Le but de ce travail de doctorat est d’évaluer la possibilité d’utiliser Haslea ostrearia et la marennine en ostréiculture. Les objectives de ce projet sont : (1) l'évaluation du comportement alimentaire de l'huître creuse Crassostrea gigas sur des cellules d’H. ostrearia de différentes tailles et les conséquences potentielles sur les populations algales; (2) la caractérisation du verdissement par la marennine et ses conséquences sur la physiologie de C. gigas; (3) les conséquences du verdissement sur les traits comportementaux, physiologiques et biochimiques de plusieurs espèces de bivalves; (4) l'utilisation conjuguée d’H. ostrearia avec d'autres microalgues d’importance en aquaculture. Nos résultats suggèrent que la taille des cellules affecte considérablement le processus de selection d’H. ostrearia par l’huître. Cette étude démontre également que la forme extracellulaire de la marenninne contribue significativement au verdissement dans les mucocytes des branchies. Mis à part le verdissement des organes palléaux des bivalves, une concentration modérée de marennine (2 mg L-1) affecte les performances comportementales, physiologiques et biochimiques des bivalves. Néanmoins, ces effets pourraient être compensés par ses activités biologiques comme agent antibactérien naturel et source d’alimentation mixte d’algues en conchyliculture. / This Ph.D. thesis focuses on several assessments to achieve the optimum benefit of utilization of marennine in the field of aquaculture. The study covers: (1) the assessment in feeding behavior of the Pacific oyster Crassostrea gigas on different sizes of Haslea ostrearia and its ecological consequence; (2) the characterization of the greening by marennine and its consequences on some physiological traits of on C. gigas. (3) the consequence of greening by marennine on behavioral, physiological and biochemical traits of bivalves; (4) the utilization of H. ostrearia and marennine in a combination diet with other microalgae relevant to aquaculture.Our results suggest that cell size impacts considerably the selection process of H. ostrearia by oyster. This study also demonstrates that the extracellular form of marennine contributes significantly to the greening in the mucocytes of the gills. Apart from greening the pallial organs of bivalves, marennine (2 mg L-1) affects the behavioural, physiological and biochemical performance. Nevertheless, these effects can be compensated for its biological activities such as natural antibacterial agent and use as a mixed algal diet for bivalve aquaculture.

La diatomée Haslea ostrearia a longtemps été considérée comme le seul organisme apte à produire un pigment surnuméraire bleu nommé marennine, connu pour son rôle dans le verdissement des branchies des huîtres affinées dans les bassins ostréicoles. Certains des mécanismes et facteurs influençant l’entrée de cette diatomée en phase de reproduction sexuée (auxosporulation) ont été mis en évidence, tels la concentration cellulaire, la qualité de l’éclairement incident, ou le préconditionnement des algues. La découverte dans le cadre d’un projet européen, de populations de diatomées apparentées à H. ostrearia en divers points du globe a conduit à la description et l’identification de trois nouvelles espèces de diatomées bleues : Haslea silbo sp. nov. des îles Canaries, Haslea karadagensis sp. nov., provenant de Mer Noire et Haslea provencialis sp. nov. de Méditerranée Occidentale. La première phylogénie moléculaire de ces espèces de diatomées bleues, ainsi que d’autres espèces de diatomées appartenant au genre Haslea, a été réalisée en utilisant trois marqueurs génétiques, la cassette ribosomale ITS1-5,8S-ITS2, le gène chloroplastique rbcL ainsi qu’un fragment du gène mitochondrial cox1. Ces trois marqueurs moléculaires montrent que les diatomées bleues forment un clade distinct au sein du genre Haslea. De plus, l’existence de deux populations d’H. ostrearia originaires des côtes françaises et suédoises sexuellement compatibles a permis d’étudier la variabilité génétique intraspécifique, en mettant en évidence quelques différences au niveau de la séquence du gène cox1. Ces différences ont également permis d’étudier chez la progéniture obtenue par croisements de ces populations, la répartition et l’héritabilité de l’ADN mitochondrial. Par ailleurs, la spectophotométrie UV-visible et la spectométrie Raman ont été utilisées pour poursuivre la caractérisation physico-chimique des pigments bleus de ces diatomées. L’existence de pigments distincts chez les nouvelles espèces de diatomées bleues a permis de proposer une première classification chimiotaxonomique. Enfin, les activités biologiques de la marennine et du pigment de l’espèce ukrainienne, H. karadagensis, ont été étudiées grâce à la détermination de leurs propriétés antibactériennes et antivirales. / The diatom Haslea ostrearia has long been considered as the only organism able to produce a blue pigment called marennine, known for greening oysters’ gills in fattening ponds. Key factors for the triggering of this diatom’s sexual reproduction (auxosporulation) have been evidenced, such as cell concentration, light quality or light conditioning. In the aim of a European project, new species of blue diatoms have been discovered : Haslea silbo sp. nov. from the Canary Islands, Haslea karadagensis sp. nov. from the Black Sea and Haslea provincialis sp. nov. from the Mediterranean Sea. A first molecular phylogeny of the genus Haslea has been made using three markers : ITS1-5.8S-ITS2, rbcL and cox1. Blue diatoms appeared to belong to a distinct cluster inside the genus. Availability of two H. ostrearia populations from France and Sweden, sexually compatibles but bearing differences in their cox1 sequences allowed studying the distribution and inheritance of the mitochondrial DNA during auxosporulation. Moreover, UV-visible spectrophotometry and Raman spectometry have been used for pigments’ characterization. Existence of distinct pigments in the newly described species led to the proposal of a chemotaxonomic classification. Finally, biological activities of marennine and H. karadagensis’ pigments have been studied in regards of their antibacterial and antiviral properties.

Haslea ostrearia est une diatomée cosmopolite pouvant proliférer en milieu naturel et dont les efflorescences sont particulièrement fréquentes dans les claires à huîtres de la côte Atlantique française. Cette diatomée produit la marennine, un pigment bleu-vert hydrosoluble connu pour induire le verdissement des branchies des huîtres, augmentant ainsi leur valeur marchande. La marennine présente des activités allélopathiques, antioxydantes ou encore antibactériennes in vitro et son utilisation en aquaculture a été envisagée suite à la mise en évidence d’effets prophylactiques chez des bivalves. Les objectifs de ce doctorat étaient 1) d’identifier les effets de ce pigment sur la croissance des bactéries du genre Vibrio, fréquemment impliquées dans la mortalité massive de bivalves et 2) de s’assurer de son innocuité sur des organismes marins (e.g. mollusques, échinodermes). Nos résultats sur la croissance bactérienne ont montré que les relations dose-effet ne présentaient pas systématiquement une tendance linéaire et également que la marennine pouvait totalement inhiber ou bien stimuler la croissance de Vibrio en fonction de la souche testée. De plus, des concentrations écologiquement pertinentes ont induit des effets négatifs sur la survie et le développement d’animaux marins. Ces effets indésirables n’ont cependant été observés que chez des stades fragiles de développement tels que les embryons et les larves. Enfin, nos résultats questionnent l’utilisation de H. ostrearia en aquaculture et soulignent la nécessité d’établir des doses seuils d'exposition afin de prévenir tout effet indésirable, tout en bénéficiant des effets prophylactiques de la marennine. / Blooms of the diatom Haslea ostrearia are recorded worldwide in marine environments and occur frequently in oyster ponds in the Western French coast. This diatom produces a blue-green water soluble pigment named marennine that is known to turn oyster gills green, which provides a higher market value to the bivalves. Although H. ostrearia has been identified centuries ago, little is known about the ecological significance of the blue pigment. Marennine displays allelopathic, antioxidant or antibacterial activities in vitro and its use in aquaculture was considered as some prophylactic effects were demonstrated on farmed shellfish. The aims of this thesis were thus 1) to further identify the effects of this pigment on the growth of bacteria from the genus Vibrio that are frequently involved in bivalve mass mortality and 2) to ensure its safety on marine organisms (e.g. molluscs, crustaceans, echinoderms). Our results on bacterial growth demonstrated that the dose-response curves did not systematically present a linear pattern (e.g. “U shape”, hormetic responses) and that marennine could either totally inhibit the growth of Vibrio or stimulate it depending on the strain tested. Also, ecologically relevant doses could impair the survival and the development of the marine organisms tested. Such noxious effects seemed to only target early and fragile developmental stages as embryos and larvae, while adults appeared unaffected. Finally, our results question the exploitation of H. ostrearia in aquaculture and highlight the need to set exposure threshold doses to prevent any adverse effects but to benefit from the prophylactic strategy resulting from the use of marennine.

La diatomée Haslea ostrearia a longtemps été considérée comme le seul organisme apte à produire un pigment surnuméraire bleu nommé marennine, connu pour son rôle dans le verdissement des branchies des huîtres affinées dans les bassins ostréicoles. Certains des mécanismes et facteurs influençant l'entrée de cette diatomée en phase de reproduction sexuée (auxosporulation) ont été mis en évidence, tels la concentration cellulaire, la qualité de l'éclairement incident, ou le préconditionnement des algues. La découverte dans le cadre d'un projet européen, de populations de diatomées apparentées à H. ostrearia en divers points du globe a conduit à la description et l'identification de trois nouvelles espèces de diatomées bleues : Haslea silbo sp. nov. des îles Canaries, Haslea karadagensis sp. nov., provenant de Mer Noire et Haslea provencialis sp. nov. de Méditerranée Occidentale. La première phylogénie moléculaire de ces espèces de diatomées bleues, ainsi que d'autres espèces de diatomées appartenant au genre Haslea, a été réalisée en utilisant trois marqueurs génétiques, la cassette ribosomale ITS1-5,8S-ITS2, le gène chloroplastique rbcL ainsi qu'un fragment du gène mitochondrial cox1. Ces trois marqueurs moléculaires montrent que les diatomées bleues forment un clade distinct au sein du genre Haslea. De plus, l'existence de deux populations d'H. ostrearia originaires des côtes françaises et suédoises sexuellement compatibles a permis d'étudier la variabilité génétique intraspécifique, en mettant en évidence quelques différences au niveau de la séquence du gène cox1. Ces différences ont également permis d'étudier chez la progéniture obtenue par croisements de ces populations, la répartition et l'héritabilité de l'ADN mitochondrial. Par ailleurs, la spectophotométrie UV-visible et la spectométrie Raman ont été utilisées pour poursuivre la caractérisation physico-chimique des pigments bleus de ces diatomées. L'existence de pigments distincts chez les nouvelles espèces de diatomées bleues a permis de proposer une première classification chimiotaxonomique. Enfin, les activités biologiques de la marennine et du pigment de l'espèce ukrainienne, H. karadagensis, ont été étudiées grâce à la détermination de leurs propriétés antibactériennes et antivirales.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques stimule le développement de nouveaux médicaments. Ceux ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation des membranes bactériennes sont de bons candidats puisque les pathogènes y développent plus lentement une résistance. La RMN-ÉS in vivo de membranes naturelles marquées au deutérium (2H) devraient permettre des études plus représentatives des interactions entre les membranes et des agents antimicrobiens ce qui poussera le développement de nouveaux antibiotiques moins susceptibles aux phénomènes de résistance. Le but de ce projet est donc de préparer des bactéries Escherichia coli ayant les lipides membranaires deutérés par incorporation d'acides gras exogènes deutérés pour permettre des études in vivo par 2H RMN-ÉS. Le projet a également pour but d'extraire et purifier des pigments de type marennine pour évaluer leur activité biologique et leurs effets sur les membranes d'E. coli. Nos résultats démontrent qu'une souche sauvage d'E. coli incorpore l'acide palmitique deutéré dans les phospholipides membranaires à un taux de 76% (m/m d'acide gras totaux) permettant un bon rapport signal sur bruit sur les spectres 2H RMN-ÉS. Trois agents antimicrobiens avec des mécanismes d'action différents ont été testés afin de vérifier la réponse des membranes deutérée d'E. coli. Les effets de l'antibiotique polymyxine B étaient cohérents avec la rigidification des membranes, tandis que l'exposition aux nanoparticules de fullerénol a restreint légèrement la dynamique des phospholipides. Le spectre du chlorure de cétyltriméthylammonium révèle la formation d'une phase gel de la membrane. Les interactions entre le modèle développé et les agents antimicrobiens sont en accord avec les mécanismes d'action connus ce qui souligne la justesse de l'analyse in vivo 2H RMN-ÉS d'une souche sauvage d'E. coli pour étudier les mécanismes d'action des agents antimicrobiens et les biomembranes. Le modèle développé a été exposé à l'agent antimicrobien marennine pour vérifier si ce pigment algal extrait de diatomées perturbait les membranes d'E. coli. Les travaux ont permis d'optimiser la croissance des diatomées H. provincialis et d'H. karadagensis en réduisant l'intensité lumineuse, ce qui a assuré la qualité et la quantité du pigment marennine. L'analyse 2H RMN-ÉS indique que la forme externe du pigment extrait d'H. provincialis rigidifie les membranes d'E. coli tandis que la forme interne les fluidifie légèrement ce qui est en accord avec leur propriétés antimicrobiennes respectives connues. Les interactions entre les pigments et les membranes bactériennes sont possiblement la cause de leur action antibiotique. Les formes externes d'H. ostrearia et d'H. karadagensis ont été testées sur les cellules Vero pour déterminer leur cytotoxicité et leur effet antiviral sur le virus HSV-1. Le pigment d'H. karadagensis est moins toxique et a un effet antiviral plus important que le pigment d'H ostrearia ce qui oriente la recherche de nouveaux agents antiviraux sur les pigments d'H karadagensis. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bactérie Gram négatif, interactions membranaires, polymyxine B, fullerène polyhydroxylé, chlorure de cétyltriméthylammonium, pigment de type marennine.