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Philosophiae Doctor - PhD / Listeria monocytogenes has been established as a food-borne pathogen since the early 1980s and has become a big concern for the food industry and Public Health authorities (Doyle 2001; Oliveira et al. 2003; Capita et al. 2005; Conly and Johnston 2008). It is a Gram-positive, opportunistic facultative intracellular bacterium which is frequently present in nature and may be found in any food environment (Liu 2006; Chen et al. 2007; Conly and Johnston 2008). Of the six species of Listeria, L. monocytogenes is the only one capable of causing listeriosis, a severe food-borne illness in humans (de Vasconcelos et al. 2008). For the average healthy person, although the incidence of infection is low, symptoms of febrile gastroenteritis may be presented (Gianfranceschi et al. 2007; Kersting et al. 2010). In immunocompromised individuals however, the hospitalization and mortality rates are amongst the highest for pathogenic organisms (Tran and Kathariou 2002; Lin et al. 2006; Schuppler and Loessner 2010). Illnesses such as septicaemia and central nervous system infections may also occur in these individuals (Roberts et al. 2006; Schuppler and Loessner 2010). Pregnant women and their fetus are also largely at risk where pre-term delivery and birth defects may occur as a result of listeriosis (Doyle 2001; Garrido et al. 2008). The epidemiological surveillance systems for the reporting of listeriosis are poor as it is a non-notifiable disease in many countries. Therefore, the incidence of infection that is regarded as low must be reconsidered (Mammina et al. 2009; Pinto et al. 2010). Listeria monocytogenes can reproduce in a wide variety of reservoirs within food processing plants, thereby contaminating the food which then poses a risk for food-borne illness. It can be transmitted from infected animals to humans and also through the consumption of foods from animal origin (Kalender 2003; Kersting et al. 2010). Animals are infected by Listeria spp. found in the environment; the organism is then transmitted through the blood, milk and excrement of the animal back into the environment where manure, soil, feed and water can become contaminated again (Akpolat et al. 2004; Kersting et al. 2010). Poultry products and ready-to-eat (RTE) food that support the growth of L. monocytogenes, including soft cheeses, unpasteurized milk, hotdogs, deli meats, vegetables and fruits have been linked to cases of listeriosis (Rørvik et al. 2003; Chen et al. 2007; Conly and Johnston 2008; Ford 2010; Kersting et al. 2010). Regardless of HACCP systems that are in place in the food processing plants, listeriosis outbreaks still occur as a result of the ingestion of these food products. Serotyping, based on the serological reaction between somatic (O) and flagellar (H) antigens and their corresponding sera, has identified 13 L. monocytogenes serotypes (Nadon et al. 2001; Wiedmann 2002; Kérouanton et al. 2010). Of the 13 serotypes of L. monocytogenes, 1/2a, 1/2b and 4b are responsible for more than 95% of listeriosis infections in humans (Mereghetti et al. 2002; Moorhead et al. 2003; Borucki et al. 2004;de Vasconcelos et al. 2008). L. monocytogenes serotypes 1/2a and 1/2b are mainly associated and isolated sporadically from food and 4b is responsible for the major human epidemic cases (Gilbreth et al. 2005). L. monocytogenes serotypes 1/2a and 1/2b are also responsible for sporadic cases of human illness (Wiedmann 2002). / South Africa

O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de isolados de Listeria monocytogenes em formar biofilmes em superfícies inertes, bem como sua resistência a agentes sanitizantes. Foram utilizados 37 isolados provenientes de ambiente de laticínios, amostras de queijos e salmoura, pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos (LMMA) do Departamento de Engenharia de Alimentos da FZEA/USP. Dos 37 isolados avaliados, 67,6% eram pertencentes ao sorotipo 4b. Três isolados de L. monocytogenes foram obtidos de salmoura, 5 foram obtidos de caixas plásticas, 1 de queijo Prato, 1 da mão de manipulador de embalagens, e 27 foram isolados de superfícies sem contato com alimentos (piso da sala de pasteurização, piso da câmara fria, ralo da câmara fria ou estrado da câmara fria). Os isolados de L. monocytogenes apresentaram maior capacidade de produzir biofilme nos ensaios com cupons de aço inox (43,2% dos isolados), seguido dos ensaios em microplaca de poliestireno (16,2%), cupons de borracha (13,5%) e discos de silicone (2,7%). As células de L. monocytogenes aderidas nas superfícies do aço inox foram visualizadas sob microscopia eletrônica de varredura após 48 horas de incubação a 37ºC. Dezenove isolados de L.monocytogenes, os quais produziram biofilmes nos ensaios com aço inox, borracha ou silicone, foram testados para determinação da eficiência de sanitizantes pelo método de concentração inibitória mínima (CIM), utilizando-se ácido peracético (2%), cloreto de banzalcônio (1%), digluconato de clorexidina (2%), hipoclorito de sódio (2%) e tintura de iodo (2%). Os isolados de L. monocytogenes analisados apresentaram resistência a ácido peracético, hipoclorito de sódio e tintura de iodo, cujos valores de CIM foram 3,12%, 6,25% e 6,25%, respectivamente. Nenhum isolado apresentou resistência a cloreto de benzalcônio e digluconato de clorexidina, os quais foram eficientes para inibição de isolados de L. monocytogenes provenientes de amostras de queijos e ambientes de laticínios. A L. monocytogenes apresenta capacidade de persistir em ambiente de laticínios sob a forma de biofilme em várias superfícies inertes como aço inox, borracha e silicone, o que pode representar uma fonte permanente de contaminação para produtos e processos de obtenção de leite e derivados. / The objective of the present study was to evaluate the ability of isolates of Listeria monocytogenes to form biofilms and their resistance to sanitizers. Thirty seven strains belonging to the collection of the Laboratory of Microbiology and Food Mycotoxicology (LMMA), Department of Food Engineering of FZEA / USP, were used. Of the 37 isolates, 67.6% belonged to serotype 4b. Three isolates of L. monocytogenes were obtained from brine, 5 were obtained from plastic boxes, one of Prato cheese, one from the packaging handler\'s hand, and 27 were isolated from non-food contact surfaces (pasteurization room floor, the floor of the cold room, the drain cold or pallet from the cold chamber). The isolates of L. monocytogenes showed greater ability to produce biofilm in the assays with stainless steel coupons (43.2% of isolates), followed by polystyrene micro plate (16.2%), rubber coupons (13.5%) and silicone disks (2.7%) assays. Cells of L. monocytogenes attached to stainless steel surfaces were viewed under scanning electron microscopy after 48 hours incubation at 37°C. Nineteen strains of L. monocytogenes, which were considered biofilms producers in the assays with stainless steel, rubber or silicone, have been tested to evaluate the efficiency of the sanitizing method by means of the minimum inhibitory concentration (MIC), using peracetic acid (2%), sodium chloride benzalkonium (1%), chlorhexidine digluconate (2%), sodium hypochlorite (2%) and iodine solution (2%). The isolates of L. monocytogenes analyzed showed resistance to peracetic acid, sodium hypochlorite and iodine tincture, with MIC values of 3.12%, 6.25% and 6.25%, respectively. No isolate showed resistance to benzalkonium chloride and chlorhexidine digluconate, which were effective for inhibiting the isolates of L. monocytogenes from samples of cheeses and dairy environments. In conclusion, L. monocytogenes has the ability to persist in the environment of dairy products by forming biofilms in several inert surfaces such as stainless steel, rubber and silicone, which may represent a continuing source of contamination to manufacture processes of dairy products.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de isolados de Listeria monocytogenes em formar biofilmes em superfícies inertes, bem como sua resistência a agentes sanitizantes. Foram utilizados 37 isolados provenientes de ambiente de laticínios, amostras de queijos e salmoura, pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos (LMMA) do Departamento de Engenharia de Alimentos da FZEA/USP. Dos 37 isolados avaliados, 67,6% eram pertencentes ao sorotipo 4b. Três isolados de L. monocytogenes foram obtidos de salmoura, 5 foram obtidos de caixas plásticas, 1 de queijo Prato, 1 da mão de manipulador de embalagens, e 27 foram isolados de superfícies sem contato com alimentos (piso da sala de pasteurização, piso da câmara fria, ralo da câmara fria ou estrado da câmara fria). Os isolados de L. monocytogenes apresentaram maior capacidade de produzir biofilme nos ensaios com cupons de aço inox (43,2% dos isolados), seguido dos ensaios em microplaca de poliestireno (16,2%), cupons de borracha (13,5%) e discos de silicone (2,7%). As células de L. monocytogenes aderidas nas superfícies do aço inox foram visualizadas sob microscopia eletrônica de varredura após 48 horas de incubação a 37ºC. Dezenove isolados de L.monocytogenes, os quais produziram biofilmes nos ensaios com aço inox, borracha ou silicone, foram testados para determinação da eficiência de sanitizantes pelo método de concentração inibitória mínima (CIM), utilizando-se ácido peracético (2%), cloreto de banzalcônio (1%), digluconato de clorexidina (2%), hipoclorito de sódio (2%) e tintura de iodo (2%). Os isolados de L. monocytogenes analisados apresentaram resistência a ácido peracético, hipoclorito de sódio e tintura de iodo, cujos valores de CIM foram 3,12%, 6,25% e 6,25%, respectivamente. Nenhum isolado apresentou resistência a cloreto de benzalcônio e digluconato de clorexidina, os quais foram eficientes para inibição de isolados de L. monocytogenes provenientes de amostras de queijos e ambientes de laticínios. A L. monocytogenes apresenta capacidade de persistir em ambiente de laticínios sob a forma de biofilme em várias superfícies inertes como aço inox, borracha e silicone, o que pode representar uma fonte permanente de contaminação para produtos e processos de obtenção de leite e derivados. / The objective of the present study was to evaluate the ability of isolates of Listeria monocytogenes to form biofilms and their resistance to sanitizers. Thirty seven strains belonging to the collection of the Laboratory of Microbiology and Food Mycotoxicology (LMMA), Department of Food Engineering of FZEA / USP, were used. Of the 37 isolates, 67.6% belonged to serotype 4b. Three isolates of L. monocytogenes were obtained from brine, 5 were obtained from plastic boxes, one of Prato cheese, one from the packaging handler\'s hand, and 27 were isolated from non-food contact surfaces (pasteurization room floor, the floor of the cold room, the drain cold or pallet from the cold chamber). The isolates of L. monocytogenes showed greater ability to produce biofilm in the assays with stainless steel coupons (43.2% of isolates), followed by polystyrene micro plate (16.2%), rubber coupons (13.5%) and silicone disks (2.7%) assays. Cells of L. monocytogenes attached to stainless steel surfaces were viewed under scanning electron microscopy after 48 hours incubation at 37°C. Nineteen strains of L. monocytogenes, which were considered biofilms producers in the assays with stainless steel, rubber or silicone, have been tested to evaluate the efficiency of the sanitizing method by means of the minimum inhibitory concentration (MIC), using peracetic acid (2%), sodium chloride benzalkonium (1%), chlorhexidine digluconate (2%), sodium hypochlorite (2%) and iodine solution (2%). The isolates of L. monocytogenes analyzed showed resistance to peracetic acid, sodium hypochlorite and iodine tincture, with MIC values of 3.12%, 6.25% and 6.25%, respectively. No isolate showed resistance to benzalkonium chloride and chlorhexidine digluconate, which were effective for inhibiting the isolates of L. monocytogenes from samples of cheeses and dairy environments. In conclusion, L. monocytogenes has the ability to persist in the environment of dairy products by forming biofilms in several inert surfaces such as stainless steel, rubber and silicone, which may represent a continuing source of contamination to manufacture processes of dairy products.

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries naturellement immunisées contre leurs propres bactériocines. Ce travail a permis l’identification de nombreuses souches productrices de peptides antimicrobiens. Ces derniers ont été extraits et purifiés par différentes techniques chromatographiques, puis identifiés et caractérisés par la mesure de leurs masses et par l’analyse de leurs structures (approche protéomique et séquençage d’Edman). Parmi les résultats obtenus, il y a :- la mise en évidence d’une nouvelle bactériocine (maltaricin CPN), appartenant à la classe IIa, isolée et identifiée chez Carnobacterium maltaromaticum ;- l’identification de trois nouvelles espèces productrices de pédiocine PA-1 ;- l’isolement de souches productrices de bactériocines multiples (appartenant à différentes classes) ;- la mise en évidence pour certaines bactériocines d’une forte activité antimicrobienne in vitro (spectres d’activité incluant des pathogènes).Les travaux se poursuivent avec l’application de deux souches productrices de bactériocines dans du lait fermenté (Lben) en vue de lutter contre L. monocytogenes.Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries naturellement immunisées contre leurs propres bactériocines. Ce travail a permis l’identification de nombreuses souches productrices de peptides antimicrobiens. Ces derniers ont été extraits et purifiés par différentes techniques chromatographiques, puis identifiés et caractérisés par la mesure de leurs masses et par l’analyse de leurs structures (approche protéomique et séquençage d’Edman). Parmi les résultats obtenus, il y a :- la mise en évidence d’une nouvelle bactériocine (maltaricin CPN), appartenant à la classe IIa, isolée et identifiée chez Carnobacterium maltaromaticum ;- l’identification de trois nouvelles espèces productrices de pédiocine PA-1 ;- l’isolement de souches productrices de bactériocines multiples (appartenant à différentes classes) ;- la mise en évidence pour certaines bactériocines d’une forte activité antimicrobienne in vitro (spectres d’activité incluant des pathogènes).Les travaux se poursuivent avec l’application de deux souches productrices de bactériocines dans du lait fermenté (Lben) en vue de lutter contre L. monocytogenes. / Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by bacteria naturally immunized against their own bacteriocins. This work has allowed the identification of several strains which produce antimicrobial peptides. These have been purified using different chromatographic techniques. Then, they have been identified and characterized by the measurement of their mass and by the analysis of their structure (proteomic approach/ Edman sequencing). Among the obtained results, there was:- the discovery of a new bacteriocin (maltaricin CPN) produced by C. maltaromaticum and belonging to the class IIa ;- the identification of three new pediocin PA-1 producing species;- the isolation of bacterial strains wich produce multiple bacteriocins belonging to several classes ;- the in vitro determination of a strong antimicrobial activity(affecting pathogens) with some bacteriocins.This work is still underway with the application of two bacteriocin producing strains in fermented milk (Lben) in order to tackle L. monocytogenes.

Introdução - A bactéria Listeria monocytogenes é um agente zoonótico transmitido, principalmente, por alimentos. Dentre as fontes de contaminação, destacam-se os produtos de origem láctea, carnes e embutidos, além dos ambientes da indústria de processamento alimentício. Na última década, foram detectadas cepas de L. monocytogenes e L. innocua, em ambiente de frigoríficos e alimento. Estas apresentavam variação na intensidade da virulência para células eucarióticas decorrente de mutações nos genes de virulência. Esta alteração em ambas as espécies, e o relato de um caso fatal de listeriose humana ocasionada por L. innocua atípica demandam atenção, pois apresentam maior risco à saúde da população exposta a estes ambientes e alimentos tornando-se, portanto, uma importante questão de saúde pública. Objetivo - Pesquisar genes de virulência em cepas de L. monocytogenes e L. innocua, isoladas em pontos da linha de abate suíno e do comércio de carne no Estado de São Paulo. Material e Métodos Foram estudadas 40 cepas, dentre estas, isolados de L. monocytogenes e L. innocua com atividade hemolítica atípica. Foram realizados testes de atividade hemolítica e produção de fosfolipase A para caracterização dos isolados. A detecção dos genes de virulência foi realizada através da reação em cadeia pela polimerase (PCR). Para confirmação das sequências amplificadas e a análise das mesmas, os fragmentos obtidos foram sequenciados. A identificação molecular das espécies foi realizada por análise filogenética dos genes prs e 16S rRNA. Resultados Dos 40 isolados, cinco de L. monocytogenes e sete de L. innocua apresentaram atividade hemolítica atípica, sendo que nestes últimos também foi observado halo atípico no meio ALOA. As cepas de L. monocytogenes foram positivas para a detecção de todos os genes de virulência estudados. Dois dos isolados atípicos de L. innocua também foram positivos para todos os genes e os outros cinco foram positivos para hly, plcA e inlC. Foram detectadas mutações nas proteínas InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC e PrfA, nas cepas atípicas, que resultaram em alterações nas suas estruturas secundárias que podem explicar o fenótipo desses isolados. A confirmação de espécie apenas foi alcançada com a análise filogenética do 16S rRNA. Conclusões A partir desses resultados, foi proposta a utilização dos genes prfA, plcB e inlB, como forma de triagem, para diferenciar as espécies L. monocytogenes e L. innocua, de modo a complementar os testes fenotípicos / Introduction - The bacterium Listeria monocytogenes is a zoonotic agent transmitted, mainly, by food. Among the sources of contamination, stands out dairy products, meat and the environments of food processing industry. In the last decade, strains of L. monocytogenes and L. innocua have been detected in food and slaughterhouses environment. These presented variation in the intensity of virulence to eukaryotic cells due to mutations in the virulence genes. These changes in both species, and the report of a fatal case of human listeriosis caused by atypical L. innocua demand attention, because they present greater risk to the health of the population exposed to these environments and food and, therefore, it is an important public health issue. Objective - To search for the virulence genes in strains of L. monocytogenes and L. innocua isolated in points of swine slaughter line and meat trade in Sao Paulo State. Material and Methods 40 strains were studied, among these, isolates of L. monocytogenes and L. innocua with atypical hemolytic activity. Tests of hemolytic activity and production of phospholipase A were performed for isolates characterization. The detection of virulence genes was performed through polymerase chain reaction (PCR). For confirmation of the amplified sequences and analysis of the same, the obtained fragments were sequenced. The molecular identification of species was performed by phylogenetic analysis of 16S rRNA and prs genes. Results - Of the 40 isolates, five L. monocytogenes and seven L. innocua showed atypical hemolytic activity, and in these last ones an atypical halo was also observed in ALOA medium. The L. monocytogenes strains were positive for detection of all virulence genes studied. Two atypical L. innocua isolates were also positive for all genes and the other five were positive for hly, plcA and inlC. Mutations in InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC and PrfA proteins were detected, in the atypical strains, which resulted in changes in their secondary structures that may explain the isolates phenotype. Species confirmation was achieved only with phylogenetic analysis of 16S rRNA. Conclusions - From these results, it was proposed the use of prfA, plcB and inlB genes as a way of screening, to differentiate the species L. monocytogenes and L. innocua, in order to complement the phenotypic tests

Introdução - A bactéria Listeria monocytogenes é um agente zoonótico transmitido, principalmente, por alimentos. Dentre as fontes de contaminação, destacam-se os produtos de origem láctea, carnes e embutidos, além dos ambientes da indústria de processamento alimentício. Na última década, foram detectadas cepas de L. monocytogenes e L. innocua, em ambiente de frigoríficos e alimento. Estas apresentavam variação na intensidade da virulência para células eucarióticas decorrente de mutações nos genes de virulência. Esta alteração em ambas as espécies, e o relato de um caso fatal de listeriose humana ocasionada por L. innocua atípica demandam atenção, pois apresentam maior risco à saúde da população exposta a estes ambientes e alimentos tornando-se, portanto, uma importante questão de saúde pública. Objetivo - Pesquisar genes de virulência em cepas de L. monocytogenes e L. innocua, isoladas em pontos da linha de abate suíno e do comércio de carne no Estado de São Paulo. Material e Métodos Foram estudadas 40 cepas, dentre estas, isolados de L. monocytogenes e L. innocua com atividade hemolítica atípica. Foram realizados testes de atividade hemolítica e produção de fosfolipase A para caracterização dos isolados. A detecção dos genes de virulência foi realizada através da reação em cadeia pela polimerase (PCR). Para confirmação das sequências amplificadas e a análise das mesmas, os fragmentos obtidos foram sequenciados. A identificação molecular das espécies foi realizada por análise filogenética dos genes prs e 16S rRNA. Resultados Dos 40 isolados, cinco de L. monocytogenes e sete de L. innocua apresentaram atividade hemolítica atípica, sendo que nestes últimos também foi observado halo atípico no meio ALOA. As cepas de L. monocytogenes foram positivas para a detecção de todos os genes de virulência estudados. Dois dos isolados atípicos de L. innocua também foram positivos para todos os genes e os outros cinco foram positivos para hly, plcA e inlC. Foram detectadas mutações nas proteínas InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC e PrfA, nas cepas atípicas, que resultaram em alterações nas suas estruturas secundárias que podem explicar o fenótipo desses isolados. A confirmação de espécie apenas foi alcançada com a análise filogenética do 16S rRNA. Conclusões A partir desses resultados, foi proposta a utilização dos genes prfA, plcB e inlB, como forma de triagem, para diferenciar as espécies L. monocytogenes e L. innocua, de modo a complementar os testes fenotípicos / Introduction - The bacterium Listeria monocytogenes is a zoonotic agent transmitted, mainly, by food. Among the sources of contamination, stands out dairy products, meat and the environments of food processing industry. In the last decade, strains of L. monocytogenes and L. innocua have been detected in food and slaughterhouses environment. These presented variation in the intensity of virulence to eukaryotic cells due to mutations in the virulence genes. These changes in both species, and the report of a fatal case of human listeriosis caused by atypical L. innocua demand attention, because they present greater risk to the health of the population exposed to these environments and food and, therefore, it is an important public health issue. Objective - To search for the virulence genes in strains of L. monocytogenes and L. innocua isolated in points of swine slaughter line and meat trade in Sao Paulo State. Material and Methods 40 strains were studied, among these, isolates of L. monocytogenes and L. innocua with atypical hemolytic activity. Tests of hemolytic activity and production of phospholipase A were performed for isolates characterization. The detection of virulence genes was performed through polymerase chain reaction (PCR). For confirmation of the amplified sequences and analysis of the same, the obtained fragments were sequenced. The molecular identification of species was performed by phylogenetic analysis of 16S rRNA and prs genes. Results - Of the 40 isolates, five L. monocytogenes and seven L. innocua showed atypical hemolytic activity, and in these last ones an atypical halo was also observed in ALOA medium. The L. monocytogenes strains were positive for detection of all virulence genes studied. Two atypical L. innocua isolates were also positive for all genes and the other five were positive for hly, plcA and inlC. Mutations in InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC and PrfA proteins were detected, in the atypical strains, which resulted in changes in their secondary structures that may explain the isolates phenotype. Species confirmation was achieved only with phylogenetic analysis of 16S rRNA. Conclusions - From these results, it was proposed the use of prfA, plcB and inlB genes as a way of screening, to differentiate the species L. monocytogenes and L. innocua, in order to complement the phenotypic tests

O controle bacteriano na indústria alimentícia é de extrema importância uma vez que os microrganismos são responsáveis por causar contaminações persistentes, levando à deterioração do alimento e à transmissão de doenças. Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do biossurfatante ramnolipídeo (RL) e de óleoresinas (OR) de aipo, noz moscada, alho, gengibre, pracaxi, patauá e buriti frente as bactérias patogênicas alimentares Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). O OR de aipo foi avaliado individualmente e em combinação com o RL. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de microdiluição em caldo - concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). Biofilmes de L. monocytogenes e B. cereus foram formados em placas de microtitulação de poliestireno, respectivamente, nos meios de cultivo triptona de soja com extrato de levedura (TSYE) e caldo nutriente (CN) à 37ºC por 48 h e avaliados através da quantificação da biomassa e viabilidade celular após tratamento com os antimicrobianos. O RL apresentou efeito bacteriostático com CIM 125 &#956g/mL frente a L. monocytogenes e para B. cereus observou-se ação bactericida com CBM de 31,25 &#956g/mL. A triagem preliminar mostrou que, dentro da faixa das concentrações testadas, os óleos de buriti, pracaxi, patauá, alho e gengibre não apresentaram CIM frente aos patógenos. O OR de aipo inibiu o crescimento de L. monocytogenes e B. cereus com CIM de 3% e 0,75%, respectivamente. A combinação de 125 &#956g/mL de RL e 3% de óleo de aipo foi bacteriostática para L. monocytogenes, enquanto para B. cereus a combinação dos agentes foi bacteriostática com menor valor de CIM (7,81 &#956g/mL de RL e 0,19% de OR de aipo), sugerindo efeito sinérgico. A linhagem de Escherichia coli (EHEC) foi resistente aos agentes nas concentrações testadas. O RL removeu 70,7% dos biofilmes de L. monocytogenes após 24 h de tratamento, entretanto a redução da viabilidade celular foi maior após 2 h de contato com RL inibindo 66,6%. O OR de Aipo (6%) foi capaz de reduzir 57,1% da viabilidade celular após 24 h de tratamento, já a combinação do RL com OR de aipo foi eficaz em todos os tempos de tratamentos, com redução média de 49,5% de células viáveis do biofilme de L. monocytogenes. Para o biofilme de B. cereus o melhor tratamento (13h) com RL (31,25 &#956g/mL) removeu 71,5% do biofilme, enquanto que a combinação com o OR de aipo (15,62 &#956g/mL + 0,38%) foi capaz de remover 79,5% da biomassa. O RL (62,50 &#956g/ mL) mostrou inibição média de 85,4% da viabilidade celular de biofilme de B. cereus. O melhor tratamento com OR de aipo (1,50%) reduziu a viabilidade celular de B. cereus em 51,2%, após 2 h; e quando combinado com RL (15,62 &#956g/ mL + 0,38%) em 71,8%. RL e OR de aipo mostraram ação antimicrobiana frente a células planctônicas e sésseis de L. monocytogenes e B. cereus, sugerindo potencial para desenvolvimento de novas formulações naturais visando o controle destes patógenos alimentares. / Bacterial control in the food industry is very important once many microorganisms are responsible for causing persistent contamination, leading to food deterioration and disease transmission. Research and development of natural antimicrobial agents is a trend of the market that has been gaining increasing interest. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial potential of the rhamnolipid biosurfactant (RL) and celery oleoresin (OR) against food pathogens Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Escherichia coli enterohemorrhagic (EHEC) both in planktonic and in biofilms forms. Celery OR was evaluated individually and in combination with RL. Antimicrobial activity was determined by the broth microdilution method and expressed as minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). Biofilms of L. monocytogenes and B. cereus were formed in polystyrene microtiter plates, respectively, in tryptone yeast extract (TSYE) and nutrient broth (NB) media at 37°C for 48 h. Biofilms were evaluated by quantification of biomass and cell viability after treatment with antimicrobials. RL presented bacteriostatic effect showing MIC of 125 &#956g/mL against L. monocytogenes and a bactericidal effect at 31.25 &#956g/mL against B. cereus. Preliminary screening showed that, within the range of tested concentrations, buriti, pracaxi, patauá, garlic and ginger oils did not show minimal inhibitory concentration against pathogens. Celery OR inhibited the growth of L. monocytogenes and B. cereus at MIC of 3% and 0.75%, respectively. The combination of 125 &#956g/mL RL and 3% celery oil was bacteriostatic for L. monocytogenes, while for B. cereus the combination effect was also bacteriostatic at a lower MIC (7.81 &#956g/mL RL and 0.19% celery OR), suggesting synergistic effect. Escherichia coli strain (EHEC) was resistant to all agents at the concentration tested. The biofilms of L. monocytogenes were removed by 70.7% after 24 h of treatment using RL (250 &#956g/mL), however, at shorter time (2 h) were more effective in reducing cell viability, showing an inhibition of 66,6%. Celery OR (6%) was able to reduce 57.1% of cell viability after 24 h of treatment, and the combination of RL and celery OR was effective at all treatment times, with a mean reduction of 49.5% of viable L. monocytogenes biofilm cells. Biofilms of B. cereus treated with RL (31.25 &#956g/ml) for 13 h were removed in 71.5%, while the combination of RL with celery OR (15.62 &#956g/mL + 0.38%) was able to remove 79.5%. The RL (62.50 &#956g/mL) reduced B. cereus biofilm viability by a mean of 85.4%. Treatment with celery OR (1.50%) reduced the cell viability of B. cereus in 51.2% after 2h and when combined with RL (15.62 &#956g/ mL + 0.38%) in 71.8%. The RL and celery OR showed antimicrobial activity against planktonic and sessile cells of L. monocytogenes and B. cereus suggesting potential to development of new natural formulations to control these food pathogens.

Este estudo avaliou a eficiência da oleuropeína (OLE) (composto fenólico extraído das folhas de Oliveira) isolada e associada aos sanitizantes comerciais ácido peracético 2% (APA), hipoclorito de sódio 2% (HS), peróxido de hidrogênio 3% (PH), digluconato de clorexidina 2% (DC), cloreto de benzalcônio 1% (CB) e iodofor 2% (IO), para inativação de células em suspensão e biofilmes monoespécie e multiespécie formados em superfícies de aço inoxidável ou microplaca de poliestireno por Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), todas classificadas como fortes produtores de biofilmes. Os isolados foram semeados em caldo TSB (caldo tripticase soja), incubados (37°C/24h) e corrigidos a ~108células/mL (escala 0,5 McFarland). Para bactérias em suspensão, a resistência a sanitizantes foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) em tubos e pelo método de Disco Difusão em Ágar (DDA), no qual as bactérias foram plaqueadas em ágar TSA contendo discos de 6mm de papel filtro embebidos nos sanitizantes. Após a incubação, a medição dos halos de inibição foi feita com paquímetro. Para os ensaios de resistência dos biofilmes aos compostos sanitizantes, foram utilizadas microplacas de poliestireno 96 poços, as quais foram preparadas para incubação-fixação dos biofilmes e submetidas à leitura em espectrofotômetro de ELISA (600 nm). Em seguida, as placas foram lavadas com solução salina tamponada (PBS, pH 7.4) e os sanitizantes inseridos por 1 minuto. Após neutralização com tiossulfato de sódio (5 minutos), as placas foram lavadas com PBS e metanol, coradas com cristal violeta 1% e coradas com ácido acético glacial (33%) para nova leitura a 570nm. A eficácia da remoção do biofilme pelos sanitizantes foi comparada pelo índice de formação de biofilme (IFB). As imagens do aço inoxidável após tratamento com sanitizante foram feitas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal, para visualizar a persistência dos biofilmes. Os valores de CIM (diluição 1:2) mostraram que OLE não teve atividade bactericida. No método DDA, L. monocytogenes, foi resistente à OLE, enquanto E. coli e S. aureus apresentaram resistência intermediária. Os sanitizantes comerciais apresentaram boa atividade bactericida nos ensaios de CIM e DDA, sendo que as associações de OLE aos sanitizantes comerciais aumentaram o efeito germicida. Nos ensaios com biofilmes em monoespécie, somente os sanitizantes comerciais, isolados ou associados com OLE, foram eficazes de reduzir o valor de BFI em microplaca de poliestireno. Em biofilmes multiespécie, OLE apresentou efeito antimicrobiano, sobretudo sobre a associação de L. monocytogenes + E. coli + S. aureus (redução: 91,49%). Nenhum dos compostos avaliados foi capaz de inativar completamente os biofilmes nas superfícies de aço inoxidável, uma vez que células viáveis foram observadas após os tratamentos com os sanitizantes, indicando persistência dos biofilmes. Os resultados indicam que a oleuropeína apresentou potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de biofilmes em superfícies inertes, sendo necessários estudos para compreender os mecanismos de ação dessas combinações. / This study evaluated the efficiency of oleuropein (OLE) (a phenolic compound extracted from Oliveira leaves) alone or in association with commercial sanitizers peracetic acid 2% (PPA), sodium hypochlorite 2% (SH), hydrogen peroxide 3% (HP), chlorhexidine digluconate 2% (CD), benzalkonium chloride 1% (BC) and iodophor 2% (IO), for inactivation of suspended cells and monospecies or multispecies biofilms formed on stainless steel surfaces or microplate polystyrene by Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922), all classified as strong producers of biofilms. The isolates were grown in TSB (trypticase soy broth), incubated (37°C/24 h) and adjusted to ~108 cells/mL (0.5 McFarland scale). For the bacterial suspensions, resistance to sanitizers was determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in tubes and by Agar Disk Diffusion (ADD), in which the bacteria were plated on TSA agar containing 6mm disks of filter paper soaked in sanitizers. After incubation, measurement of the inhibition halos was done using a caliper rule. For the sanitizer resistance assays with biofilms, polystyrene 96-well microplates were prepared for incubation-fixing of biofilms and read in an ELISA spectrophotometer (600 nm). After, the plates were washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) and the sanitizers were placed for 1 minute. After neutralization with sodium thiosulfate (5 minutes), the plates were washed with PBS and methanol, stained with 1% crystal violet and stained with glacial acetic acid (33%) for a new reading at 570 nm. The effectiveness of biofilm removal by each sanitizer was compared using a Biofilm Formation Index (IFB). The images from stainless steel coupons after treatments with sanitizers were obtained by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Confocal Microscopy, to view the persistence of biofilms. MIC values (dilution 1: 2) showed that OLE had no bactericidal activity. In the ADD assays, L. monocytogenes was resistant to OLE, while E. coli and S. aureus showed intermediate resistance. Commercial sanitizers showed good bactericidal activity in both CIM and DDA assays, and the associations of OLE with commercial sanitizers increased their germicidal effect. In the monospecies biofilm assays, only commercial sanitizers, isolated or associated with OLE, were effective for reducing the BFI values in polystyrene microplates. In multispecies biofilms, OLE had an antimicrobial effect, especially on the association of L. monocytogenes + E. coli and S. aureus (reduction: 91.49%). None of the compounds evaluated was able to completely inactivate the biofilms on the stainless steel surfaces, since viable cells of bacteria were observed after treatment with sanitizers, indicating persistence of biofilms. The results indicate that oleuropein has the potential to enhance the bactericidal effect of commercial sanitizers to eliminate biofilms on inert surfaces. Further studies are needed to understand the mechanisms of action of these combinations.