshwater diatom Nitzschia palea. The effect at the cellular community scale demonstrated a temporary impact on biofilm growth and an accumulation of NPC in the extracellular matrix. The use of transcriptomic study evidenced the role of the physic interaction, causing alteration of the frustule, in the extracellular response leading to an overexcretion of exopolymeric substances (EPS). This approach also revealed the impact of NPC on the photosynthetic activity of diatoms and a modification of the energetic metabolism suggesting an energetic allocation for the EPS production. The study of the extracellular proteome allowed to have a first insight of the extracellular matrix composition, in majority composed of hydrophobic-like proteins. In NPC exposure, diatoms seemed to produce an adhesive system allowing to strengthen the extracellular matrix and increase the biofilm stability while trapping NPC. The exposition of diatoms to the two NPC forms induce a response greatly similar for the highest tested concentration.