Autorius: Aušra Lozoraitytė Tema: Listeria monocytogenes padermių, išskirtų iš mažmeninėje rinkoje parduodamų žuvų produktų, identifikavimas ir serotipavimas molekuliniais tyrimo metodais Darbo vadovas: prof. dr. Artūras Stimbirys Atlikimo vieta: Darbas 2012-2014 metais atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje. Darbo dydis: 52 puslapiai, 10 lentelių, 17 paveikslų. Darbo tikslas: palyginti Listeria monocytogenes identifikavimui naudotus standartinį ir molekulinį metodus. Atlikto darbo tyrimų objektas yra Listeria monocytogenes, kuri buvo išskiriama iš mažmeninėje rinkoje parduodamų šaltai rūkytų žuvų (lašišų) produktų. Tyrimai atlikti tarpusavyje derinant standartinius mikroorganizmų kultivavimo metodus ir molekulinius DNR analizės metodus. Tyrimų metu buvo ištirta 160 šaltai rūkytų žuvų produktų, t. y. lašišų papilvės, lašišų gabalėliai, lašišų file ir lašišų nugarėlės. Tyrimo metu nustatyta, kad šaltai rūkytų žuvų užkrėstumas listerijomis priklauso nuo produkto rūšies. Šaltai rūkytų lašišų papilvėse užkrėstumas listerijomis yra 7,5 karto didesnis nei lašišų nugarėlėse (p<0,05), 1,8 karto nei lašišų gabalėliuose (p<0,05) ir 30 kartų didesnis nei lašišų file (p<0,05). Mikrobiologinių tyrimų metu nustatyta, kad 32,5 % (p<0,05) žuvų produktų mėginių buvo užkrėsti L. monocytogenes, o atlikus dauginę PGR nustatyta, kad L. monocytogenes buvo užkrėsti 23,13 % mėginių (p<0,01). Tai įrodo, kad molekuliniai tyrimo... [toliau žr. visą tekstą] / Author: Ausra Lozoraityte Subject: The molecular research methods in the identification and serotyping of Listeria monocytogenes strains in fish products in retail Supervisor of the work: prof. dr. Arturas Stimbirys Location: The study was conducted in the Food Safety and Quality Department of Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences, in 2012-2014. Scope of the work: 52 pages, 10 tables, 17 figures. The aim of the work: Identification of the Listeria monocytogenes by comparing molecular and standard methods. The study object is Listeria monocytogenes, which is found in the cold smoked fish (salmon) products, sold in the retail market. The study has been carried out combining standard micro-culture cultivation and molecular DNA analysis methods. 160 cold-smoked fish products, i. e. underbellies of the salmon, salmon pieces, salmon fillet and backs of the salmon was investigated during in the study. Also it was found that contamination of the cold smoked fish products with listeria depends on the type of the product. Contamination with listeria in the underbellies of the salmon is 7.5 times higher, than in the backs of the salmon (p<0.05), 1.8 times higher, than in the pieces of salmon (p<0.05) and 30 times higher, than in the salmon fillet (p<0.05). Microbiological researches showed that 32.5 % (p<0.05) of the fish products samples were infected with L. monocytogenes, and after the multiplex PCR was found that 23.13 % of samples (p<0.01) were... [to full text]

Tyrimo tikslas – nustatyti įvairių cheminių medžiagų įtaką Listeria monocytogenes bakterijoms mėsos (jautienos) žaliavoje. Mėsos žaliava (jautiena) buvo perkama įvairiose mėsos ir jos produktų prekybos vietose. Tyrimų laboratorijoje buvo ištirtas Listeria monocytogenes bakterijų atsparumas įvairioms cheminėms medžiagoms: pieno rūgščiai, acto rūgščiai, cinamaldehidui, chloro dioksidui. Buvo naudotos įvairios šių medžiagų koncentracijos: pieno rūgšties – 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, acto rūgšties – 2 %, 3 %, 5 %, cinamaldehido - 0,5 %, 1,5 %, 3 %, chloro dioksido – 5 ppm ir 15 ppm. Atsparumas buvo vertintas užkrečiant žalią jautieną. Taip pat buvo nustatytas šių cheminių medžiagų poveikis bendram mikroorganizmų skaičiui. Atlikus tyrimą nustatyta, kad iš visų tyrime naudotų cheminių medžiagų didžiausią neigiamą poveikį Listeria monocytogenes ir BMS augimui daro pieno rūgštis, nes per 48 valandas L. monocytogenes skaičius sumažėjo 129 kartus, o bendras mikroorganizmų skaičius – 22,6 karto (p<0,05). Lyginant naudotų cheminių medžiagų poveikį nustatyta, kad pieno rūgštis ir chloro dioksidas stipresnį neigiamą poveikį darė L. monocytogenes bakterijoms, o cinamaldehidas ir acto rūgštis – bendram mikroorganizmų skaičiui. / The goal of the research is to determine the influence of various chemicals on Listeria monocytogenes bacteria in raw meat (beef). Raw meat was purchased in various markets of meat and meat products. The resistance of Listeria monocytogenes to various chemicals like lactic acid, acetic acid, cinnamaldehyde, chlorine dioxide was tested in the laboratory. These chemicals were used in various concentrations: lactic acid – 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, acetic acid – 2 %, 3 %, 5 %, cinnamaldehyde – 0,5 %, 1,5 %, 3 %, chlorine dioxide – 5 ppm and 15 ppm. Resistance was evaluated by infecting raw beef. The effects of these chemicals to the total number of microorganisms was also determined. The research revealed that the most influencing chemical from the ones tested was lactic acid. Within 48 hours the amount of L. monocytogenes decreased 129 times and the total number of microorganisms decreased 22,6 times (p<0,05). While comparing the effects of the chemicals used in the research it was determined, that lactic acid and chlorine dioxide has a stronger negative impact on the growth of L. monocytogenes bacteria and cinnamaldehyde and acetic acid has a bigger influence on the total number of microorganisms.

Este estudo avaliou a eficiência da oleuropeína (OLE) (composto fenólico extraído das folhas de Oliveira) isolada e associada aos sanitizantes comerciais ácido peracético 2% (APA), hipoclorito de sódio 2% (HS), peróxido de hidrogênio 3% (PH), digluconato de clorexidina 2% (DC), cloreto de benzalcônio 1% (CB) e iodofor 2% (IO), para inativação de células em suspensão e biofilmes monoespécie e multiespécie formados em superfícies de aço inoxidável ou microplaca de poliestireno por Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), todas classificadas como fortes produtores de biofilmes. Os isolados foram semeados em caldo TSB (caldo tripticase soja), incubados (37°C/24h) e corrigidos a ~108células/mL (escala 0,5 McFarland). Para bactérias em suspensão, a resistência a sanitizantes foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) em tubos e pelo método de Disco Difusão em Ágar (DDA), no qual as bactérias foram plaqueadas em ágar TSA contendo discos de 6mm de papel filtro embebidos nos sanitizantes. Após a incubação, a medição dos halos de inibição foi feita com paquímetro. Para os ensaios de resistência dos biofilmes aos compostos sanitizantes, foram utilizadas microplacas de poliestireno 96 poços, as quais foram preparadas para incubação-fixação dos biofilmes e submetidas à leitura em espectrofotômetro de ELISA (600 nm). Em seguida, as placas foram lavadas com solução salina tamponada (PBS, pH 7.4) e os sanitizantes inseridos por 1 minuto. Após neutralização com tiossulfato de sódio (5 minutos), as placas foram lavadas com PBS e metanol, coradas com cristal violeta 1% e coradas com ácido acético glacial (33%) para nova leitura a 570nm. A eficácia da remoção do biofilme pelos sanitizantes foi comparada pelo índice de formação de biofilme (IFB). As imagens do aço inoxidável após tratamento com sanitizante foram feitas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal, para visualizar a persistência dos biofilmes. Os valores de CIM (diluição 1:2) mostraram que OLE não teve atividade bactericida. No método DDA, L. monocytogenes, foi resistente à OLE, enquanto E. coli e S. aureus apresentaram resistência intermediária. Os sanitizantes comerciais apresentaram boa atividade bactericida nos ensaios de CIM e DDA, sendo que as associações de OLE aos sanitizantes comerciais aumentaram o efeito germicida. Nos ensaios com biofilmes em monoespécie, somente os sanitizantes comerciais, isolados ou associados com OLE, foram eficazes de reduzir o valor de BFI em microplaca de poliestireno. Em biofilmes multiespécie, OLE apresentou efeito antimicrobiano, sobretudo sobre a associação de L. monocytogenes + E. coli + S. aureus (redução: 91,49%). Nenhum dos compostos avaliados foi capaz de inativar completamente os biofilmes nas superfícies de aço inoxidável, uma vez que células viáveis foram observadas após os tratamentos com os sanitizantes, indicando persistência dos biofilmes. Os resultados indicam que a oleuropeína apresentou potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de biofilmes em superfícies inertes, sendo necessários estudos para compreender os mecanismos de ação dessas combinações. / This study evaluated the efficiency of oleuropein (OLE) (a phenolic compound extracted from Oliveira leaves) alone or in association with commercial sanitizers peracetic acid 2% (PPA), sodium hypochlorite 2% (SH), hydrogen peroxide 3% (HP), chlorhexidine digluconate 2% (CD), benzalkonium chloride 1% (BC) and iodophor 2% (IO), for inactivation of suspended cells and monospecies or multispecies biofilms formed on stainless steel surfaces or microplate polystyrene by Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922), all classified as strong producers of biofilms. The isolates were grown in TSB (trypticase soy broth), incubated (37°C/24 h) and adjusted to ~108 cells/mL (0.5 McFarland scale). For the bacterial suspensions, resistance to sanitizers was determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in tubes and by Agar Disk Diffusion (ADD), in which the bacteria were plated on TSA agar containing 6mm disks of filter paper soaked in sanitizers. After incubation, measurement of the inhibition halos was done using a caliper rule. For the sanitizer resistance assays with biofilms, polystyrene 96-well microplates were prepared for incubation-fixing of biofilms and read in an ELISA spectrophotometer (600 nm). After, the plates were washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) and the sanitizers were placed for 1 minute. After neutralization with sodium thiosulfate (5 minutes), the plates were washed with PBS and methanol, stained with 1% crystal violet and stained with glacial acetic acid (33%) for a new reading at 570 nm. The effectiveness of biofilm removal by each sanitizer was compared using a Biofilm Formation Index (IFB). The images from stainless steel coupons after treatments with sanitizers were obtained by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Confocal Microscopy, to view the persistence of biofilms. MIC values (dilution 1: 2) showed that OLE had no bactericidal activity. In the ADD assays, L. monocytogenes was resistant to OLE, while E. coli and S. aureus showed intermediate resistance. Commercial sanitizers showed good bactericidal activity in both CIM and DDA assays, and the associations of OLE with commercial sanitizers increased their germicidal effect. In the monospecies biofilm assays, only commercial sanitizers, isolated or associated with OLE, were effective for reducing the BFI values in polystyrene microplates. In multispecies biofilms, OLE had an antimicrobial effect, especially on the association of L. monocytogenes + E. coli and S. aureus (reduction: 91.49%). None of the compounds evaluated was able to completely inactivate the biofilms on the stainless steel surfaces, since viable cells of bacteria were observed after treatment with sanitizers, indicating persistence of biofilms. The results indicate that oleuropein has the potential to enhance the bactericidal effect of commercial sanitizers to eliminate biofilms on inert surfaces. Further studies are needed to understand the mechanisms of action of these combinations.

O controle bacteriano na indústria alimentícia é de extrema importância uma vez que os microrganismos são responsáveis por causar contaminações persistentes, levando à deterioração do alimento e à transmissão de doenças. Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do biossurfatante ramnolipídeo (RL) e de óleoresinas (OR) de aipo, noz moscada, alho, gengibre, pracaxi, patauá e buriti frente as bactérias patogênicas alimentares Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). O OR de aipo foi avaliado individualmente e em combinação com o RL. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de microdiluição em caldo - concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). Biofilmes de L. monocytogenes e B. cereus foram formados em placas de microtitulação de poliestireno, respectivamente, nos meios de cultivo triptona de soja com extrato de levedura (TSYE) e caldo nutriente (CN) à 37ºC por 48 h e avaliados através da quantificação da biomassa e viabilidade celular após tratamento com os antimicrobianos. O RL apresentou efeito bacteriostático com CIM 125 &#956g/mL frente a L. monocytogenes e para B. cereus observou-se ação bactericida com CBM de 31,25 &#956g/mL. A triagem preliminar mostrou que, dentro da faixa das concentrações testadas, os óleos de buriti, pracaxi, patauá, alho e gengibre não apresentaram CIM frente aos patógenos. O OR de aipo inibiu o crescimento de L. monocytogenes e B. cereus com CIM de 3% e 0,75%, respectivamente. A combinação de 125 &#956g/mL de RL e 3% de óleo de aipo foi bacteriostática para L. monocytogenes, enquanto para B. cereus a combinação dos agentes foi bacteriostática com menor valor de CIM (7,81 &#956g/mL de RL e 0,19% de OR de aipo), sugerindo efeito sinérgico. A linhagem de Escherichia coli (EHEC) foi resistente aos agentes nas concentrações testadas. O RL removeu 70,7% dos biofilmes de L. monocytogenes após 24 h de tratamento, entretanto a redução da viabilidade celular foi maior após 2 h de contato com RL inibindo 66,6%. O OR de Aipo (6%) foi capaz de reduzir 57,1% da viabilidade celular após 24 h de tratamento, já a combinação do RL com OR de aipo foi eficaz em todos os tempos de tratamentos, com redução média de 49,5% de células viáveis do biofilme de L. monocytogenes. Para o biofilme de B. cereus o melhor tratamento (13h) com RL (31,25 &#956g/mL) removeu 71,5% do biofilme, enquanto que a combinação com o OR de aipo (15,62 &#956g/mL + 0,38%) foi capaz de remover 79,5% da biomassa. O RL (62,50 &#956g/ mL) mostrou inibição média de 85,4% da viabilidade celular de biofilme de B. cereus. O melhor tratamento com OR de aipo (1,50%) reduziu a viabilidade celular de B. cereus em 51,2%, após 2 h; e quando combinado com RL (15,62 &#956g/ mL + 0,38%) em 71,8%. RL e OR de aipo mostraram ação antimicrobiana frente a células planctônicas e sésseis de L. monocytogenes e B. cereus, sugerindo potencial para desenvolvimento de novas formulações naturais visando o controle destes patógenos alimentares. / Bacterial control in the food industry is very important once many microorganisms are responsible for causing persistent contamination, leading to food deterioration and disease transmission. Research and development of natural antimicrobial agents is a trend of the market that has been gaining increasing interest. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial potential of the rhamnolipid biosurfactant (RL) and celery oleoresin (OR) against food pathogens Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Escherichia coli enterohemorrhagic (EHEC) both in planktonic and in biofilms forms. Celery OR was evaluated individually and in combination with RL. Antimicrobial activity was determined by the broth microdilution method and expressed as minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). Biofilms of L. monocytogenes and B. cereus were formed in polystyrene microtiter plates, respectively, in tryptone yeast extract (TSYE) and nutrient broth (NB) media at 37°C for 48 h. Biofilms were evaluated by quantification of biomass and cell viability after treatment with antimicrobials. RL presented bacteriostatic effect showing MIC of 125 &#956g/mL against L. monocytogenes and a bactericidal effect at 31.25 &#956g/mL against B. cereus. Preliminary screening showed that, within the range of tested concentrations, buriti, pracaxi, patauá, garlic and ginger oils did not show minimal inhibitory concentration against pathogens. Celery OR inhibited the growth of L. monocytogenes and B. cereus at MIC of 3% and 0.75%, respectively. The combination of 125 &#956g/mL RL and 3% celery oil was bacteriostatic for L. monocytogenes, while for B. cereus the combination effect was also bacteriostatic at a lower MIC (7.81 &#956g/mL RL and 0.19% celery OR), suggesting synergistic effect. Escherichia coli strain (EHEC) was resistant to all agents at the concentration tested. The biofilms of L. monocytogenes were removed by 70.7% after 24 h of treatment using RL (250 &#956g/mL), however, at shorter time (2 h) were more effective in reducing cell viability, showing an inhibition of 66,6%. Celery OR (6%) was able to reduce 57.1% of cell viability after 24 h of treatment, and the combination of RL and celery OR was effective at all treatment times, with a mean reduction of 49.5% of viable L. monocytogenes biofilm cells. Biofilms of B. cereus treated with RL (31.25 &#956g/ml) for 13 h were removed in 71.5%, while the combination of RL with celery OR (15.62 &#956g/mL + 0.38%) was able to remove 79.5%. The RL (62.50 &#956g/mL) reduced B. cereus biofilm viability by a mean of 85.4%. Treatment with celery OR (1.50%) reduced the cell viability of B. cereus in 51.2% after 2h and when combined with RL (15.62 &#956g/ mL + 0.38%) in 71.8%. The RL and celery OR showed antimicrobial activity against planktonic and sessile cells of L. monocytogenes and B. cereus suggesting potential to development of new natural formulations to control these food pathogens.

Listeria monocytogenes é uma bactéria transmitida principalmente via alimentos, podendo causar infecções graves em pessoas imunodeprimidas e durante a gestação, devido à sua capacidade de sobreviver intracelularmente. A formação de biofilmes por L. monocytogenes é um fator preocupante para as indústrias de alimentos, pois biofilmes comprometem a sanitização de superfícies, aumentando os riscos de contaminação. Além disso, alguns estudos indicam que a capacidade de formação de biofilme pode estar correlacionada com a capacidade de algumas bactérias causarem doença. O controle de L. monocytogenes representa um desafio, especialmente em alimentos refrigerados e prontos para o consumo, pois esta bactéria é de natureza psicrotrófica, ubíqua e adapta-se rapidamente a diferentes condições ambientais, por meio da modulação da expressão de seus genes. O efeito das condições ambientais na expressão de genes de virulência de L. monocytogenes não é totalmente compreendido. Neste trabalho, isolados de L. monocytogenes de diversas origens foram avaliados quanto à sua capacidade de formar biofilmes, de aderir/invadir em células eucarióticas e também de expressar o gene internalina (int A), que está relacionado com o potencial de virulência. A presença de bacteriocinas de bactérias láticas (BAL) e incubação a 5°C foram os principais fatores que influenciaram a formação de biofilmes por L. monocytogenes, em comparação com caldo BHI (controle). Em geral, a adesão/invasão de células Caco-2 foram significativamente menores em pH baixo (4,5), incubação a 5°C e na presença de 0,3% Oxgall (sais biliares). Entretanto, dois isolados de L. monocytogenes (INCQS 353 e Reg 26c) apresentaram aumento nas taxas de invasão quando cultivados na presença de NaCl a 5% (P<0,05). Um isolado de L. monocytogenes (H-2) obtido de hortaliças apresentou a maior capacidade de formação de biofilme e de invadir células Caco-2, sugerindo que há uma possível relação entre a formação de biofilme e de potencial de virulência. No ensaio para avaliação da expresão do gene inlA, todos os isolados foram regulados negativamente pela presença de bacteriocinas, Oxgall 0,3%, pH 4,5 e incubação a 5°C. No entanto, para um isolado de L. monocytogenes (HU 471), a expressão do gene int A foi oito vezes maior na presença de sacarose, indicando que os componentes de alimentos podem aumentar a virulência e o potencial de infecção de L. monocytogenes. / Listeria monocytogenes is a bacterium transmitted mainly by foods and can cause serious infections in immunocompromised individuals and in pregnant woman due to their ability to survive intracellularly. The biofilm formation by L. monocytogenes is a concern for the food industry because microorganism in biofilms may survive after treatment with sanitizers and increases the risk of food contamination. In addition, some studies indicate that the ability of biofilm formation can be correlated with virulence potential. The control of L. monocytogenes is a challenge, especially in chilled and ready to eat foods since it has psychrotrophic nature, it is ubiquitous and can adapt quickly to different environmental conditions by modulating the expression of its genes.The effect of environmental conditions on gene expression and virulence of Listeria monocytogenes is not fully understood. In this report, L. monocytogenes isolates from diverse sources were evaluated for their ability to form biofilms, for adhesion/invasion of eukaryotic cells and also for differential expression of internalin A gene (int A), which is related to virulence potential. The presence of bacteriocins of latic acid bacteria (BAL) and incubation at 5°C were the main factors that influenced biofilm formation by L. monocytogenes, in comparison with BHI broth (control). In general, adhesion and invasion of Caco-2 cells were significantly lower in low pH (4.5), incubation at 5°C and in presence of Oxgall 0.3% (bile salts). On the other hand, two L. monocytogenes isolates (INCQS 353 and Reg 26c) showed higher invasion rates when cultivated in the presence of NaCl 5% (P<0.05). One L. monocytogenes (H-2) isolated from minimally processed leafy vegetables showed the strongest ability to form biofilm and to invade Caco-2 cells, under selected conditions, suggesting there may be a relationship between biofilm formation and virulence potential. For the vast majority of isolates, expression of int A gene were down regulated by the presence of bacteriocins, Oxgall 0.3%, pH4.5 and incubation at 5°C. Nonetheless, for one L. monocytogenes isolate (HU 471) expression of int A gene was eight times higher in presence of sucrose, indicating that food components can increase the infectiveness of L. monocytogenes.

Listeria monocytogenes é uma bactéria transmitida principalmente via alimentos, podendo causar infecções graves em pessoas imunodeprimidas e durante a gestação, devido à sua capacidade de sobreviver intracelularmente. A formação de biofilmes por L. monocytogenes é um fator preocupante para as indústrias de alimentos, pois biofilmes comprometem a sanitização de superfícies, aumentando os riscos de contaminação. Além disso, alguns estudos indicam que a capacidade de formação de biofilme pode estar correlacionada com a capacidade de algumas bactérias causarem doença. O controle de L. monocytogenes representa um desafio, especialmente em alimentos refrigerados e prontos para o consumo, pois esta bactéria é de natureza psicrotrófica, ubíqua e adapta-se rapidamente a diferentes condições ambientais, por meio da modulação da expressão de seus genes. O efeito das condições ambientais na expressão de genes de virulência de L. monocytogenes não é totalmente compreendido. Neste trabalho, isolados de L. monocytogenes de diversas origens foram avaliados quanto à sua capacidade de formar biofilmes, de aderir/invadir em células eucarióticas e também de expressar o gene internalina (int A), que está relacionado com o potencial de virulência. A presença de bacteriocinas de bactérias láticas (BAL) e incubação a 5°C foram os principais fatores que influenciaram a formação de biofilmes por L. monocytogenes, em comparação com caldo BHI (controle). Em geral, a adesão/invasão de células Caco-2 foram significativamente menores em pH baixo (4,5), incubação a 5°C e na presença de 0,3% Oxgall (sais biliares). Entretanto, dois isolados de L. monocytogenes (INCQS 353 e Reg 26c) apresentaram aumento nas taxas de invasão quando cultivados na presença de NaCl a 5% (P<0,05). Um isolado de L. monocytogenes (H-2) obtido de hortaliças apresentou a maior capacidade de formação de biofilme e de invadir células Caco-2, sugerindo que há uma possível relação entre a formação de biofilme e de potencial de virulência. No ensaio para avaliação da expresão do gene inlA, todos os isolados foram regulados negativamente pela presença de bacteriocinas, Oxgall 0,3%, pH 4,5 e incubação a 5°C. No entanto, para um isolado de L. monocytogenes (HU 471), a expressão do gene int A foi oito vezes maior na presença de sacarose, indicando que os componentes de alimentos podem aumentar a virulência e o potencial de infecção de L. monocytogenes. / Listeria monocytogenes is a bacterium transmitted mainly by foods and can cause serious infections in immunocompromised individuals and in pregnant woman due to their ability to survive intracellularly. The biofilm formation by L. monocytogenes is a concern for the food industry because microorganism in biofilms may survive after treatment with sanitizers and increases the risk of food contamination. In addition, some studies indicate that the ability of biofilm formation can be correlated with virulence potential. The control of L. monocytogenes is a challenge, especially in chilled and ready to eat foods since it has psychrotrophic nature, it is ubiquitous and can adapt quickly to different environmental conditions by modulating the expression of its genes.The effect of environmental conditions on gene expression and virulence of Listeria monocytogenes is not fully understood. In this report, L. monocytogenes isolates from diverse sources were evaluated for their ability to form biofilms, for adhesion/invasion of eukaryotic cells and also for differential expression of internalin A gene (int A), which is related to virulence potential. The presence of bacteriocins of latic acid bacteria (BAL) and incubation at 5°C were the main factors that influenced biofilm formation by L. monocytogenes, in comparison with BHI broth (control). In general, adhesion and invasion of Caco-2 cells were significantly lower in low pH (4.5), incubation at 5°C and in presence of Oxgall 0.3% (bile salts). On the other hand, two L. monocytogenes isolates (INCQS 353 and Reg 26c) showed higher invasion rates when cultivated in the presence of NaCl 5% (P<0.05). One L. monocytogenes (H-2) isolated from minimally processed leafy vegetables showed the strongest ability to form biofilm and to invade Caco-2 cells, under selected conditions, suggesting there may be a relationship between biofilm formation and virulence potential. For the vast majority of isolates, expression of int A gene were down regulated by the presence of bacteriocins, Oxgall 0.3%, pH4.5 and incubation at 5°C. Nonetheless, for one L. monocytogenes isolate (HU 471) expression of int A gene was eight times higher in presence of sucrose, indicating that food components can increase the infectiveness of L. monocytogenes.

The present work examines the antimicrobial efficacy of the essential oils of thyme, oregano and carvacrol against L. monocytogenes biofilms produced on stainless steel coupons and for control of L. monocytogenes growth on raw catfish fillets stored at 4°C for 10 days. At 0.5%, all three essential oils were highly effective in completely eliminating L. monocytogenes cells from stainless coupons within 24 h as compared to the untreated control yielding ~7 log CFU/cm2 L. monocytogenes. When catfish inoculated with L. monocytogenes were dipped for 30 min at 4°C in essential oil solutions of thyme and oregano at 1%, 2% and 5%, there were no significant reductions in L. monocytogenes counts on the fresh catfish fillets as compared to untreated control. For the same conditions, treatment with 2% carvacrol resulted in a complete reduction of 4 log CFU/g of L. monocytogenes counts from fresh catfish fillets.

Current trends indicate that American consumers are increasingly selecting products that they believe to be environmentally friendly or "natural." In the kitchen, this trend has been expressed through greater desire for using alternative or "green" sanitizers instead of bleach or other common chemical sanitizers. The purpose of this work was to evaluate the effectiveness of one suggested alternative, tea tree oil, as a food contact surface sanitizer. Three foodborne bacterial pathogens (Listeria monocytogenes N3-031 serotype 1/2a, Escherichia coli O157:H7 strain E009, and Salmonella Typhimurium ATCC 14028) were applied separately onto three different food contact surfaces (high density polyethylene, glass, and Formica® laminate). Tea tree oil (TTO), borax, and vinegar (5% acetic acid) were applied individually as well as in combination for a total of seven treatment solutions. In addition, household bleach (6.15% sodium hypochlorite), sterile reverse osmosis (RO) water, and no applied treatment were used as controls. Treatments were tested using an adaptation of the Environmental Protection Agency DIS/TSS-10 test method, whereby each contaminated surface was treated with 100 µl of test solution and held for 1 min followed by submersion in neutralizing buffer and microbiological plating. Samples (0.1 ml) were plated onto TSA and incubated at 35°C for 48 h prior to colony counting. Bleach reduced microbial populations significantly with greater than 5-log reduction reported for all surfaces (Formica® laminate, glass, and HDPE), against E. coli O157:H7, L. monocytogenes, and S. Typhimurium. TTO produced reductions between four and five logs for E. coli O157:H7, L. monocytogenes, and S. Typhimurium and was not statistically different from the vinegar treatment (P>0.05). All combination recipes, including the borax treatment, failed to produce reductions in microbial populations at levels considered to be appropriate for food contact surface sanitizers. Surface type did not play a significant role in the effectiveness of the treatment (P>0.05). Although TTO and vinegar did reduce pathogen populations on surfaces, reductions were not sufficient enough to be considered an equally effective alternative to household bleach. / Master of Science in Life Sciences

Listeria monocytogenes é o agente causal da listeriose, uma doença que pode atingir mulheres grávidas (e seus fetos), crianças, idosos e indivíduos com o sistema imunológico comprometido, A listeriose representa a maioria dos casos de morte decorrente de toxinfecções alimentares. Os alimentos são reconhecidos como fontes primárias da transmissão desta bactéria para o homem e L. monocytogenes já foi isolada de uma grande variedade de alimentos. Superfícies de equipamentos utilizados na produção de alimentos também podem estar contaminadas com este patógeno. Falhas em procedimentos de higienização podem deixar resíduos nos equipamentos de processamento de alimentos e L. monocytogenes pode se aderir a superfícies abióticas e iniciar sua multiplicação, dando origem a biofilmes. A interação com bactérias de outras espécies pode influenciar na forma formação de biofilmes por L. monocytogenes, constituindo um aspecto importante de estudo para auxiliar no controle da contaminação de alimentos por esta bactéria. Leuconostoc mesenteroides é uma bactéria lática normalmente encontrada em alimentos e algumas cepas podem interferir na multiplicação de L. monocytogenes pela produção de bacteriocinas com atividade antilisterial. Os biofilmes representam uma preocupação para indústria de alimentos, pois geralmente os microorganismos aderidos apresentam maior capacidade de resistir a tratamentos antimicrobianos. Neste trabalho, foram coletadas 30 amostras de presunto cozido fatiado, 30 de mussarela fatiada e 30 de superfícies de equipamentos de fatiar alimentos, em estabelecimentos do comércio varejista de Ribeirão Preto SP. As amostras forma avaliadas quanto à presença ou ausência de L. monocytogenes e também foi estudada a capacidade dos isolados em formar biofilmes em cultura pura e em testes de co-cultura. O sanitizante ácido peracético e a bacteriocina nisina foram testados para controlar a formação de biofilme por L. monocytogenes. Os resultados obtidos mostram que os isolados de L. monocytogenes formaram biofilme em superfície de aço inoxidável quando cultivados isoladamente ou em testes de co-cultura com L.mesenteroides. O tratamento da lâmina com ácido peracético inativou todas as células presentes no biofilme. Nas condições utilizadas, nisina não apresentou atividade contra L.monocytogenes em biofilmes. / Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis, an infection that targets mainly pregnant women (and their fetuses), children, the elderly and immunocompromised individuals. Listeriosis represents the majority of fatal cases of foodborne diseases. Foods are recognized as primary sources of transmission of this bacterium to man and L. monocytogenes has been isolated from of a great variety of foods. Surfaces of equipments used in the production of foods can harbour L. monocytogenes. Failures in sanitization procedures can leave food residues adhered to equipments of food processing and L. monocytogenes can attach to abiotic surfaces, multiply and form biofilms. Interactions among bacteria of diverse species may influence biofilm formation by L. monocytogenes and this is an important issue to be studied to improve food safety. Leuconostoc mesenteroides is a lactic bacterium usually found in foods and some strains can interfere with the multiplication of L. monocytogenes by production of bacteriocins with antilisterial activity. Biofilms represent a special concern to the food industry, because adhered microorganism are generally more resistant to antimicrobial treatments. In this work, we collected 30 samples of sliced cooked ham, 30 of sliced mozzarella cheese and 30 of surfaces of food processing equipments, in the retail market of the city of Ribeirão Preto - SP. The samples were studied for presence or absence of L. monocytogenes. The ability of the isolates to form biofilms was also studied, in pure and in co-culture tests. The sanitizer peracetic acid and the bacteriocin nisin were tested to control biofilm formation by L. monocytogenes. L. monocytogenes formed biofilm on stainless steel coupons when cultivated alone or in co-culture with L. mesenteroides. The treatment of stainless steel coupons with peracetic acid inactivated the cells of the biofilm. Under the experimental conditions tested nisin did not present activity against L. monocytogenes in biofilms.

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Entretanto, na infecção por Listeria monocytogenes indivíduos esplenectomizados são capazes de controlar melhor a progressão da infecção em comparação a indivíduos que possuem o baço intacto. Neste trabalho avaliamos o efeito da esplenectomia e do transplante autógeno de baço na capacidade de camundongos BALB/c de controlarem a infecção por L. monocytogenes e E. coli. Nós avaliamos a infecção através da técnica de CFU de bactérias no fígado. O IFN- foi avaliado por ELISA em amostras de fígado e baço, e o óxido nítrico através do método de Griess. Nossos resultados confirmam que animais esplenectomizados (SP) apresentam menor número de L. monocytogenes e maior número de E. coli no fígado (P<0.05) em comparação aos animais controle não esplenectomizados (CT). Os animais que receberam o transplante autógeno de baço no retroperitônio (RP) ou no grande omento (GO) apresentaram uma contagem de bactérias no fígado semelhante à do grupo CT nas duas infecções. Animais SP infectados por E. coli ou L. monocytogenes apresentaram maior produção de IFN- e óxido nítrico no fígado em comparação aos outros grupos estudados. Na infecção com L. monocytogenes camundongos SP tiveram maior acúmulo de células mononucleares no fígado, enquanto na infecção com E. coli foram observadas áreas de necrose tecidual no fígado, porém menor número de células inflamatórias, assim como baixos níveis de IgM no soro em comparação com os animais CT, RP e GO. Esses resultados sugerem que na infecção com E. coli a imunidade humoral tenha uma participação importante no controle da infecção. A produção de IFN por células esplênicas, em ambas infecções, foi semelhante nos grupos transplantados em relação ao grupo CT, sugerindo que os fragmentos implantados se comportam de forma semelhante ao órgão original. A realização do transplante autógeno de baço é capaz de reverter o efeito da esplenectomia em ambas infecções estudadas, independente do sítio de implante utilizado. / The splenectomy is a common proceeding in cases of abdominal traumas. In these cases the autogenous transplant of the spleen is the only alternative that preserves the functions of this organ. It has been reported that the incident of sepse for E. coli is larger in splenectomized animals. Meantime, in the infection by L. monocytogenes splenectomized individuals are better able to control the progression of the infection in comparison to individuals who have the spleen intact. In this work we evaluated the effect of splenectomy and of the autogenous transplant of the spleen on the capacity of BALB/c mice to control the infection by L. monocytogenes and E. coli. We evaluated the infection through the technique of bacteria CFU in the liver. The IFN- in liver and spleen was evaluated by ELISA, and the nitric oxide by the Griess method. Our results confirm that splenectomized animals (SP) present a lower number (P <0.05) of L. monocytogenes and larger number (P <0.05) of E. coli in the liver in comparison to the unsplenectomized control animals (CT). The animals that received the autogenous transplant of the spleen in the retroperitoneum (RP) or in the greater omentum (GO) showed a bacteria count in the liver similar to the CT group for both infections. SP animals infected by L. monocytogenes or E. coli presented a greater production of IFN- and NO in the liver in comparison to other groups studied. In the infection with L. monocytogenes SP mice had more accumulation of mononuclear cells in the liver, while in the infection with E. coli areas of tecidual necrosis were observed in the liver, although having a lower number of inflammatory cells, as well as low levels of IgM in the serum in comparison with the CT, RP, or GO groups. These results suggest that in the infection with E. coli the humoral immunity has an important function in the control of the infection. The production of IFNby splenic cells in both infections was similar in the transplanted groups in comparison to that in the CT group, suggesting that the fragments introduced behave in a way similar to the original organ. The realization of the autogenous transplant of spleen is able to reverse the effect of the splenectomy in the two infections studied, independent of the site used for the implantation.