Évolution expérimentale aux limites de l'extinction : Le cas de Pseudomonas fluorescens soumise au stress. Les stress environnementaux : ces perturbations d'origine biotiques ou abiotiques des conditions de vie qui ont un impact sur les populations par l'altération des capacités de reproduction et/ou de survie des organismes, peuvent parfois mener une espèce à l'extinction si celle-ci n'est pas en mesure de s'adapter suffisamment rapidement. Avec l'augmentation de l'impact des activités humaines, le taux d'extinction des espèces est aujourd'hui estimé être de plusieurs ordres de grandeur au dessus du taux d'extinction basal. Il est donc important de comprendre les facteurs écologiques et évolutifs, à l'échelle de l'espèce comme de la communauté, qui déterminent la survie ou l'extinction d'une espèce soumise à un stress sévère.Au cours de cette thèse, nous utiliserons les outils de l'évolution expérimentale avec la bactérie Pseudomonas fluorescens soumise à un stress antibiotique, ainsi que des outils théoriques, pour étudier les facteurs déterminants les conditions d'un sauvetage évolutif : événement d'évolution rapide d'une population en situation d'effondrement démographique sous l'effet d'un stress létal. Nous étudierons aussi le rôle d'un stress plus modérés : une carence en ressource, sur deux aspects de la structure des communautés liés à la stabilité de ces dernières face aux perturbations environnementales : La topologie d'un réseau trophique bactérie-phage, ainsi que la distribution des tailles de populations, décrite par la loi de Taylor, pour des populations bactériennes en mono-culture ou en compétition sur un gradient de ressource. Nos travaux ont permis de mieux comprendre le sauvetage évolutif, en montrant notamment le rôle déterminant de la taille des populations et de leur diversité génétique initiale dans la capacité d'adaptation à un stress létal. Mais aussi en proposant une meilleure description des dynamiques de populations typiques de cette situation. Nous avons aussi montré la capacité d'une limitation des ressources à altérer la structure des réseaux trophiques et ainsi leur stabilité face aux perturbations. / Experimental Evolution at the Edge of Extinction, The Case of Pseudomonas fluorescens in Stressful Environments.Environmental stresses : the biotic or abiotic perturbations of life conditions which have an impact on populations through impaired organism's ability to survive and/or reproduce, can sometimes result in species extinction if rapid evolutionary adaptation doesn't occur. With the increasing impact of human activities, the rate of species extinction is now estimated to be several orders of magnitudes above the background rate. It is therefore crucial to understand the ecological and evolutionary factors, at species and community levels, which determine the survival or extinction of species exposed to severe stresses. All along this thesis, we will use experimental evolution tools with the bacterium Pseudomonas fluorescens exposed to antibiotic stress, as well as theoretical tools, to study the factors driving evolutionary rescue : the rapid evolutionary adaptation occurring in populations experiencing demographic collapse under a lethal stress. Then we will study how a moderate stress (low resource availability) drives different aspects of communities structure related to their stability against environmental perturbations : The topology of a bacteria-bacteriophage trophic network, and the distribution of population sizes along a resource gradient, described by Taylor's law, for bacterial populations either in mono-culture or in competition. Our results led to a better understanding of evolutionary rescues. In particular, we show the crucial role of initial population size and genetic diversity in the ability to evolve adaptation to an initially lethal stress. And we refined the description of populations dynamics in such cases. We show also how resource limitation can disturb trophic network structure, resulting in a lower stability against environmental perturbations.

Le complexe Mycobacterium abscessus (MABSC) fait partie des mycobactéries non tuberculeuses. C’est un pathogène opportuniste environnemental pouvant causer des infections pulmonaires chroniques, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose, et extra-pulmonaires sévères. Il est également résistant à la plupart des antibiotiques, et ne connait pas de traitement efficace. Il se divise en trois sous-espèces : Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense et Mycobacterium subsp. bolletii, Ces trois sous espèces possèdent des différences cliniques et de résistance aux antibiotiques, une identification sûre et rapide est don essentielle. De plus, son épidémiologie reste peu connue, notamment au sein des patients atteints de mucoviscidose.Dans un premier temps, nous avons évalué la performance d’identification au sein du MABSC et la caractérisation des principales résistances du kit Genotype NTM-DR. Celui-ci s’est révélé extrêmement efficace, avec une réussite de 100% d’identification de la sous-espèce mais aussi pour la caractérisation des résistances à la clarithromycine et à l’amikacine, qui sont les antibiotiques recommandés pour le traitement d’une infection à MABSC. Ce kit est donc une alternative rapide et robuste aux principales méthodes d’identification et de caractérisation de la résistance chez MABSC.Dans un second temps, nous avons testé l’efficacité de deux molécules différentes, la clofazimine et la tigecycline, en synergie. Une synergie a pu être mise en évidence sur 42 % des isolats, et la présence de clofazimine a permis d’abaisser la concentration minimale inhibitoire de la tigecycline pour 52 % des isolats. Cette association pourrait constituer une alternative thérapeutique efficace et mieux supportable pour le patient.Enfin, nous avons réalisé deux études épidémiologiques : au Vietnam, chez des patients possédant une condition pulmonaire inflammatoire, et en France, chez des patients atteints de la mucoviscidose dans cinq centres hospitaliers différents. En France, un suivi longitudinal a pu être réalisé sur 7 patients de deux centres différents.Le Vietnam présentait un grand nombre de Sequence Type (ST) nouveaux (29/38) ainsi qu’une grande diversité génotypique (0.72 pour 53 isolats). Une majorité de M. massiliense a été mis en évidence. De plus, des ST responsables d’épidémies dans différents pays ont aussi été retrouvés (ST 23 et ST 117). Trois complexes clonaux ont été identifiés, reflétant la grande diversité du complexe M. abscessus dans ce pays. Deux de ces complexes clonaux étaient constitués de M. abscessus subsp. massiliense contenaient les ST 23 et 117. Le grand nombre de nouveaux génotype est dû au manque de données au Vietnam, il s’agit là de la première étude épidémiologique dans ce pays.En France, on retrouvait un plus grand nombre de sequence type connus (20/31), certainement dû au nombre d’études existantes dans cette région. Une majorité de M. abscessus subsp. abscessus a été retrouvé. Sept sequence type d’importance épidémiologique ont été retrouvés, dont le ST 23. Le suivi longitudinal montre que : le risque d’infection exogène est grand ; le pool de génotypes à Brest est plus important qu’à Montpellier, même si les ST persistent chez un même patient, on ne peut exclure le risque d’une infection exogène. Enfin, l’analyse VNTR des isolats des cinq centres suggère une possible transmission nosocomiale ainsi que la diffusion de génotypes en France.En conclusion, ce travail de thèse a permis d’améliorer l’approche de l’identification et du traitement des infections du complexe M. abscessus, en plus d’explorer et de comparer son épidémiologie dans deux populations différentes. Nous montrons la présence ubiquitaire de certains génotypes d’importance cliniques, une grande diversité génotypique, une variabilité du portage chez le patient mucoviscidose ainsi qu’un risque d’infections exogènes et de transmission chez cette population. / The Mycobacterium abscessus complex is a nontuberculous mycobacteria. It is an environmental opportunistic pathogen that can cause chronic lung infections, especially in patients with cystic fibrosis, and severe extra-pulmonary infections. It is also resistant to most antibiotics, and does not have an effective treatment. It is divided into three subspecies: Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense and Mycobacterium subsp. bolletii, These three subspecies have clinical and antibiotic resistance differences, Thus, a safe and rapid identification is essential. In addition, little is known about its epidemiology, particularly among patients with cystic fibrosis.First, we assessed the identification performance within the M. abscessus complex and the characterization of the main resistances of a commercial assay (Genotype NTM-DR). The kit was highly efficient, with 100% success in identifying the subspecies and also in characterizing resistance to clarithromycin and amikacin, which are the recommended antibiotics for the treatment of complex M. abscessus infection. This kit is therefore a fast and robust alternative to the main methods for identifying and characterizing resistance in the M. abscessus complex.Secondly, we tested the efficacy of two different molecules, clofazimine and tigecycline, in synergy. Synergy was demonstrated in 42% of the isolates, and the presence of clofazimine reduced the minimum inhibitory concentration of tigecycline in 52% of the isolates. This combination could be an effective and more tolerable therapeutic alternative for the patient.Finally, we carried out two epidemiological studies: in Vietnam, in patients with inflammatory lung disease, and in France, in patients with cystic fibrosis in five different hospitals. In France, longitudinal follow-up was carried out on 7 patients from two different centres, Brest and Montpellier. Two different typing tools were used: MLST and VNTR.Vietnam had a large number of new Sequence Type (ST) (29/38) and a high genotypic diversity (0.72 for 53 isolates). A majority of M. abscessus subsp. massiliense was found. In addition, STs responsible for epidemics in different countries have also been found (ST 23 and ST 117). Three clonal complexes have been identified, reflecting the great diversity of the M. abscessus complex in this country. Two of these clonal complexes were composed of M. abscessus subsp. massiliense containing ST 23 and 117. The large number of new genotypes is due to the lack of data in Vietnam, this is the first epidemiological study in this country.In France, there was a greater number of known sequence type (20/31), certainly due to the number of existing studies in this region. A majority of M. abscessus subsp. abscessus was found. Seven sequence type of epidemiological importance were found, including ST 23. Longitudinal monitoring shows a high variability of the ST in Brest compared to Montpellier, which is confirmed by the VNTR. This follow-up shows that: the risk of exogenous infection is high; the genotype pool in Brest is greater than in Montpellier, even if STs persist in the same patient, the risk of exogenous infection cannot be excluded. Finally, the VNTR analysis of isolates from the five centres suggests possible nosocomial transmission and the spread of genotypes in France.In conclusion, this thesis work has improved the approach to the identification and treatment of M. abscessus complex infections, as well as exploring and comparing its epidemiology in two different populations. We show the ubiquitous presence of certain clinically important genotypes, a high genotypic diversity, a variability in carrying in the cystic fibrosis patient as well as a risk of exogenous infections and transmission in this population

Les intégrons sont des supports génétiques bactériens de capture, d’expression et de dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques sous forme de cassettes. Ils sont majoritairement décrits chez les bactéries à Gram négatif chez qui ils confèrent généralement un phénotype de multirésistance. Les intégrons de résistance (IR) jouent un rôle majeur dans l’acquisition de la résistance dans le monde bactérien. Il existe 3 principales classes d’IR ; les IR de classe 1, les IR de classe 2 et les IR de classe 3 (IR3). Contrairement aux 2 premières classes, les IR3 représentent la classe d’intégrons de résistance la moins étudiée. Très peu de travaux s’intéressent à leur étude et on dénombre actuellement moins de 10 IR3 entièrement caractérisés. Les objectifs de ce travail de thèse étaient (i) d’effectuer une étude épidémiologique des IR3 en France et au Cameroun et (ii) d’étudier les modalités d’expression de l’intégrase et des cassettes de ces intégrons. Nos travaux ont permis d’isoler puis de décrire 3 nouveaux IR3 présents au sein de bactéries environnementales appartenant aux genres Aeromonas, Acinetobacter et Citrobacter. Les cassettes de ces IR3 codent des résistances aux bétalactamines, aminosides et ammoniums quaternaires. De plus, nous avons caractérisé des IR3 dans 3 souches de Delftia spp. (2 D.acidovorans et 1 D. tsuruhatensis) isolées en Afrique ; les cassettes de ces intégrons ne codent pas de résistance aux antibiotiques. L’axe plus fondamental de ce travail de thèse a permis de montrer que le PintI3(1) est le promoteur impliqué dans l’expression du gène intI3. De plus, nous avons montré que les variants du promoteur Pc, ainsi que les variants du promoteur PintI3(1) sont fonctionnels et de force différente. Il ressort de nos travaux que l’environnement constituerait un réservoir d’intégrons de classe 3 et que ces supports génétiques pourraient jouer un rôle important dans la dissémination de la résistance au sein de cet écosystème. / Integrons are bacterial genetic elements able to capture and express genes embedded within gene cassettes. They are widely described among Gram-negative bacteria and generally confer a multidrug resistance phenotype. Resistance integrons (RI) play an important role in the acquisition of antibiotic resistance. There are 3 main classes of RI. Class 3 RI has been poorly studied class with less than ten fully IR3 characterized. Objectives of this thesis were (i) to conduct an epidemiological study of class 3 RI in France and Cameroon and (ii) to better understand the modes of expression of the integrase and cassettes of IR3. We described 3 new class 3 RI isolated from environmental bacteria belonging to genus Aeromonas, Acinetobacter and Citrobacter. Gene cassettes encoded resistance to betalactams, aminoglycosides and quaternary ammonium compounds. We also described IR3 from three Delftia strains (2 D.acidovorans and 1 D.tsuruhatensis) in Africa containing cassettes that do not encode antibiotic resistance. The fundamental part of the work showed that the PintI3(1) promoter is involved in the expression of the intI3 gene. Furthermore, we demonstrated that variants of the Pc promoter and variants of the PintI3(1) promoter are functional with different strengths. These results showed that the environment may constitute a reservoir of class 3 integrons and that these genetic elements could play an important role in the spread of the resistance in this ecosystem.

The Pseudomonas aeruginosa VIM-4 metallo-β-lactamase is a member of the subclass B1. It belongs to the VIM-type β-lactamases encoded by genetic mobile element such as class 1 integrons. This particularity enhances the relevance of VIM type enzymes since these enzymes are now disseminated among important nosocomial strains such as Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. In consequence, the study of VIM-4 was performed to determine its kinetic parameters, its 3D structure and the dependence of its activity on Zn2+ concentration. VIM-4 has been described as an efficient enzyme able to hydrolyze all the β-lactam compounds. We observed that VIM-4 activity is dependent on the Zn2+ concentration in the buffer, with a maximal activity obtained at 50 µM. Two different forms of VIM-4 were observed by X-ray crystallography in the presence or absence of Zn2+ in the crystallogenesis buffer. The first form contains two Zn2+ and the second possesses only one Zn2+ in the histidine site. The apoenzyme form was obtained. Its study revealed that this form was poorly stable with a less structured shape. The active form is not restored even in presence of a large Zn2+ excess. In order to determine the Zn2+ stoechiometry in VIM-4, ICPMS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) experiments were performed. The results of this study indicated that the mono-zinc form of VIM-4 is favored in absence of Zn2+ ions in the buffer and the di-zinc form appears in the presence of added Zn2+ ions. The dissociation constants of the Zn2+ ions with VIM-4 enzyme were determined using benzylpenicillin. The dissociation constants of the first, the second and the third Zn2+ are respectively KD1 which is clearly below 1 µM, KD2 equal to 8.5 µM and KD3 within a range of 200 to 500 µM. A complementary titration of the free Zn2+ ions from denatured VIM-4 with a chromophore chelating agent seems to confirm this feature as only one Zn2+ could be titrated. Then with no added Zn2+, VIM-4 would be in a mono-zinc form and with a Zn2+ concentration higher than 10 µM, the di-zinc form of VIM-4 would be present. In the last decade, numerous studies have reported an increasing mortality among patients in intensive care due to multiresistant pathogens. These strains are producing at least two different classes of β-lactamases. In the eighties, a strategy of combination of β-lactamase inactivator and β-lactam antibiotics was developed against serine β-lactamases. Some of the members of this family have already developed variants resistant to these inhibitors; however this combination remains efficient. In the case of the MBLs, extensive studies have been performed to find a generic inhibitor. Unfortunately, due to the heterogeneity of this enzyme group, no solution has been found. The development of a metallo-β-lactamase inhibitor, particularly active against acquired MBLs, which are the most relevant enzymes, is thus needed. Our second purpose was the identification of new molecules that could be developed as broad spectrum MBLs inhibitors. We found a new class of compounds, mercaptophosphonates derivatives, which can be used as leads for finding generic MBL inhibitors.

L’efflux actif, qui permet aux bactéries d’exporter les antibiotiques vers le milieu extérieur est l’un des mécanismes majeurs de résistance aux antibiotiques. L’une des pompes d’efflux de Pseudomonas aeruginosa, MexA-MexB-OprM, est constituée de trois protéines : i) MexA, une protéine membranaire de fusion qui se trouve dans le périplasme ; ii) MexB qui se trouve dans la membrane interne et qui reconnaît l’antibiotique et initie son transport grâce à la force protomotrice et iii) OprM un canal qui se trouve dans la membrane externe. Durant ma thèse, j’ai mis au point un test fonctionnel pour MexA et MexB. Ce test est basé sur la coreconstitution de ces protéines avec la bactériorhodopsine, une protéine membranaire qui génère un gradient de proton après activation par la lumière. L’activité de MexB est suivie de manière indirecte via la mesure du pH. En mesurant le pH à l’intérieur des liposomes, on peut connaître l’activité de MexB puisque ce dernier utilise la force protomotrice pour transporter ses substrats. Une mesure fiable du pH peut être obtenue grâce à la pyranine dont la fluorescence varie avec le pH. Grâce à ce test, j’ai prouvé que MexB possède une activité basale qui ne dépend pas de la présence de substrat et que l’activité de MexB devient optimale quand cette dernière est reconstituée en présence de MexA. Dans un deuxième temps, j’ai mis au point un test fonctionnel pour la pompe d’efflux entière. Pour cela, je prépare deux types distincts de protéoliposomes. Dans le premier type de liposome, j’encapsule de la pyranine, (pour suivre l’activité de MexB) et un substrat de MexB qui est un agent intercalant de l’ARN. Ce substrat est faiblement fluorescent dans un environnement aqueux et fortement fluorescent lorsqu’il est intercalé dans l'ARN. MexB et MexA sont reconstitués dans ces liposomes. Dans le deuxième type de liposomes, je reconstitue OprM et j’encapsule de l’ARN. Ces deux types de liposomes sont alors mélangés. Lorsque la pompe s’assemble et qu’il y a un transport actif à travers cette dernière, deux phénomènes sont observés: la diminution de la fluorescence de la pyranine (car MexB fait entrer des protons dans le premier type de liposome pour transporter le substrat) et l’augmentation de la fluorescence du substrat car ce dernier s’intercale dans l’ARN se trouvant dans le deuxième type de liposome. En mélangeant les deux types de liposomes, j’obtiens une preuve de la reconstitution in vitro de la pompe entière et j’ai mis en évidence qu’OprM s’ouvre en présence de MexA et MexB et que sa présence augmente l’activité de MexB. / Among the various mechanisms developed by the bacteria to counter to the effect of antibiotics, active efflux is on the front line. In Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacteria, efflux transporters are organized as multicomponent systems where MexB, the pump located in the inner membrane, works in conjunction with MexA, a periplasmic protein, and OprM, an outer membrane protein. MexB is a proton motive force-dependent pump with broad substrate specificity. During my PhD, I have designed an original activity assay for MexB and MexA. The pump is coreconstituted into proteoliposomes together with bacteriorhodopsin (BR), a light-activated proton pump. In this system, upon illumination with visible light, the photo-induced proton gradient created by the BR is shown to be coupled to the active transport of substrates through the pump. The activity of MexB is monitored indirectly. Since MexB uses the protomotive force to transport antibiotics, one can determine substrate transport though MexB by monitoring the pH inside the liposomes. For that purpose, pyranine, a fluorescent probe whose fluorescence yield increases with increasing pH, is encapsulated inside the liposomes. This test makes the investigation of the pump possible. In the absence of MexA, MexB has a basal activity which is not substrate-dependent. Once MexB is reconstituted together with MexA, its activity is specific and substrate-dependent. Then I worked on the reconstitution of the whole efflux pump. For this, I prepare two different kinds of liposomes: i) Liposomes with reconstituted MexA and MexB in which pyranine and a nucleic acid intercalating agent are encapsulated, ii) Liposomes with reconstituted OprM and encapsulated RNA. The activity of MexB is monitored thanks to the addition of EthB, a substrate of MexB, that is poorly fluorescent in aqueous medium and highly fluorescent when intercalated into RNA. Upon generation of a pH gradient, I observe two concomitant phenomena: the decrease of pyranine fluorescence, as MexB is using protons to transport the substrate, and the increase of the fluorescence of the RNA intercalating agent as a result of its interaction with RNA. I have successfully assembled the efflux pump and monitored transport through it from one liposome to the other. I have demonstrated that OprM needs to interact with MexA and MexB in order to open and that MexB activity is accelerated when the pump is assembled.

La tuberculose (TB) reste parmi les 10 premières causes de décès dans le monde ; l’émergence/réémergence de la TB résistante aux antituberculeux aggrave la situation et représente un défi majeur pour l’éradication de la TB. Le Laos est entouré par des pays fortement touchés par la TB et la TB multi-résistante (MDR) et cette maladie représente une priorité en termes de santé publique dans ce pays. Il n’existe encore aucune donnée sur la structure génétique et la résistance aux antibiotiques de la population de M. tuberculosis au Laos.Dans ce contexte, ce travail avait pour but d’analyser la diversité génétique et la structure des populations de M. tuberculosis ainsi que les déterminants génétiques associés à la résistance à partir d’échantillons collectés lors de l’enquête de prévalence nationale de la Tuberculose (TBPS) 2010-2011, l’enquête de résistance aux antituberculeux (DRS) 2016-2017 et chez les cas suspects de MDR-TB au Laos (2010-2014). Plusieurs techniques d’analyses ont été utilisées, comprenant les tests de sensibilité aux médicaments (phénotypique et génotypique), le séquençage et le génotypage par spoligotypage et MIRU-VNTR. Les données ont été analysées par des méthodes statistiques et phylogénétiques.Premièrement, ce travail s’est focalisé sur la diversité des familles de M. tuberculosis circulant au Laos. Les familles EAI et Beijing (76.7% et 14.4% respectivement) ont été principalement observées dans les échantillons de TBPS, alors que la famille Beijing était plus fréquente dans les échantillons de DRS et chez les patients suspectés de MDR-TB (35% et 41% respectivement). La transmission récente était non-négligeable avec un taux de « clustering » global de 11.9%, et des taux pour Beijing de 20 % et EAI de 11 %. Deuxièmement, les résultats ont révélé des profils de résistance très diverses allant de la mono-résistance jusqu’à la pré-XDR (ultrarésistance). Les mutations associées aux profils de résistance ont montré une grande diversité, avec cependant certaines mutations majeures dans les gènes rpoB, katG, et rpsL. Le gène pncA a montré un pattern différent avec de la diversité sans mutations prééminentes. En plus des mutations détectées, des délétions et insertions de bases ont été également observées. Le séquençage a montré son utilité pour la détection de la résistance aux antibiotiques dans les trois échantillons à l’étude. Enfin, la famille Beijing, famille la plus problématique au niveau mondial en termes de résistance et de transmissibilité, a été identifiée de manière significative dans le groupe de patients <35 ans, principalement dans les provinces du Nord, dans les cas de transmissions récentes et chez les isolats très résistants. Tous ces points suggèrent un risque d’émergence de la MDR-TB accrue au Laos dû à la famille Beijing.En conclusion, cette étude permet d’avoir pour la première fois un aperçu de la structure des populations de M. tuberculosis au Laos. Les résultats soulignent le risque d’augmentation du nombre de cas infectés par la famille Beijing et donc des cas de résistance. Pour empêcher une dégradation de la situation, il est essentiel d’améliorer les stratégies pour le dépistage des résistances et de développer des tests moléculaires capables de couvrir un large nombre de mutations qui soit simple à implémenter dans les pays à ressources limités. Les résultats de ce travail serviront de base en termes de famille/sous-famille/génotype et de mutations associées à la résistance au Laos. Ces données pourront être comparées avec de futures études/analyses pour étudier l’évolution de la TB et de la TB résistante et ainsi d’évaluer l’efficacité des politiques de contrôle mises en place. La description des mutations associées aux résistances est utilisée pour créer une base de données régionale en collaboration avec le Vietnam et le Cambodge pour développer un outil de diagnostic basé sur la technologie des puces à ADN pour améliorer la détection de la résistance dans la région. / Tuberculosis (TB) is still one of the top 10 leading causes of death worldwide; the emergence/re-emergence of drug resistant TB aggravates the situation globally and challenges the prospect of ending TB by 2035. Lao PDR is surrounded by TB and MDR-TB high burden countries and TB continues to be one of the priority infection diseases in this country. The prevalence of TB in 2010 was almost twice as high than previous estimates and little is known about drug resistance. Up to now, M. tuberculosis population data regarding drug resistance and genetic structure are totally absent. In this context, we aimed to study the diversity and the structure of M. tuberculosis population and the genetic determinants associated to drug resistance using clinical samples collected from the TB prevalence survey (TBPS), 2010-2011; from the Drug resistance survey (DRS), 2016-2017 and from presumptive MDR-TB cases in Lao PDR (2010-2014). Various methods and analyses were used, including drug susceptibility testing (phenotypic and genotypic), DNA sequencing and genotyping of M. tuberculosis using spoligotyping and MIRU-VNTR. The data were analyzed by statistical and phylogenetic analyses.Firstly, this work was focused on the diversity of M. tuberculosis families circulating in Lao PDR. According to the result form TBPS, EAI and Beijing family (76.7% and 14.4% respectively) were mainly observed, while Beijing family was more observed in DRS, and presumptive MDR-TB cases (35% and 41% respectively). The level of recent transmission in Lao PDR was non-negligible with a global clustering rate of 11.9% and in Beijing and EAI of 20% and 11%, respectively. Secondly, the results demonstrated the diversity of drug resistant patterns from mono-resistance to pre-extensively drug resistance (pre-XDR). A high diversity of mutations associated with drug resistance was also observed, however common mutations were mainly found (e.g: mutations in rpoB gene, katG and rpsL). The pattern was different for pncA gene, we observed a diversity of mutations without preeminent ones. Besides the number of known and unknown mutations associated with anti-TB drug resistance, deletion and insertion of bases were also observed. The sequencing showed its usefulness for drug resistance detection. Lastly, Beijing family, which is the more problematic family in the world in terms of resistance and transmissibility, was observed on a significant manner in young age group, mainly in the northern provinces, in recent transmission cases and among highly drug resistant isolates, suggesting an increasing risk of highly drug resistance TB due to highly transmissible Beijing strains in Lao PDR.In conclusion, this study provides the first genetic insights into the M. tuberculosis population in Lao PDR. The results underline the risk of increase of Beijing and drug resistant TB in the country. In order to prevent a more serious situation in the future regarding drug resistance as observed in neighboring countries, there is an urgent need of effective strategy improvement for drug resistance screening and the development of rapid molecular tests that cover a large number of drug resistance simultaneously with a feasible implementation in the limited resource countries. The results of genotyping from our study will be the baseline of families/subfamilies/genotype of M. tuberculosis population and of the mutations associated with drug resistance in Lao PDR. These data will be compared with further study/analysis to evaluate the trend of TB and drug resistant TB in the country and to determine if the drug resistance is under control after the set-up of new policies. The data of drug resistance associated mutations are used to build a regional database in collaboration with Vietnam and Cambodia in order to develop a diagnostic tool based on DNA chip technology to improve the drug resistance detection in the region.

La bactérie à Gram-negatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales et touchant essentiellement les individus immunodéprimés. Parmi les mécanismes de résistance aux antibiotiques, leur efflux actif par un système de transport transmembranaire appelé Mex (Multi-drug Efflux pump) a pris une grande importance clinique. Ces systèmes d'efflux sont constitués d'un assemblage de trois protéines différentes : une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor), un transporteur de la famille RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et un adaptateur périplasmique de la famille MFP (Membrane Fusion Protein) assurant la cohésion du système. Le sujet de thèse porte sur l'étude structurale, essentiellement par cristallographie RX, de la pompe d'efflux MexXY-OprM qui présente la particularité d'être spécifique aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un problème de santé publique majeur, touchant plus particulièrement les enfants dans les pays en développement (PED).Nous avons effectué une revue systématique de la littérature pour quantifier le niveau de résistance aux antibiotiques chez les enfants âgés de moins de 2 ans dans les PED. De manière générale, les données sur la résistance aux antibiotiques dans la population étudiées sont rares. Selon les publications identifiées, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, et Klebsiella spp. apparaissent comme les causes les plus fréquentes d’infections néonatales sévères. Chez les enfants âgés de 1 à 24 mois, Streptococcus pneumoniae et Salmonella spp. apparaissent comme les causes les plus fréquentes d’infections bactériennes invasives.Dans une seconde revue systématique, nous avons examiné les méthodologies actuelles utilisées pour mesurer la consommation d’antibiotiques dans les PED.Nos résultats montrent qu’aucunes des méthodologiesne permet, à elle seule, de répondre aux besoins de ces pays en terme de données.Nous avons conduit une enquête en population à Madagascar et au Sénégal afin d’examiner les modalités de consommation d’antibiotiques chez des enfants de moins de 2 ans. Dans les 2 pays, la plupart des antibiotiques étaient achetés en pharmacie sur présentation d’une ordonnance. Une proportion élevée des antibiotiques était utilisée pour le traitement d’infections probablement d’origine virale. Des facteurs tels que la disponibilité de centres de santé, de pharmacies, l’existence de programmes de remboursement ou encore la formation du personnel pourraient influencer la fréquence de consommations d’antibiotiques au niveau national.Les résultats issus de ces travaux de recherche ajoutent des données essentielles à la littérature existante et mettent en évidence des leçons importantes pour la lutte contre la résistance aux antibiotiques dans les PEDs. / Antimicrobial resistance is a growing threat across the world and is likely to disproportionately affect children in low-income countries (LICs).To estimate the burden of antibiotic resistance in the community among children under two in LICs we undertook a review of published literature. Common isolates in neonatal sepsis cases included Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Klebsiella. Among children 1 mo. to 2 yrs., Streptococcus pneumonia and Salmonella were most often reported. Information on antibiotic resistance was sparse and often relied on few isolates.We reviewed methods to measure antibiotic consumption in LICs from published literature and showed that current techniques used in isolation are insufficient to respond to all the data needs in LICs. Integrating study techniques and starting with community surveys may respond more adequately to this issue in LICs and lead to more actionable results.To investigate patterns of antibiotic consumption and related factors among children under two in Madagascar and Senegal we undertook community surveys in two sites in Madagasgar (Antananarvo and Moramanga) and one site in Senegal. Results showed relatively high levels of antibiotic use among children. The majority of antibiotics were purchased in pharmacies with a prescription in both countries. Data suggest a high proportion of use for likely viral infections. Local contexts including the availability of health care facilities, availability of pharmacies, national payment schemes, and provider training seemed to play a role in country usage rates.Results from this work add essential data to the literature where relatively little data exists and reveal important lessons about studying and combating antibiotic resistance in LICs.